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胶体金免疫层析法快速检测乳制品中重金属离子铅

更新时间:2009-03-28

铅是对人类健康有巨大毒害作用的金属元素之一,对人体没有任何有益的功能。当人体中铅含量升高时,会破坏血红蛋白的合成,造成贫血、血压增高、肾损伤,造成孕妇流产和堕胎,破坏神经中枢,影响脑发育,影响生育能力,造成小孩发育迟缓和行为冲动[1-2]。乳品是一种营养成分齐全,含量高并且易被人体吸收的食品,已成为国民摄取营养物质的主要途径之一。随着现代农业的发展,重金属污染日益加重,随食物链进入动、植物体内,使得乳制品受到污染。

目前常见的重金属离子的检测方法主要是石墨炉原子吸收光谱法[3]、原子荧光光谱法[4]、电感耦合等离子体质谱法[5]等,这些方法需要费用高昂的大型仪器设备、专门的实验室、专业的操作技术人员和复杂的样品前处理过程,不适合现场快速筛选检测。

目前也有采用胶体金免疫层析法检测重金属离子铅,但是主要集中于粮食作物,针对乳制品的研究较少。因此本文基于胶体金免疫层析技术检测乳制品中重金属铅的含量具有必要性,并且对于乳品企业来说具有实际意义。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

干式加热器(HMG-GS,北京华安麦科生物技术有限公司)、胶体金读数仪(BMZ6000,北京美正生物科技有限公司)、200μL移液器(赛多利斯(上海)贸易有限公司)、计时器(北京华安麦科生物技术有限公司)、离心管(50mL、20mL,洁特)、枪头(BIOFIL)、一次性手套(麦迪康)、离心机(DM0412,大龙兴创实验仪器(北京)有限公司)、原子吸收光谱仪(PinAAcle 900T,perkinelmer公司)、涡 旋混合器(TZL-5013,苏州珀西瓦尔实验设备有限公司)、分析天平(PL-602E,梅特勒-托利多分析天平)、20目筛网。

最近,我不愿一直在家闲着,打算开家杂货店自食其力。只是我一人难以打理店面,所以期盼父亲能回来帮我一把。

1.2 主要试剂

重金属离子铅定性检测试纸条应用了竞争抑制胶体金免疫层析的原理,结构如图1所示。将金标抗体结合在金标垫/微孔中,将抗原(T线)和二抗(C线)固定于NC膜上,当待测样品加到样品垫/微孔中后,样本中抗原与金标抗体结合,通过层析作用向前移动。当移至T线区域时,偶联抗原和未结合金标抗体结合而被截留,聚集在检测线(T线)上,剩余金标抗体越过检测线(T线),在质控线(C线)处与二抗结合显色。通过可目测的胶体金标记物得到直接的显色结果或者配合仪器判读。

1.3 方法

1.3.1 检测原理

三氯甲烷、甲醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、EDTA等。

  

图1 重金属铅胶体金试纸条产品结构

1.3.2 检测方法

胶体金免疫层析法结果判定如图2所示。当T线和C线同时出现红色带时,若T线颜色较C线深或者颜色相同,表示样品中待检物质浓度低于检测限,或不含待检物质,检测结果为阴性;若T线颜色较C线浅或T线未显色,则表示样品中待检物质浓度高于检测限,检测结果为阳性;若C线未显色,检测结果无效,可能是因为操作过程不正确或试纸条已失效。

(1)生鲜乳:量取生鲜乳10mL,置于50mL离心管中,加入10mL三氯甲烷和1mL甲醇,振荡5min,4 000r/min离心5min;移取200μL的PBS溶液(0.01M)和200μL的 EDTA(0.5M),置于 2mL离心管中,加入40μL上清,振荡均匀,1min内待检。

(2)成品奶、奶粉、酸奶、奶酪样本处理方法。成品奶取样方法:量取10mL成品奶,置于50mL离心管中;奶粉取样方法:称取1g奶粉,置于50mL离心管中,加入9mL纯净水;酸奶取样方法:称取10g酸奶,置于50mL离心管中;奶酪取样方法:奶酪粉碎,称取1g粉碎的奶酪,置于50mL离心管中,加入9mL纯净水,震荡3min。按照上述方法取样后,加入10mL三氯甲烷和1mL甲醇震荡5min,4 000r/min离心 5min;移取 200μL的 PBS溶液(0.01M)和 200μL的EDTA(0.5M)于2mL离心管中,加入50μL上清,振荡均匀,1min内待检。

