粒细胞减少症是临床上常见的一种疾病，其中大部分病人与感染、化疗、自身免疫性疾病等因素有关，即获得性粒细胞减少。而重型先天性中性粒细胞减少症(severe congenital neutropenia， SCN)，此类疾病目前我们的认识还比较少，它是原发性免疫缺陷病中的一类。最早由瑞典儿科医师Kostmann在1956年报道。SCN是以外周血成熟中性粒细胞缺乏为主要症状的一类异质性疾病，并且已被证实SCN与多种基因突变有关[1]。近年来越来越多的报道基因诊断在临床诊疗过程中发挥着重要作用[2]。本文先后对2例粒细胞减少患儿进行基因测序，发现分别存在CXCR4基因突变及G6PC3基因突变，本文意在揭示其基因类型与临床表现的关系，为本病的临床研究及基因诊断提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 先证者一，女，3岁8月，发现中性粒细胞减少3年余，3年前查ANC1×109/L，后多次查中位粒细胞的绝对计数(absolute count of neutrophils，ANC)波动在(0.2～0.8)×109/L，患儿合并有先天性心脏病：房间隔缺损，二尖瓣关闭不全。反复呼吸道、皮肤黏膜、中耳炎、口腔溃疡等感染史。先证者为双胞胎，其胞弟，血常规检测未发现异常。先证者一父母均体健，血常规检测未发现异常。否认有遗传病史。骨髓细胞学检查：增生活跃，粒∶红比=1.55∶1，各阶段细胞均可见，粒系比值正常，占44%。早幼粒细胞2.8%，中幼粒细胞6.0%，晚幼粒细胞2%，中性杆状核16.8%，各阶段粒细胞形态大致正常。红系比例形态大致正常，淋巴细胞比值及形态正常，余未见异常，见图1。

先证者二，女，9岁，3年前因“臀部肿物”行外科手术时发现粒细胞减少，未进行诊治。后因感染入郑州儿童医院，查ANC 0.06×109/L，患儿系领养，其养父母口述患儿自幼体弱多病，患儿有反复盆腔感染病史。骨髓细胞学检查：增生活跃，粒∶红比=3.19∶1，各阶段细胞均可见，粒系比值正常，占61.2%。中幼粒细胞8.8%，晚幼粒细胞11.6%，中性杆状核23.6%，中性分叶核16%，各阶段粒细胞形态大致正常。红系比例形态大致正常，淋巴细胞比值及形态正常，余未见异常，见图2。淋巴细胞亚群：T细胞(CD3+)65%(正常范围55%～84%)，Ts(CD3+CD8+)21%(正常范围11%～41%)，Th(CD3+CD4+)42%(正常范围31%～60%)，NK细胞 (CD16+56+)24%(正常范围5%～27%)，CD4/CD82.00(正常范围0.68～2.47)， B细胞(CD19+)7%(正常范围6%～25%)。免疫球蛋白M 1.98 g/L(正常范围0.4～2.6)，免疫球蛋白G 9.60 g/L(正常范围7～16)，免疫球蛋白A 2.49 g/L(正常范围0.7～4)，补体C4 0.20 g/L(正常范围0.1～-0.4)补体C3 1.24 g/L(正常范围0.78～-2.1)。皮肤黏膜未见明显异常。

 

图1 先证者一骨髓涂片 图2 先证者二骨髓涂片(瑞氏-

吉姆萨染色×1000)

1.2 方法

1.2.1 标本采集 在知情同意的前提下，采集先证者一及先证者二全血2 ml(EDTA抗凝血)，使用BloodGen Midi Kit (CWBIO， China) 提取患者全基因组DNA，操作按照试剂盒说明书进行。

1.2.2 二代测序 参考文献与OMIM数据库信息，将人类全部约2万个基因的基因组外显子区域定制罗氏NimbleGen捕获探针进行目标基因全外显子捕获。Illumina hiseq2500平台标准化上机测序操作流程，Illumina官方basecall分析软件BclToFastq得到原始数据(raw data)，进行数据分析。

跨境电商物流大体上就是在不同关境的交易主体通过电子商务平台来完成交易，进行支付结算，是通过跨境物流进行运送商品、完成交易的一种国际贸易交易。通常情况下，跨境电商物流有三种模式，分别是国际小包、海外仓储及聚集后规模化运输。

技术报告会详细描述整个认证的过程、发现的缺陷及整改情况；最后一个部分就是技术概念（即认证的结果，哪条生产线通过了认证，哪条生产线没有通过），之后打印出来由双方签字认可。

