铝是地壳中第三大化学元素，也是含量最多的金属元素，被广泛应用于日常生产、生活中。铝可经多种途径进入人体，进入机体的铝大多与转铁蛋白结合，通过血脑屏障，在脑组织中大量蓄积［1］。铝的过量蓄积可能是导致阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）等神经退行性病变的原因之一。神经原纤维缠结（neurofibrilary tangles，NFTs）是AD典型的脑病理特征之一，对AD患者脑组织中的NFTs进行研究发现，NFTs中高度富集铝和异常磷酸化的tau蛋白，提示铝在NFTs的形成和累积过程中发挥重要作用［2］。课题组前期人群研究［3-4］、动物实验［5］、体外实验［6］均发现铝可导致tau蛋白过度磷酸化。在正常生理情况下，tau蛋白可以促进微管组装，在维持神经元的完整性和轴突运输中起重要作用［7-8］。但是在病理情况下，tau蛋白发生异常磷酸化，丧失生物学活性，导致tau蛋白从微管上解离。同时，异常磷酸化的tau蛋白易于聚积，并组装成双螺旋细丝（paired helical filaments，PHFs），最终形成NFTs。有研究表明，在正常生理条件下细胞内可溶性tau蛋白主要由泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）降解，而当环境毒素、遗传因素及老龄化等因素抑制或下调UPS的活性及功能时，细胞内tau蛋白的降解将会发生障碍［9］。最近研究发现，热休克蛋白70羧基末端结合蛋白（carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein，CHIP）是tau蛋白特异性的泛素连接酶3，介导热休克蛋白70（hot shock protein 70，Hsp70）和蛋白酶体降解系统间的连接，在培养的细胞中，可以催化tau蛋白泛素化，调节tau蛋白的降解［10-11］。既然铝可导致tau蛋白异常磷酸化，而tau蛋白是CHIP特异性的底物，那么UPS中的CHIP和Hsp70是否参与铝导致tau蛋白异常磷酸化的过程呢？

本研究以小鼠神经母细胞瘤细胞（N2a细胞）为对象，采用三氯化铝染毒，观察细胞形态、活力变化，测定tau-5蛋白、4种磷酸化蛋白（pThr181、pThr231、pSer262、pSer396）、CHIP和Hsp70蛋白的表达，探讨CHIP和Hsp70在三氯化铝致N2a细胞tau蛋白异常磷酸化中的作用。

“这是很好的事情呀，老师该向你表示祝贺呢。”我笑着说，并无取笑之意，而是为了调节一下气氛，再说，青少年时期本来就到了情窦初开的年纪。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 N2a细胞株 购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

回眸“青海盐湖”的创业史，万千人、万千事、万千成就、万千精彩、万千辉煌纷至沓来。蓦然回首风雨历程，有许多所思、所想、所悟和所行。六十年时间，无疑是一段值得凝练、铭记和怀想的时光，更是一份精神传承！

随着染毒剂量的增加，细胞的tau-5、pThr231、pSer396蛋白表达水平逐渐升高，而pThr181、pSer262蛋白表达水平变化不明显。与对照组相比，高剂量组tau-5蛋白表达升高，差异有统计学意义（P < 0.01）；中、高剂量组pThr231蛋白表达升高，差异有统计学意义（P < 0.01）；低、中和高剂量组pSer396蛋白含量表达升高，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表1。

1.2.1 细胞培养及染毒 N2a细胞采用MEM/EBSS培养基（含体积分数为10%的胎牛血清和1%的青链霉素的混合液），置于37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱中培养，每3 d传代1次。选取对数生长期的同代细胞，弃旧培养液，D-Hanks液洗涤3次，染毒组加入含三氯化铝的培养液，使Al3+终浓度分别为0.5、1.0、2.0 mmol/L（低、中、高剂量组），对照组加入不含三氯化铝的培养液，每组设3个复孔。染毒后继续培养48 h，收取细胞样品进行后续实验。

1.1.3 主要仪器与耗材 二氧化碳恒温培养箱（Thermo，美国）；IX71型倒置荧光显微镜（Olympus，日本）；SW-CJ-2F 型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司，中国）；低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司，中国）；Modle 680酶标仪（Bio-Rad，美国）；超速低温离心机（Eppendorf，德国）；电泳仪（北京六一仪器厂，中国）；恒温干燥箱（上海康路仪器设备有限公司，中国）；凝胶成像仪Universal HoodⅡ（Bio-Rad，美国）；96孔板、6孔板、25 cm2细胞培养瓶（Corning，美国）。

1.2 方法

结直肠癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一。据统计，2015年中国新发结直肠癌病例达37.63万，死亡19.1万，发病及死亡人数均位于恶性肿瘤的第5位[1]。最初，结直肠癌的发生和发展被认为是由突变基因和表观遗传学改变的累积导致[2-3]；然而目前越来越多的证据显示，肿瘤微环境在结直肠癌的发生和发展中同样发挥重要作用[4]。“神经巢”作为肿瘤微环境中的一部分，已被证实在前列腺癌[5]、胰腺癌[6]、皮肤癌[7]、胃癌[8]和结直肠癌[9]等恶性肿瘤中发挥着重要作用。