2017年中央军民融合发展委员会成立以来,地方和军队各级军民融合工作组织机构陆续建立,为军民融合国家战略的发展提供了组织保障。2015年初,由原总装备部、工业和信息化部、国防科工局、全国工商联共同领导的“全军武器装备采购信息网”正式上线,首次向社会公开军工涉密领域需求信息,一定程度上解决了供求双方信息不透明不对称的问题。但是,大部分武器装备科研生产招标对象要求具备一定资质。如何具备资质、入围“参军”名录,成为广大民营企业“参军”路上的透明玻璃。

1.3.2.2 检测步骤

(1)取所需数量的微孔和试纸条,并做好标记,将微孔置于40℃干式加热器上。

竞赛中,首先在赛前现场赛道调试时要注意赛道和障碍是否按照竞赛手册要求布置、光线是否良好,对于有所差别的障碍,可以向场地维护员提出场地维护申请。其次要充分利用正式比赛前的现场调试时间,通常情况下现场调试时间非常短,这就需要选手发挥赛前所积累的各种调试经验,以应对不同于以往训练环境的突发情况。最后,能否正常发挥出平时训练水平是至关重要的,这就需要发车人良好的心理素质,发车不要偏,不要受环境和心理影响过大,否则微小的心理波动都会使比赛结果产生巨大偏差。

(2)用移液器取200μ L待检样本加入微孔,并反复吸打,直至红色固体充分混匀进行孵育,计时5min。

(3)将试纸条立即插入微孔中进行反应,计时5min。

(4)取出试纸条,去除下端样品垫进行结果判读,实验完毕后将试纸条放入盒中密封,2℃~8℃保存。

2 结果与分析

2.1 结果判定

[19]Given current world conditions,those who can win the heart of Europe can prosper in the world.China’s diplomatic success in Europe is reflected by the fact that the“One Belt,One Road”initiative has been warmly welcomed.

选取上述5类样品中的一种代表性样品,分别添加重金属离子铅标准品,制成阳性样品。然后用3个批次的重金属离子铅的胶体金试纸条分别平行检测2次,检测结果均为阳性,对上述样品用相同的方法连续检测7天,检测结果均为阳性,说明重金属离子铅胶体金试纸条日内、日间的稳定性较好,试纸条保存在2℃~8℃,12个月保质期内仍可以特异性检出阳性,并且灵敏度没有降低。

1.3.2.1 样品前处理

2.1.2 读数仪读数判定

  

图2 结果判定依据

打开样品卡壳,将定量试纸条插入样品卡壳槽内,保证白色NC膜表面的两条色带在卡壳视窗中间。将样品卡壳插入读数仪样品卡槽中,按照仪器操作程序,点击触屏“检测”键或“TEST”按钮,读取结果。当样本不含待测物或低于检测限,检测结果为阴性;当样本所含待检物介于半检测限和检测限之间时,检测结果为疑似阳性;当样本所含待检物高于检测限时检测结果为阳性。

2.2 检出限实验

目前市场上乳制品种类繁多,本实验选取生鲜乳、成品奶、奶粉、酸奶和奶酪5类样品进行检出限实验验证。分别取三个批次的重金属离子铅胶体金试纸条进行添加实验,生鲜乳、成品奶、酸奶的添加量为 25μg/kg、30μg/kg、35μg/kg。奶粉和奶酪的添加量为 200μg/kg、300μg/kg、400μg/kg。上述加标样品重复6次进行检测,结果如表1所示。

由表1可知,生鲜乳和酸奶的检出限为25μg/kg,成品奶的检出限为30μg/kg,奶粉和奶酪的检出限为300μg/kg。由于每个乳制品生产加工的工艺不同,所以样品基质复杂多样,为了保证实验的科学、严谨和准确性,所以需要对每类产品的检出限进行评定,以确定相应样品的检出限。从表1可以看出,不同批次的试纸条检测结果存在一定的差异,所以在进行检出限评定时,选择3个批次的试纸条进行试验,保证实验结果准确。

