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酸度对细胞电化学行为的影响①

更新时间:2009-03-28

细胞电化学是生物电分析化学的一个重要分支,它以细胞作为直接的电化学研究对象,通过电化学信号的变化反映有机体在细胞水平上的运动规律、探索其相关的生理活动、揭示生命活动的奥妙,近年来在细胞活性分析、疾病诊治以及药物筛选、毒理学评价等方面受到广泛关注[1~8]。在细胞电化学的检测中使用从细胞中直接提取的物质进行研究可以降低检测分析的难度和成本,武冬梅课题组通过对细胞破碎处理,直接检测到细胞质的两个电化学信号,分别为0.7V左右的黄嘌呤和鸟嘌呤氧化峰以及1.1 V左右的次黄嘌呤和腺嘌呤氧化峰[9~13]。然而检测时酸度的设定,对检测到的电信号有重要的影响,本文对细胞电化学检测时的酸度做了研究,为细胞电化学信号的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人乳腺癌细胞MCF-7(中国科学院上海细胞库);DMEM培养基(Gibco公司);优级胎牛血清 (Gibco公司);双抗(链霉素和青霉素);多壁碳纳米管(MWNTs) (深圳纳米港有限公司);离子液体(bmim-PF6) (J&K Chemical Ltd.);黄嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤(Sigma公司),除特殊说明外,所有试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与处理

人乳腺癌(MCF-7)细胞按常规培养于含10%胎牛血清、双抗各1×105U/L的DMEM培养液中,于37℃恒温、5% CO2、100%饱和湿度培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)中培养。

低开放性消费者注重实践,喜欢秩序。因此在为低开放性消费者设计化妆产品时,应注重实用性的原则。产品的组合方面,品牌应推出较多的基本款以及经典款。同时,营销人员可以采取成本导向定价的方法来进行化妆产品的定价。

例如,在具体教学实践中的课上阶段,教师可以借助微课准备一些重点问题,如在讲授等差数列时,可以将学生分成若干个小组,以微课形式展示几组数列,引导学生发现数列中的规律,鼓励学生讨论、总结出等差数列的公式,同时,要给予学生充足的思考时间,让学生通过思考来进行总结与分析,避免使学生成为学习的被动方,打破传统灌输式的教学方式,以此充分调动学生的动脑思考能力与运用能力,激发主观能动性,使学生在观察、发现问题中逐渐学会解决问题,从而真正发挥微课对数学教学的重要作用。

1.2.2 嘌呤标准品混合液的配制

1.2.4 电化学检测

小学中年段教材中的作文要求都是以文字体现,小学生阅读之后会感到不知所云、茫然无措,有些教师阅读后也往往一头雾水,不知道该怎样对学生进行教学。学生写作基础与语文能力存在差异,写作水平各不相同,教师在指导上也有一定困难。在这种情况下,语文教师可以应用游戏作文,以作文主题、单元主题作为依据,对相关游戏进行创设,让原本枯燥难懂的作文题目与作文要求,通过游戏的形式生动形象地体现出来,使小学生在游戏的同时对作文主题有清晰的领悟,并与自身所学课文相结合,强化对作文的理解。这样的方式,可促使学生全身心投入教学之中,提升写作热情,提高作文写作质量。

采用酸化的多壁碳纳米管(MWNTs)5 mg和离子液体(IL,bmim-PF6)100μL修饰玻碳电极(GCE)制备多壁碳纳米管-离子液体修饰玻碳电极(MWNTs-IL/GCE),以此为工作电极,Ag-AgCl电极为参比电极,Pt丝电极为对极,组成三电极体系进行电化学检测(LK2005恒电位仪,天津市兰力科化学电子高技术有限公司)。检测参数及方法见文献。

分别移取鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤储备液适量,混合并稀释成为20 μΜ的测试液6份,分别用微量的HCl溶液或NaOH溶液调pH为6.40,6.80,7.20,7.40,7.60,8.00,进行电化学测定。

状态良好且长满培养皿底的细胞依次经0.25%胰蛋白酶消化、吹打悬浮、离心(1000r/min,10min)后得细胞沉淀,所得细胞沉淀分别用pH 6.4、7.2、7.4 PBS冲洗3次,然后分别用适量的pH6.4、7.2、7.4 PBS配成细胞悬液并计数。所得细胞悬液在水浴50℃作用30min离心后进行常规电化学测定。