 

表1 G6PC3基因/CXCR4基因所验证位点分析引物序列

  

引物名称碱基序列退火温度(℃)扩增产物大小(bp)IVS3+1G>TF:AGCAGTGGACAGAATCGTAGT551283R:AGGAGAGTGGAGTGACAACAGc.915(E6):缺失GF:GCCTAATAACTGGTGAGCAACT551370R:TGGAGATGGCACAGAGACTACc.1004(exon1)-c.1005(exon1)delAAF:CATCCTCCTGGAAATCATCAGCA 60°两步法 265 R:GCTGGAGTGAAAACTTGAAGACTCAGA

[7] 薛胜利，陈艳，邱桥成，等.非综合征性先天粒细胞减少症一例及基因诊断[J].中华内科杂志，2011，50(11)：922-925.

2 结 果

2.1 先证者一基因分析 通过对先证者全基因组DNA提取，检测到先证者一存在G6PC3基因突变，使用一代测序(Sanger法)验证先证者G6PC3基因全部外显子及其侧翼序列，先证者一的17号染色体G6PC3基因第3个内含子g.42152139出现了G>T错义突变，同时位于E6出现g.42153285出现了缺失G。即先证者一存在杂合子突变：IVS3+1G>T及c.915(E6)：缺失G，杂合突变。已美国NCBI基因库所公布的序列为标准。其检测结果见图3。

在沟槽开挖基本完成时，运输管材及管件并布置在沟旁。尽量缩短管材在沟旁的存放时间，以避免外界损伤管材并减少阳光照射。布管时应小心轻放，防止损伤管材，管口连接前应封堵，防止泥土进入。

 

图3 先证者一G6PC3基因突变序列参照图 ①IVS3+1的NCBI参照序列图；②先证者一G6PC3基因IVS3+1出现G→T；③C.915(E6)的NCBI参照序列图 ④先证者一G6PC3基因C.915(E6)出现缺失G

2.2 先证者二基因分析 通过对先证者全基因组DNA提取，检测到先证者二CXCR4基因出现c.1004(exon1)和c.1005(exon1)delAA，使用一代测序(Sanger法)验证先证者CXCR4基因全部外显子及其侧翼序列，先证者二位于2号染色体CXCR4基因第1个外显子g. 136872505-136872506出现了连着缺失两个A，至使下游的后序所有蛋白序列发生突变。即先证者二存在CXCR4基因：c.1004(exon1)和c.1005(exon1)连着缺失两个A。已美国NCBI基因库所公布的序列为标准。其检测结果见图4。

 

图4 先证者二CXCR4基因突变序列参照图 ①C.1004-1005的NCBI参照序列图；②先证者二CXCR4基因出现c.1004(exon1)-c.1005(exon1)分别缺失A

3 讨 论

SCN其临床表现多态性，除ANC减少外，可伴其他系统的表现，因此按临床表现单独累及血液系统的和同时出现累积其他系统症状，可分为非综合征性CN和综合征性CN[3]。

近年来，随着基因检测技术的发展，越来越多的患者通过基因检测确诊为SCN。近年来的研究证实多种基因突变与SCN发病有关。常见的基因有ELA-2基因、HAX1基因、WASp基因、AK-2基因、GFI1基因等。本文收录的2例患者的基因突变类型，在国外均有报道，但国内报道较少。在既往的国内报道中仅有2例先天性中性粒细胞减少的患者，未检测到异常基因突变类型[4-5]，有1例ELA2基因[6]，1例HAX1基因出现突变，并在随后的定期门诊随访中提示疾病进展为CMML[7]。1例CXCR4基因突变，并确诊为WHIM综合征(warts，hypogammaglobulinemia， infections， and myelokathexis syndrome，OMIM193670)[8]。本文的先证者二被证实存在CXCR4基因的突变，最早在2003年报道WHIM综合征被证实与CXCR4基因突变有关[9]。WHIM综合征表现为疣、血丙种球蛋白减少、感染以及先天性髓样粒细胞缺乏症的四联症。而本先证者一除外周血中性粒细胞减少及反复感染外，并无疣、血丙种球蛋白减少症状。CXCR4趋化因子受体亢进是发病的主要原因，CXCR4趋化因子受体的亢进引起CXCR4所依赖的中性粒细胞滞留在骨髓中[10]，从而导致外周血粒细胞减少和成熟粒细胞异常存留在骨髓中而凋亡。CXCR4扮演着重要的角色在人类的免疫系统中，已经发现它与多种疾病的发生有关，并且与癌症转移密切相关。正常情况下，CXCR4在人体新生组织中的表达非常的低，随着细胞成熟到即将凋亡表达逐渐增高，这可能与骨髓中衰老细胞被巨噬细胞清除的机制有关[11-12]。先证者二目前尚无法诊断WHIM综合症。但先证者二存在CXCR4基因突变，可以解释其粒细胞减少症状的原因，骨髓涂片可见增生活跃，且粒细胞生成正常，而外周血中粒细胞明显减少，提示存在粒细胞向外周血释放障碍情况。