国内外针对电动汽车充电站设施选址研究的文献较多,主要集中于对选址评价、布局规划、定容优化策略等方面。文献[3]建立了基于空间聚类和多层次模糊评估的电动汽车充电站选址模型。文献[4]研究了直觉模糊环境下社区电动汽车充电站选址决策优化。文献[5-6]分别考虑削峰填谷和计及碳排放,构建了电动汽车充电站多目标选址定容规划模型。此外,文献[7-8]提出基于云重心理论的电动汽车充电站选址规划评估方法,将定量和定性指标进行处理并建立了云模型。上述研究虽对电动汽车充电站构建了不同的选址模型,但未涉及具体应用场景研究,前期也缺少对充电站选址合理性的综合评价分析。

2.3 重复性实验

选取生鲜乳、成品奶、奶粉、酸奶和奶酪分别进行检测本底样品、1倍检出限和2倍检出限加标样品,选取3个批次的产品进行检测,每个样本使用不同批次的试纸条同时检测6次,结果如表2所示。

试纸条检测结果的判定分为肉眼判定和读数仪读数判定两种方式,具体的判定方式可根据实际情况进行选择。

由表2可知,用3个批次的重金属离子铅检测本底样品时,结果均为阴性,当添加量为1倍检出限和2倍检出限时,检测结果均为阳性。通过检测结果可知,结果一致,产品重复性好。

2.4 稳定性实验

2.1.1 肉眼判定

 

表1 胶体金免疫层析试纸条检出限实验结果

  

结果 n=6批次1 批次2 批次3阴性结果 阳性结果 阴性结果 阳性结果 阴性结果 阳性结果样本 添加量/μg·kg-1生鲜乳25 -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6)30 -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6)35 -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6)成品奶25 -(n=4) +(n=2) -(n=2) +(n=4) -(n=2) +(n=4)30 -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6)35 -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6)酸奶25 -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6)30 -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6) +(n=6) +(n=6)35 -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6) +(n=6) +(n=6)奶粉200 -(n=6) +(n=0) -(n=6) +(n=0) -(n=6) +(n=0)300 -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6)400 -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6)奶酪200 -(n=6) +(n=0) -(n=6) +(n=0) -(n=6) +(n=0)300 -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6)400 -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6)

 

表2 胶体金免疫层析试纸条对奶制品的重复性实验结果

  

结果 n=6批次1 批次2 批次3阴性结果 阳性结果 阴性结果 阳性结果 阴性结果 阳性结果样本 添加量/μg·kg-1-(n=6) +(n=0) -(n=6) +(n=0) -(n=6) +(n=0)25 -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6)50 -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6)0生鲜乳-(n=6) +(n=0) -(n=6) +(n=0) -(n=6) +(n=0)30 -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6)60 -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6)0成品奶-(n=6) +(n=0) -(n=6) +(n=0) -(n=6) +(n=0)25 -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6) +(n=6) +(n=6)50 -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6) +(n=6) +(n=6)0酸奶-(n=6) +(n=0) -(n=6) +(n=0) -(n=6) +(n=0)300 -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6)600 -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6)0奶粉-(n=6) +(n=0) -(n=6) +(n=0) -(n=6) +(n=0)300 -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6)600 -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6) -(n=0) +(n=6)0奶酪

2.5 特异性实验

为了检测重金属铅胶体金试纸条对其他重金属离子的识别能力及检测特异性,将常见的重金属离子汞、离子铬、离子铜、离子镉添加到上述5类样品中,与重金属铅胶体金免疫层析试纸条做交叉反应。检测结果显示,重金属铅胶体金试纸条能够清晰地识别铅离子,与其他几种重金属离子没有交叉反应,试纸条的特异性良好。

2.6 与仪器法对比实验

胶体金试纸条的检出限与仪器法的检出限存在一定的差异,目前我国食品中重金属的检测方法大部分企业采用GB 5009.12-2017《食品安全国家标准 食品中铅的测定》石墨炉原子吸收光谱法(该方法的检出限为0.02mg/kg,定量限为0.04mg/kg检测乳制品中的重金属离子铅。为比对两种测定方法,选择阴性样品和添加量为0.5mg/kg的阳性样本进行检测,这样能够有效地保证在标准之下两种方法均能有效检出,结果如表3所示。

