基质金属蛋白酶(MMP)是一组分解细胞外基质的钙锌离子依赖型蛋白酶的总称。其在肿瘤的转移中起着重要作用，在口腔疾病领域也被广泛研究。龋病作为一种口腔临床中的常见疾病，现已有成熟的治疗方案，充填材料和黏结技术近年来都有了很快的发展，临床治疗成功率也有了显著提高。但树脂修复后产生继发龋等问题还需要进一步得到更好的解决方案。树脂修复失败的原因有很多，其中黏结失败是一个重要因素。牙本质黏接剂酸性环境可以激活MMP酶原,进而分解暴露的胶原纤维,破坏黏接界面而导致黏接的失败，抑制MMP可有效增加黏接耐久性[1]。随着黏结剂的不断发展，树脂充填术的远期成功率已经有了很大的提高，但并未改善基质金属蛋白酶分解胶原纤维的问题，所以MMPs抑制剂的研究可以进一步提高树脂充填远期效果。关于Mmps抑制剂的研究已有了明确的方向和成果。目前氯已定是研究最为广泛的人工合成的MMPs 抑制剂，也是被公认的能够被应用于口腔的MMPs抑制剂。绿茶酚等天然提取物对MMPs也有显著的抑制作用，天然抑制剂对比人工合成抑制剂更容易获取，优势明显[2]。姜黄素(Curcumin)是从姜黄属植物根茎中提取的化合物 ，是一种植物多酚,与绿茶酚等有相似的化学结构，相关研究表明姜黄素对癌细胞中的mmp-2,MMP-9有抑制作用[3]，姜黄素作为一种纯植物提取物，作为Mmps抑制剂有着很大的优势和可行性，可以为临床应用提供更多的选择，本实验通过体外研究初步探讨姜黄素对牙本质中的MMP-2表达的影响。

1　材料与方法

1.1　材料

姜黄素(Sigma公司)，体液基质金属蛋白酶-2活性比色定量检测试剂盒(上海杰美基因科技有限公司)，氯己定，二甲基亚砜，十颗新鲜离体牙(佳木斯大学附属第二医院颌外门诊)。

人力资本积累影响制造业结构升级的实证研究....................................................................................................阳立高 李永奇 韩 峰 龚世豪（1）

1.2　实验设备

慢速切割机，全自动多功能酶标仪，恒温箱，L-80XP超低温离心机，液氮罐。

1.3　实验牙本质片制备

在流水冷却条件下用慢速切割机将10颗新鲜离体牙，沿与牙长轴垂直的方向切割成厚约1mm 的薄片，然后用高速手机沿釉牙本质界精确的将牙釉质磨除。将牙本质薄片浸泡在液氮中 2h后置于研钵中研磨成牙本质粉。

1.4　基质金属蛋白酶提取

在10mL10%磷酸中加入1g牙本质粉，将其放入4℃冰箱中脱矿8h后，将其放入超低温离心机中(转速设置为3000rpm温度设置为4℃)，离心2min后弃掉酸蚀液，用5mL 100mM Tris-HCl 冲洗离心管中剩余的牙本质粉，然后放入离心机中离心2min弃掉上清液，并重复3次，然后加入5mL十二烷基硫酸钠(SDS) 溶液置于离心机(转速设置为14000rpm温度设置为4℃)离心10min中，提取上清液即为基质金属蛋白酶。

1.5　实验方法

姜黄素对酶抑制作用检测: 在96孔板中选取中间的9个孔标记为A,B,C,D,E,F,G,H,I,分别

阿袁创设的知识女性的关系基本分两类。一类是直接的斗争关系，如《马群众的快乐经济学》中的陈荞与陈麦，《俞丽的江山》中的俞丽和朱小七，《郑袖的梨园》中的郑袖与朱红果，郑袖与叶青。另一类是潜在的斗争关系，也就是女人之间的争风吃醋，就如《汤梨的革命》中的陈青和汤梨在男人面前长袖善舞，如《老孟的暮春》江小白、陈朵朵、沈单单、小青老孟的前妻围绕老孟展开的种种攻心计谋。这些女性之间的关系错综复杂，没有挑明的你争我夺，却是无处不在的你来我往，眼里是刀光剑影，心里是怨念恨意。她们也可以是朋友，甚至交心到可以成为闺蜜，但最终都不过虚与委蛇，彼此之间互为地狱关系淡漠。