[17] Alizadeh Z，Fazlollahi MR，Houshmand M，et al．Different pattern of gene mutations in Iranian patients with severe congenital neutropenia(including 2 new mutations)[J]．Imn J Allergy Asthma Immunol，2013，12(1)：86-92．

说我油瓶倒了不扶。唉，我还是等她们睡了再说吧。车里已经烟雾浓浓，老崔又点了一支烟抽起来，还扔了一支给冯一余。冯一余其实早已经戒烟，但他没有拒绝老崔的烟，和老崔一个车里一个车外，抽了起来。

先证者一出现G6PC3基因突变是有葡萄糖6磷酸酶催化亚基3引起的突变所致。最早是由Boztug等[13]在2009年发现，根据既往文献报道，该基因可引起重症先天性粒细胞减少症4型(severe congenital neutropenia type 4，SCN4)，临床表现以严重的中性粒细胞减少为特征，并且伴有间歇性血小板减少、皮肤浅表静脉突出以及心血管系统、泌尿生殖器的畸形、面部畸形、听力损害[14]。G6PC3在骨骼肌肉细胞中表达较高，在G6PC3缺陷的患儿者出现骨骼肌肉异常症，包括肌无力及关节松弛[15]。G6PC3在正常人的睾丸中存在很高的表达，有国外的文献报道8例男性的G6PC3缺乏的患者中有6例存在隐睾症[16]。在国外的文献报道中提到患儿的体重明显低于同龄人[15]。同时G6PC3缺陷的患儿可能合并血液系统的异常，有难治性缺铁性贫血、骨髓中出现异常巨核细胞以及外周血可见巨大血小板及间歇的血小板减少。本文的先证者一经证实存在严重中性粒细胞减少，有先天性房间隔缺损并二尖瓣关闭不全，皮肤浅表静脉突出，特殊面容(非遗传因素的眼裂小及鼻梁低平)，身高体重明显低于同龄儿童，间歇性的血小板减少。G6PC3基因缺陷引起的SCN4机制是G6PC3基因编码葡萄糖-6-磷酸酶-β(glucose-6-phosphatase-β，G6Pβ)可以水解糖异生和糖原分解最后一步的葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate，G6P)，这种酶同样作用于连接细胞质与内质网的G6PT转运体，突变的基因引起G6P至使发病。另外，还有研究指出G6PC3突变可以使糖原合成酶激酶3β的活性增加，从而使抗凋亡分子Mcll(Bcl-2家族成员之一)发生水解，造成中性粒细胞凋亡[17]。此外，在2010年David等[15]研究中，提到G6PC3基因突变可造成CXCR4过度的表达从而引起粒细胞减少，在体外动物模型中，通过抑制小白鼠的CXCR4表达可以扭转粒细胞减少。另外，在研究中David等[15]提到粒细胞刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor， G-CSF)治疗可减低中性粒细胞的CXCR4表达，从而使外周血的中性粒细胞计数上升至正常。目前有关G6PC3缺陷是如何选择性的引起中性粒细胞和NK细胞中CXCR4表达异常提高的机制仍尚不清楚。

[14] Ayekin C，Germeshausen M，Tuygun N，et al．A novel G6PC3 gene mutation in a patient with severe congenital neutropenia[J]．J Pediatric Hematol Oncol，2013，35(2)：e81-83．