2.2 两组新生儿3种疾病召回复筛、治疗随访情况比较 研究组新生儿的CH、PKU和G6PD缺乏症的召回复筛、治疗随访率均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

在例[1b]中,不仅有词汇隐喻“flood”,还有语法隐喻“a flood of relief”,其中的强度(intensity)被表征为物(thing),而情感被表征成了物的后置限定词(qualifier)。这与一致式“very relieved”形成对比:强度由副修饰语(submodifier)“very”表示,而“relieved”则是特征(epithet)。

由表3可知,两种方法检测结果一致,表明试纸条可用于生鲜乳、成品奶、奶粉、酸奶和奶酪中重金属离子铅的快速筛选检测。

 

表3 试纸条法和原子吸收光谱法检测结果对比

  

样品信息 添加质量分数/mg·kg-1试纸条法检测结果仪器法检测结果 /mg·kg-1生鲜乳 0 - 0成品奶 0 - 0奶粉 0 - 0酸奶 0 - 0奶酪 0 - 0生鲜乳 0.5 + 0.486 9成品奶 0.5 + 0.479 9奶粉 0.5 + 0.487 6酸奶 0.5 + 0.492 1奶酪 0.5 + 0.490 1

2.7 注意事项

为了杜绝检测过程中一些不适宜因素导致检测结果出现异常,需要注意以下几点:(1)不同批次试纸条、微孔、射频卡均不能混用。(2)产品为一次性消耗品,请在有效期内使用。(3)请勿触摸试纸条中央白色膜区。(4)微孔打开时不要用力过猛,以免有粉末飞出,打开后请尽快使用,以免影响检测结果。(5)所检测样本必须为均匀液体,不能有结块、发酵、酸败、沉淀等现象。(6)所有溶液使用前需摇匀,试剂B会有沉淀出现,但不影响结果。(7)溶液移取时请带保护性手套及口罩进行操作。(8)建议一次检测数量不要超过8个,超过8个可分批检测。(9)检测时避免阳光直射和电风扇直吹。(10)请勿用自来水、纯水及蒸馏水做阴性对照。(11)如发现阳性,检测结果需要使用法定的确证方法进行确证。

3 结 论

通过一系列实验,重金属离子铅胶体金免疫层析试纸条检测时间在15min内,生鲜乳和酸奶的检出限为25μg/kg,成品奶的检出限为30μg/kg,奶粉和奶酪的检出限为300μg/kg。批间重复性和批内重复性良好,检测结果与仪器法检测结果一致。方法简便,对人员专业技能要求相对较低,并且其灵敏度、稳定性和特异性等均达到了食品中污染物快速检测的要求,非常适用于乳品企业前期的筛选工作。

画像中的渥巴锡头戴花翎、身著朝服,但面容憔悴、神情凝重、眼神忧伤……,这也许是1771年在承德时渥巴锡的真实写照!

参考文献

[1] 朱晓霞.抗重金属镉、铅单克隆抗体、单链抗体的研制及单链抗体三维机构的模建[D].江苏:南京农业大学,2007.

[2] 刑常瑞.重金属与微囊藻毒素单克隆抗体制备和快速检测技术研究[D].江苏:江南大学,2015.

[3] 姚继军,杨仁康,陈建敏.采用石墨炉原子吸收光谱法测定不同乳制品中的铅[J].食品安全导刊,2015(31):28-30.

[4] 刘沛明,雷璇,林烨,等.微波消解——氢化物原子荧光光谱法测定乳制品中铅[J].检验检疫学刊,2014(2):56-57.

[5] 谭炜,安虹,李丹亚.电感耦合等离子体质谱法测定乳制品中铅·砷·镉·铬[J].安徽农业科学,2015(20):252-254.

 
赵小旭,柳家鹏,柴艳兵,张耀广,杨敏,滕燕,李曼,郭健
《粮食科技与经济》 2018年第03期
《粮食科技与经济》2018年第03期文献

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