1.2.3 Western blot法检测蛋白水平 将染毒48 h后的细胞除去培养基，D-Hanks液洗涤细胞3次，用质量分数为0.25%的胰酶消化细胞，1 000 r/min（离心半径：16 cm）离心5 min，弃上清。用D-Hanks平衡盐溶液清洗2次，将细胞收集至1.5 mL离心管中。按哺乳动物蛋白抽提试剂盒说明书抽提细胞总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒进行总蛋白定量，调整各蛋白样品浓度使其相同，加入相应体积的5×上样缓冲液混匀，煮沸5 min。根据不同目标蛋白的含量，取适量的总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳。电泳后湿转至聚偏二氟乙烯膜上，用质量分数为5%的脱脂牛奶TBST溶液室温封闭2 h，加入相应的一抗，4℃孵育过夜。TBST漂洗3次，每次10 min。加入相应的二抗，37℃孵育2 h。TBST漂洗3次，每次10 min。将ECL发光液均匀涂布于聚偏二氟乙烯膜上，用凝胶成像仪选择合适的曝光时间进行显影，并用Quantity One-4.6.5软件得到各组灰度值，以对照组表达量为1，计算各染毒组与对照组tau-5、pThr181、pThr231、pSer262、pSer396、CHIP和Hsp70蛋白表达量的相对值。

1.2.2 观察细胞形态和CCK-8法检测细胞活力 取对数生长期N2a细胞，将其制成5×104个/mL的细胞悬液，混匀后接种于96孔板，每孔100 μL细胞悬液。待细胞融合至50%~60%，弃旧培养液，D-Hanks液洗涤1次，染毒（同上），同时设对照组、空白组（仅含培养液，无细胞），每组设6个重复孔，置于5%恒温培养箱培养。48 h后，显微镜下观察细胞形态，弃染毒液，D-Hanks液洗涤1次，每孔加入100 μL新的培养液，并按说明书要求每孔加入10 μL CCK-8试剂，混匀，于培养箱继续培养2 h，在酶标仪450 nm波长处测定光密度（optical density，D）值，按照以下公式计算细胞活力：细胞活力=［（D染毒组-D空白组）/（D对照组-D空白组）］×100%。

1.3 统计学分析

显微镜下观察各组N2a细胞形态发现，对照组细胞状态良好，大小均一，密集铺满培养瓶底；与对照组相比，低剂量组细胞数量减少，突触变短，细胞间连接减少；中剂量组细胞数量明显减少，突触进一步变短；高剂量组细胞数量明显少于前三组，且细胞变圆，突触几乎消失。见图1。

2 结果

2.1 细胞形态变化

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料经正态性检验符合正态分布，以±s表示，不同组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD法。检验水准α=0.05。

  

图1 三氯化铝染毒后各组N2a细胞形态学变化

 

［注］A：对照组；B：低剂量组（0.5 mmol/L AlCl3）；C：中剂量组（1.0 mmol/L AlCl3）；D：高剂量组（2.0 mmol/L AlCl3）。箭头显示细胞变圆。

2.2 细胞活力变化

铝是一种公认的慢性蓄积性神经毒物，可引起神经元纤维变性，诱导神经细胞死亡，造成神经元严重损失，继而导致神经退行性疾病。本研究结果显示，随着三氯化铝染毒剂量的增加，N2a细胞数量逐渐减少，突触变短，高剂量组细胞数量减少明显；细胞活力逐渐降低，高剂量组活力下降明显，进一步说明了铝对细胞的毒性作用。

2.3 铝离子对tau蛋白及各磷酸化蛋白的影响

1.1.2 主要试剂 三氯化铝（纯度为97.00%，天津市风船化学试剂科技有限公司，中国），MEM/EBSS培养基（HyClone，美国），胎牛血清（BioInd，以色列），胰蛋白酶-EDTA消化液、青链霉素混合液（北京索莱宝科技有限公司，中国），Cell Counting Kit-8（CCK-8）细胞增殖-毒性检测试剂盒（日本同仁化学研究所，日本），哺乳动物蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、5×蛋白上样缓冲液、ECL高灵敏度化学发光检测试剂盒、GADPH、HRP标记的羊抗兔IgG、HRP标记的羊抗鼠IgG（北京康为世纪生物科技有限公司，中国），tau-5、pThr231、pSer262、pSer396、CHIP（Abcam，美国），pThr181、Hsp70（Gene Tex，美国）。

 

表1 三氯化铝染毒后各N2a组细胞tau-5及各磷酸化蛋白的相对表达量（±s，n=9）

  

［注］与对照组相比，*：P < 0.05；#：P < 0.01。

 