为空白对照组A,B,阳性对照组C组0.2%氯己定，实验组DEFGHI浓度分别为10,20,30，40,60,80μmol/L的姜黄素,移取79μLGENMED缓冲液到九个孔中，再加入10μL反应液，加入1μL底物液到DEFGHI六个样品活性孔中，加入1μL阴性液到ABC三个孔中，轻轻摇动96孔板，在37°恒温下孵育3min，然后在九个孔中分别加入30μLMMPs提取液，再分别加入10μL待测样品(空白对照组A：10μL去离子水；B组10μL二甲基亚砜 阳性对照组C：10μL0.2%氯己定；实验组DEFGHI10μL姜黄素(浓度分别为10,20,30，40,60,80μmol/L)，轻摇96孔板,立即用酶标仪中读取9个孔的读数，酶标仪波长设置为412nm，然后将96孔板放入37℃恒温箱中，15min后将其放入酶标仪中读取读数，按照试剂盒公式[(完全活性读数-空背景对照读数)-(抑制剂样品活性读数-样本背景读数)]÷(完全活性读数-空背景对照读数)=实际抑制百分率，将15min内A 值换算成15min内待测物的酶活性抑制率。将实验步骤重复五次，读取出五次数值，进行计算。

1.6　统计学方法

采用t检验得出各实验组与对照组相比均具有显著差异(P<0.05)具有统计学意义,结果表明对MMP-2的抑制作用随着姜黄素浓度的增大而增大,姜黄素浓度达到40μmol/L时抑制效果最佳，然后呈稳定趋势，姜黄素浓度达到30μmol/L时,对MMP-2的抑制效果优于0.2%氯己定(76.26±4.57%)。见表1。

2　结果

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，不同预处理液对MMP-2活性的抑制百分比，P<0.05 为有统计学差异。

除此之外，支付宝还应该分层次、按投资总额对用户进行分层管理。对一些小投资额度的用户，应本着快捷方便的原则让用户进行转入转出操作。但对于一些投资总额较高的余额宝用户，应本着多重操作保证账户安全的原则，设置余额宝交易盾等更加安全的交易手段。

 

表1　不同浓度姜黄素对MMP-2的抑制效果

  

组别10μmol/L 20μmol/L 30μmol/L 40μmol/L 60μmol/L 80μmol/L抑制率31.04±3.39 52.46±2.22 83.18±2.1691.06±1.98 90.96±1.70 91.02±2.28 t值17.772 10.479 3.063 6.646 6.248 6.723

3　讨论

基质金属蛋白酶对其他口腔疾病也有着众多影响。MMP-2在口腔鳞状细胞癌侵袭转移过程中起着重要的作用[4]，并且MMP -2 的表达可以反映牙周组织的炎症程度，能够成为反映慢性牙周炎症程度的客观指标[5]。研究发现，牙本质内含有具有降解有机基质作用的蛋白水解酶—基质金属蛋白酶[6]。目前资料显示，牙本质内存在着 MMP-1，8，2，9，3型。其中，MMP-2(明胶酶)可能是牙本质中存在最广泛的MMPs，且在矿化牙本质中有着高表达。MMP-2与修复性牙本质的形成、龋坏、根尖周炎以及牙髓炎等的发展过程密切相关[7 ]。实验证明姜黄素对人牙本质中的MMP-2有抑制作用，通过和阳性对照组氯己定比较，浓度为30μmol/L的姜黄素抑制率大于0.2%氯己定。姜黄素对MMP-2的抑制作用随着浓度的增加而加强，当浓度达到40μmol/L时，随着浓度的升高，抑制率趋于稳定。姜黄素是从姜黄中提取的一种植物多酚[8]，作为抑制剂有更良好的无毒性，可供性，但姜黄素呈黄色，可能存在染色问题，40μmol/L的姜黄素对MMP-2的抑制效果较其他两组无明显差别，故认为达到这个浓度为最佳抑制浓度。但实验仅对牙本质中的一种基质金属蛋白酶进行检测，具有一定的局限性。

参考文献:

[1]王恒,滕伟. 基质金属蛋白酶对牙本质黏接耐久性的影响[J]. 国际口腔医学杂志,2012,39(4):498-500

[2]徐帅. 表没食子儿茶素没食子酸酯保护脱矿牙本质基质的相关作用研究[D].第四军医大学,2014

[3]Yodkeeree S,Chaiwanqyen W,Garbisa S,et al.Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA[J]. Nutr Biochem,2009,20(2):87-95

[4]李峰,满大鹏,南晓利,等. CD147和MMP-2在口腔鳞状细胞癌中的表达级及意义[J]. 黑龙江医药科学,2011,34(4):25-26

[5]朱建华,李佳薇,贾会敏,等. 基础治疗慢性牙周炎对龈沟液中EMMPRIN和MMP-2的影响[J]. 黑龙江医药科学,2016,39(6):54-55，48

[6]王丹杨. 人牙本质源MMPs的鉴定及其与牙本质黏接持久性的相关性研究[D].第四军医大学,2012

[7]Visse R,Nagase H.Matrixmetalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases:structure,function,and biochemistry[J].Circ Res,2003,92(8):827-839

[8]成扬,平键,刘成,等. 姜黄素激活过氧化物酶体增殖因子活化受体γ信号对大鼠肝星状细胞基质金属蛋白酶2、9活性和胞核核因子-κBp65表达的影响[J]. 中国中西医结合杂志,2007,(5):439-443