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冰冻-解冻-去甘油过程红细胞形态变化与损伤相关性的探讨

更新时间:2009-03-28

Rh阴性、类孟买等稀有血型红细胞的冻存已在国内血站普遍开展,成为稀有血液资源有效保存的主要手段和临床稀有血型患者紧急抢救用血的重要来源和保障。虽然在红细胞冻存中普遍使用甘油溶液作为冷冻保护剂,但是在制备过程中还是会有相当数量的红细胞因为损伤而发生裂解,为此,笔者通过实验采集冰冻-解冻-去甘油过程红细胞形态变化和损伤的相关数据,探究两者的关联性及其制备质量提升的可能性。

材料与方法

1 标本来源 福建省血液中心采集制备6 d内的10对2 U滤白悬浮红细胞,配对滤白悬浮红细胞为ABO血型相同的Rh阳性血液,仅丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测不合格。

式中:M为累计甲烷产量(L·kg-1);P为甲烷产生潜势(L·kg-1);t为时间(d);Rmax为最大产甲烷速率(L·kg-1·d-1);姿为产甲烷延迟时间(d);e为自然对数 (2.718 28)。

换流器运行在对称状态下时,各换流阀的换相角主要受到交流侧电压和直流侧电流的影响,且并未计及换流器两侧谐波。在不对称情况下,换相角的计算过程需要考虑实际的触发情况以及直流侧电流二次谐波和交流侧电压三次谐波。以ab换相为例,换流器在换相过程中的等值电路如图3所示。

2 试剂和仪器 全自动红细胞处理仪(ACP215,美国血液技术公司),贺利式大容量低温离心机(Cryofuge6000i,赛默飞世尔科技(中国)有限公司),无菌接合仪(TSCD-Ⅱ,日本泰尔茂),血细胞计数仪(BC-3200,深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司),台式离心机(BASO 2000-2),可见分光光度计(723型,上海光谱仪器有限公司),冰冻血浆解冻箱(KJX-Ⅱ,苏州市医用仪器厂),-80℃超低温冰箱(MDF-U73V,日本三洋),57%复方甘油溶液(红细胞低温保护剂,北京博德桑特),9%氯化钠溶液(山东威高集团医用高分子制品股份有限公司),0.9%氯化钠注射液(广州费森尤斯卡比),红细胞添加液(MAP,山东威高集团医用高分子制品股份有限公司/广州费森尤斯卡比),红细胞保存袋(广州费森尤斯卡比),红细胞甘油化耗材(REF225,美国血液技术公司),红细胞去甘油耗材(REF236,美国血液技术公司),1 000 ml冷冻保存袋(四川南格尔生物科技有限公司),甘油检测试剂盒(北京瑞尔达生物科技有限公司),游离血红蛋白检测试剂盒(北京瑞尔达生物科技有限公司)。

3 方法

1 冰冻、解冻和去甘油过程红细胞体积的变化及甘油残留量的差异见表1。

3.5 留样:使用无菌接合仪依次留取浓缩红细胞、冻存前甘油化红细胞和复苏后甘油化红细胞样本;将0.9%氯化钠悬浮的冰冻解冻去甘油红细胞均分至4个红细胞保存袋,存放于4℃血库冰箱,分别作为制备完成0 h、6 h、12 h、24 h的留样标本;将MAP悬浮的冰冻解冻去甘油红细胞均分至5个红细胞保存袋中,存放于4℃血库冰箱,分别作为制备完成0 d、7 d、14 d、21 d、28 d的留样样本。

2 冰冻、解冻和去甘油过程红细胞上清游离血红蛋白含量的变化及不同制备方法间的差异见表2。

3.4 去甘油化:使用无菌接合仪将红细胞去甘油耗材(REF236)、复苏的配对甘油化红细胞、水浴平衡后的9%氯化钠溶液(160 ml)、0.9%氯化钠注射液(2 000 ml)和/或红细胞添加液(MAP)相连,在ACP215上去甘油生成0.9%氯化钠/ MAP悬浮的冰冻解冻去甘油红细胞。