SCN中的大部分患者的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)/G-CSFR系统功能正常[19-20]。本研究未进行G-CSFR功能检测，但均进行G-CSF的治疗，患者的中性粒细胞计数均有所上升。G-CSF在80年代被广泛用于SCN的患者。尽管有一些关于长期使用G-CSF后出现不利影响的报道[21-22]，但是并不影响G-CSF治疗SCN。有少量病例报道提到，当患者每次使用G-CSF的剂量大于10 μg/kg以及患者接受G-CSF的总剂量大于10 000 μg/kg，将大大增加向恶性疾病转化的风险[1]。另外，还有一些研究指出一部分的SCN可转化成MDS/AML。SCN转化成白血病的风险主要依赖于2个因素，其一是基因突变的类型，其二是累积使用G-CSF[3]。目前被报道有很高的风险转化成白血病的病例基因类型有SBDS、GATA2[3]。然而目前G6PC3基因转化成恶性疾病概率较低[23]。而CXCR4基因所致的WHIM综合征为良性慢性病程，预后大多良好，有少量报道该疾病进展呈EBV相关淋巴增殖性疾病[24]。

参考文献：

[1] Donadieu J， Fenneteau O， Beaupain B， et al.Congenital neutropenia: diagnosis， molecular bases and patient management[J]. Orphanet J Rare Diseases，2011， 6(1)：1-28.

[2] Dale DC， Person RE， Bolyard AA， et al. Mutations in the gene encoding neutrophil elastase in congenital and cyclic neutropenia[J].Blood， 2000，96(7)：2317-2322.

[3] Donadieu J，Beaupain B，Mahlaoui N，et al. Epidemiology of congenital neutropenia[J]. Hematol Oncol Clin North Am，2013，27(1)：1-17.

[4] 杨湖，高宗燕，李琳迪，等.重型先天性粒细胞减少症1例报告并文献复习[J].临床儿科杂志，2014，32(5):485-488.

[5] 乔曼，薛胜利，邹晶莹，等.先天性中性粒细胞减少症的诊治[J].中国实验血液学杂志，2012，20(5):1221-1224.

[6] 王波，卢俊，乔曼，等.1例儿童先天性粒细胞减少症的基因诊断[J].临床儿科杂志，2013，31(1):44-47.

1.2.3 一代测序(Sanger法)验证 根据G6PC3基因 和CXCR4基因所验证位点序列设计引物，采用PCR方法进行扩增。PCR反应条件为：95 ℃预变性5分钟;95 ℃变性30秒， 60 ℃退火30秒，72 ℃ 链延伸30秒，扩增30个循环；最后72 ℃补充延伸10分钟。PCR 的体系均为50 μl。引物序列见表1。

基因序列分析，G6PC3基因/CXCR4基因所验证位点的PCR扩增产物，用ABI 3730XL 测序仪测序，测序引物采用原PCR引物。基因序列分析采用DNASTAR软件进行序列分析和比对。

(3)绞车主刹车为主电机能耗制动，具有悬停功能，通过操纵手柄即可实现绞车的减速、悬停，操作人员不需要操作刹车就可实现大钩的减速和停止，简化操作流程，降低误操作几率，操作灵敏、快捷。绞车辅助刹车为液压盘式刹车，包括两个工作钳和一个安全钳，刹车力矩大，安全可靠。

[8] 陈晓娟，杨文钰，王书，等.WHIM综合征一例及文献复习[J].中华儿科杂志，2013，51(3)：178-182

[9] Heruandez PA，Godin RJ，Lukens JN，el al．Mutations in the chemokine receptor gene CXCR4 are associated with WHIM syndrome，a combined immunodeficiency disease[J]．Nat Genet，2003，34(1):70-74．

[10] Kawai T， Choi U， Cardwell L， et al. WHIM syndrome myelokathexis reproduced in the NOD/SCID mouse xenotransplant model engrafted with healthy human stem cells transduced with C-terminus-truncated CXCR4[J]. Blood， 2007，109(1):78-84.

[11] Martin C， Burdon PC， Bridger G， et al. Chemokines acting via CXCR2 and CXCR4 control the release of neutrophils from the bone marrow and their return following senescence[J]. Immunity，2003，19(4):583-593.

[12] Weisel KC， Bautz F， Seitz G，et al. Modulation of CXC chemokine receptor expression and function in human neutrophils during aging in vitro suggests a role in their clearance from circulation[J]. Mediators Inflamm， 2009，2009(2):790174.

[13] Boztug K， Appaswamy G， Ashikov A， et al. A syndrome with congenital neutropenia and mutations in G6PC3[J]. N Engl J Med，2009，360(1):32-43.