组别 tau-5 pThr181 pThr231 pSer262 pSer396对照组 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00低剂量组（0.5 mmol/L AlCl3） 1.12±0.19 0.99±0.09 1.05±0.10 1.05±0.10 1.12±0.14*中剂量组（1.0 mmol/L AlCl3） 1.14±0.14 1.00±0.07 1.14±0.12# 1.07±0.15 1.18±0.13#高剂量组（2.0 mmol/L AlCl3） 1.26±0.22# 0.97±0.13 1.26±0.11# 0.97±0.15 1.23±0.10#

2.4 铝离子对CHIP和Hsp70蛋白表达的影响

与对照组相比，低、中和高剂量组细胞的CHIP和Hsp70蛋白含量表达升高，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表2。

 

表2 三氯化铝染毒后各组N2a细胞CHIP及Hsp70蛋白的相对表达量（±s，n=9）

  

［注］与对照组相比，*：P < 0.05；#：P < 0.01。

 

组别 CHIP Hsp70对照组 1.00±0.00 1.00±0.00低剂量组（0.5 mmol/L AlCl3） 1.23±0.18* 1.13±0.13*中剂量组（1.0 mmol/L AlCl3） 1.39±0.23# 1.18±0.17#高剂量组（2.0 mmol/L AlCl3） 1.54±0.22# 1.20±0.15#

3 讨论

随着染毒剂量的增加，N2a细胞活力逐渐下降。对照组和低、中、高剂量组的细胞活力百分比分别为（100.00±0.00）%、（93.93±0.04）%、（91.37±0.03）%和（78.45±0.10）%，中、高剂量组细胞活力较对照组下降，差异有统计学意义（P < 0.05，P < 0.01）。

3.2.4 在线指导功能模块。校内指导老师对学生顶岗实习过程中遇到的共性问题进行集中讲授，也可以实现对学生的个性问题进行针对性的辅导。实现指导老师与学生之间的实时沟通，做到问题及时解决，确保校内指导老师及时掌握学生实习动态。

NFTs形成是AD重要的病理特征之一，磷酸化tau蛋白为NFTs的重要组成成分［12］。LU等［4］研究发现，电解铝作业的退休工人淋巴细胞中tau-5、pThr181、pThr231含量明显高于对照人群，而贾志建等［5］通过在饲料中添加三氯化铝对小鼠进行长期铝染毒，结果发现低剂量铝可使tau-5、pThr231、pSer262、pSer396蛋白的表达明显高于对照组，但pThr181蛋白在不同剂量组之间的表达没有差异，这提示铝致tau蛋白磷酸化可能存在种属差异。KLATZO等［13］通过给新西兰大白兔注射铝盐，观察到NFTs聚集，而MIZOROKI等［14］通过小鼠腹腔注射麦芽酚铝并未观察到NFTs聚集，这说明tau蛋白异常磷酸化可能存在种属差异。那么，在不同种属来源的细胞tau蛋白磷酸化位点是否也存在差异呢?本研究选用小鼠源性的神经母细胞瘤细胞，用不同浓度三氯化铝进行染毒，结果显示高剂量组tau-5和中、高剂量组pThr231蛋白表达量明显高于对照组，并且低剂量组就可引起pSer396高表达；而pThr181、pSer262蛋白表达量在各剂量组之间的表达差异无统计学意义。王昊等［6］对SH-SY5Y细胞染铝，发现低剂量组就可使tau-5、pThr181、pThr231、pSer396蛋白表达量明显升高，pSer262蛋白表达在高剂量组明显升高。由此看来，体外实验不同细胞系的tau蛋白磷酸化位点也存在差异。

CHIP可以和Hsp70相互作用并抑制Hsp70的活性［15-16］。SHIMURA等［10］认为tau蛋白的磷酸化是tau蛋白被CHIP泛素化的信号，并且Hsp70是CHIP泛素化tau蛋白所必须的，因为Hsp70可以识别磷酸化的tau蛋白并且把其呈递给CHIP。那么，铝导致的tau蛋白异常磷酸化是否也可以被Hsp70识别并且把其呈递给CHIP呢？本研究发现，经不同浓度AlCl3染毒N2a细胞，CHIP和Hsp70蛋白的表达量均随染毒剂量的增加而升高，提示铝导致的tau蛋白磷酸化可能被Hsp70识别并把其呈递给CHIP。

综上所述，三氯化铝可以导致N2a细胞pThr231、pSer396、CHIP和Hsp70表达增高，这提示铝导致的tau蛋白异常磷酸化可能与UPS降解途径有关，但其具体机制尚不清楚，有待进一步研究。

传统的儿童钢琴教学，重技能轻审美，于是，出现了众多匪夷所思的学琴怪象，如已经考到十级，简单的视唱唱不准，听不出基本节奏型，对和弦性质无法分辨。这些怪象引起了众多学者的关注与反思。[6]在儿童钢琴的学习过程中，决不能以单纯的手指技巧训练为目的，而要以培养其良好的乐感，使其获取审美体验为目标。

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［5］贾志建，路小婷，潘宝龙，等. 慢性铝暴露对小鼠学习记忆及tau蛋白磷酸化的影响［J］. 环境与职业医学，2012，29（4）：203-205，209.

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