2 结果

2.1 酸度对嘌呤标准品混合液电化学信号的影响

pH值的变化会影响嘌呤类物质信号峰的峰位与响应电流的强度。在pH6.4~8.0范围内,四种嘌呤标准品产生电化学响应的峰位随pH值的变化表现为:Epa(黄嘌呤)=1.17-0.0627 pH (R=0.99522), Epa(鸟嘌呤)=1.18-0.0634 pH(R=0.99850),Epa(腺嘌呤)=1.37-0.0519 pH(R=0.99885),Epa(次黄嘌呤)=1.31-0.0392 pH (R=0.99451)。斜率分别为:62.7mV/pH,63.4mV/pH,51.9mV/pH和39.2mV/pH,说明鸟嘌呤、黄嘌呤和腺嘌呤在电极表面是两个电子伴随两个质子的氧化反应,次黄嘌呤是一个电子伴随两个质子的氧化反应。

  

图1 不同pH值下嘌呤标准品混合液的循环伏安图

 

pH值:a→f依次为6.40,6.80,7.20,7.40,7.60,8.00

 

浓度:20μΜ,富集电位:+0.3V,富集时间:480s

where r is the radial mode number, nr=n1/n2, n1 and n2 are the refractive indices of microcavity and ambient materials, respectively, η(r) is the Airy function solution and equals 2.338 if r=1, L is the polarization characteristic coefficient and L=1/nr for TM modes and L=nr for TE modes.

图1为四种嘌呤标准品混合物在pH6.4~8.0区间内的电化学行为变化。嘌呤标准品混合物在MWNTs-IL/GCE上检测到两个氧化峰,分别为0.8V左右的黄嘌呤和鸟嘌呤氧化峰(峰Ⅰ)以及1.2V左右的次黄嘌呤和腺嘌呤氧化峰(峰Ⅱ)。

1.2.3 MCF-7细胞质检测液的配制

2.2 酸度对MCF-7细胞质电化学行为影响

MCF-7细胞质在MWNTs-IL/GCE上显示两个电化学信号峰,分别为0.7V左右的黄嘌呤和鸟嘌呤氧化峰(峰Ⅰ)以及1.1 V左右的次黄嘌呤和腺嘌呤氧化峰(峰Ⅱ)。随着pH的减小,两个信号峰峰电流强度减小, pH 7.2(图2-b))时峰电流与pH 7.4 (图2-c)时的峰电流相比强度相差不大。pH 6.4(图2-a) 时,峰Ⅰ的峰电流明显减小,峰Ⅱ的峰电流已被电极基线淹没,无法检测到。pH 6.4时标准品的两个响应电流稳定,信号强度较好,且酸性越强信号强度越大,而细胞质样品在pH 6.4时却几乎无法检测到第二个信号。

  

图2 MCF-7细胞质在不同pH值下的循环伏安图

 

pH值:a→c依次为6.4,7.2,7.4

3 讨论

细胞的两个氧化峰在酸性条件(pH<7)下峰位稳定,峰电流较强,且随着pH的降低,峰位向负向移动。说明在电化学反应中有质子参与反应。pH越低基线下降趋势越小,说明MWNTs-IL/GCE在酸性条件下使用效果更为理想,这是由于多壁碳纳米管应用前经过酸化处理,在酸性条件下性能更加良好。 在酸性条件下,细胞活性很差,产生的信号物质很少,因而表现为细胞的第一个信号弱,几乎检测不到第二个信号。pH 7.2~7.4是细胞正常生长的pH范围,细胞在生理pH值下,能够保持活性,产生嘌呤类信号物质,从而可以检测到电信号。虽然

在pH 7.2~7.4时,此复合电极状态及性能都不在最佳状态,但这个因素相比于细胞产生信号物质来说是次要的。寄希望于通过改变细胞悬浮液的pH值进而提高信号强度,提高检测灵敏度的办法是行不通的。细胞的活性状态是电化学检测的关键因素。细胞悬浮液的pH值直接影响着细胞的活性,影响电化学活性物质的产生。在细胞非生理pH值条件时,电化学信号强度低于生理pH,说明细胞在非生理pH条件下的活性低于正常生理pH,这个结论与细胞生物学是相符的。

参考文献

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[2]鞠熀先, 电分析化学与生物传感器[M]. 北京: 科学出版社, 2006

[3]曹海鹏,蔺润先,段春雷,等.双信号电化学法检测金雀异黄素对MCF-7细胞的抑制作用[J].黑龙江医药科学,2014,37(1): 88-89

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[13]H.W.Qin,Q.D.Gao,H.M.Niu,et al.An in situ electrochemical detection method of cell viability[J].Analyst,2013,138:3372-3375

 
邱丹,王喜洁,刘博男,温馨,李秀玲,高洪福,李锦莲,武冬梅
《黑龙江医药科学》 2018年第02期
《黑龙江医药科学》2018年第02期文献

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