[15] David H. McDermott， Suk See De Ravin， Hyun Sik Jun，et al. Severe congenital neutropenia esulting from G6PC3 deficiency with increased neutrophil CXCR4 expression and myelokathexis[J]．Blood， 2010，116(15):2793-2802．

美日药物临床试验中重大利益冲突的界定和管理探讨及对我国的启示 …………………………………… 苏 娴等（17）：2333

SCN在遗传方式上有多态性，既可以表现为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、性染色体遗传，以及无遗传背景的散发病例。CXCR4基因是常染色体显性遗传，G6PC3基因为常染色体隐性遗传。本文的2例先证者均为无遗传背景的散发病例。在既往的国内文献中报道均为无遗传背景的散发病例。通过遗传方式对SCN的诊断有一定的帮助，但对于除感染、化疗等可能因素外的粒细胞减少，基因分子是诊断SCN强有力的依据。不同的突变类型造成粒细胞缺乏程度有所差别。因此，通过基因诊断来甄别患儿粒细胞减少程度也有很大的价值[18]。

物联网被世界公认为是继计算机、互联网与移动通信网之后的世界信息产业第三次浪潮，物联网与互联网的创新融合，将成为下一轮世界经济发展的技术驱动力[2]。对于服装行业而言，要发展工业物联网必须要首先解决产品开发数据的导入、管理与输出问题，使产品的数据信息切实成为物联网在行业中应用的核心驱动。

[16] Martin CC， Oeser JK， Svitek CA， et al.Identification and characterization of a human cDNA and gene encoding a ubiquitously expressed glucose-6-phosphatase catalytic subunit-related protein[J]. J Mol Endocrinol， 2002，29(2):205-222.

那语气像是刚才什么都没有发生似的，我心里七上八下地坐在了萍萍的身边，然后看着林孟拿着一张白纸和一支笔走过来，他和我们坐在了一起，他对萍萍说：“你做了对不起我的事……”

[18] Horwitz MS， Duan Z， Korkmaz B， et al. Neutrophil elastase in cyclic and severe congenital neutropenia[J]. Blood， 2007， 109(5):1817-1824.

[19] Guba SC， Sartor CA， Hutchinson R， et al. Granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) production and G-CSF receptor structure in patients with congenital neutropenia[J]. Blood， 1994，83(6):1486-1492.

实训分级阶梯式递进（虚拟仿真、影像体模、真人训练、岗前验收），从适用岗位任职需求的虚拟仿真综合实训软件模拟训练着手、配合配套的操作手册和实训指导、训练基本达标以后进入影像体模训练、最后实施真人体验式训练，直至通过课程教学目标达成考核。进入临床实习前再由临床专家完成实习前实训操作验收程序，合格后方可进入临床实习。学校实训教学对接行业标准、实现专业核心技能的培养。

[20] Druhan LJ， Ai J， Massullo P， et al. Novel mechanism of G-CSF refractoriness in patients with severe congenital neutropenia[J].Blood， 2005， 105(2):584-591.

以往多采用常规护理予以护理，但不具有针对性，能够满足患者的一般护理需求，难以满足患者的实际护理需要，也不能优化手术。近年来，我院开始在临床护理当中应用优质护理，效果理想[4]。优质护理可在保证患者基本护理需要的同时，优化手术配合，提升手术质量[5]。优质护理下，患者的手术时间更短，护理后的视力水平更高，并发症发生率更低，满意程度更好。

[21] Bonilla MA， Gillio AP， Ruggeiro M，et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis[J]. N Engl J Med， 1989， 320(24):1574-1580.

[22] Dale DC， Bonilla MA， Davis MW，et al. A randomized controlled phase Ⅲ trial of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (filgrastim) for treatment of severe chronic neutropenia[J]. Blood，1993， 81(10):2496-2502.

“有一次我和他带着大家去上工，走着走着，我看他头上都是汗，腰也直不起来，就过去问他怎么了，他说肚子疼，去解个手，让我先带人去劳动，大概过了二十多分钟，我一看他还没回来，觉得不对劲，就往回走去找他，结果看到老连长把坎土曼一头顶在胡杨树上，一头顶在自己的胃上，汗水在他脚底下湿了一片，后来才知道，那是在战争年代留下的病根，这个办法是他的‘止疼药’”，谢运华曾经的老搭档胡建清回忆老连长时边说边敲茶几，“他真硬，跟这茶几上的石头一样”。

[23] Boztug K，Rosenberg PS，Dorda M，et al．Extended spectrum of human glucose-6-phosphatase catalytic subunit 3 deficiency：novel genotypes and phenotypic variability in severe congenital neutropenia[J]．J Pediatr，2012，160(4)：679-683．

[24] Diaz GA．Released on a WHIM[J]．Blood，2011，118(18)：4764-4765．