3) 将差压变送器布置在差压装置上方,遇有高低压室内生成冷凝液时,依靠冷凝液与气体的密度差,让冷凝液自行流回母管。

3.2 红细胞甘油化:将配对浓缩红细胞与待添加的57%复方甘油溶液(根据浓缩红细胞重量及比容,由ACP215自动换算得到具体添加量)放入37℃水浴中平衡10 min,使其温差≤2℃,取出后使用无菌接合仪将其与红细胞甘油化耗材(REF225)相连,然后在ACP215上完成57%复方甘油溶液的添加(终末甘油浓度为40%),添加完成后于室温静置30 min,其中一袋静置后装入纸盒保存于-80℃超低温冰箱,另一袋静置后1 250 g离心10 min去除上清,再装入纸盒保存于-80℃超低温冰箱。甘油化红细胞冻存时间不少于90 d。

4 统计学处理 计量数据比较采用配对t检验;相关性分析,当相关系数|r|=1时为完全相关、0.8≤|r|<1时为高度相关,0.3≤|r|<0.8时为中度相关,|r|<0.3时为低度相关。P<0.05表示差异有统计学意义。

3.6 检测:①血常规检测:检测前轻柔地将标本进行颠倒混匀,每个样本平行检测2遍,检测结果取平均值。②上清游离血红蛋白检测:检测前将样本1 000 g离心2 min,吸取上清液,再将上清液1 000 g离心5 min,吸取上清液检测。

结 果

3.1 浓缩红细胞制备:将配对滤白悬浮红细胞2 245 g离心5 min,分离去除上清液制备生成浓缩红细胞(HCT:75%±5%),使用无菌接合仪将配对浓缩红细胞汇集至容量1 000 ml的冷冻保存袋中混匀,再均分至2个1 000 ml的冷冻保存袋。

3.3 复苏:将-80℃超低温冰箱中取出的配对甘油化红细胞,连同去甘油化使用的9%氯化钠溶液(160 ml)和0.9%氯化钠注射液(2 000 ml)置于37℃水浴中解冻平衡20 min,使其温差≤2℃, 其间轻柔摇晃甘油化红细胞血袋以加速其解冻。

按:段注:“《说文》生孰字本但作孰,后人加火以别生熟之熟,而孰但为谁孰字矣。曹宪曰:‘顾野王《玉篇》始有熟字’。”《韵会》用的是后起的“熟”字来承担“生熟”这一义项,“孰”专表本义。

3 冰冻、解冻和去甘油过程红细胞体积的变化与上清游离血红蛋白含量的关系见表3。不同方法制备冰冻解冻去甘油红细胞贮存过程红细胞损伤情况的分析,见表4及图1、2。

 

表1 冰冻、解冻和去甘油过程红细胞体积的变化及甘油残留量的比较(±s)

  

注: 表中P值为制备方法1与方法2相比

 

冰冻解冻去甘油红细胞方法1 10 95.7±3.42 137.0±4.54139.2±4.2797.7±3.2213.6±0.40 17.0±0.69 15.7±1.2613.8±0.870.24±0.11方法2 10 95.7±3.42 138.0±4.69139.6±3.9798.0±3.2913.6±0.40 17.3±0.74 15.8±1.1514.1±0.680.19±0.10合计20 95.7±3.33 137.5±4.52139.2±4.0297.8±3.1713.6±0.40 17.2±0.71 15.7±1.1713.9±0.77 P值 <0.01>0.05<0.05<0.05>0.05>0.05>0.05 n MCV(fl)RDW-CV(%)甘油残留量(g)浓缩红细胞甘油红(冻前)甘油红(解冻后)冰冻解冻去甘油红细胞浓缩红细胞甘油红(冻前)甘油红(解冻后)冰冻解冻去甘油红细胞

 

表2 冰冻、解冻和去甘油过程红细胞上清游离血红蛋白含量的比较(±s)

  

注: 表中P值为制备方法1与方法2相比

 

甘油化 冰冻解冻 去甘油化 合计方法110FHb(g)1.05±0.250.21±0.192.61±0.493.87±0.62率(%)2.10±0.570.42±0.395.16±0.847.68±1.25方法210FHb(g)1.05±0.270.24±0.162.05±1.053.99±1.01率(%)2.11±0.580.47±0.314.06±2.076.63±2.16 n FHb(g)1.05±0.250.22±0.172.33±0.853.93±0.82率(%)2.10±0.560.44±0.344.61±1.647.16±1.80构成比(%)30.78±10.476.02±4.1163.20±10.99100.00 P值 >0.05>0.05>0.05>0.05合计20

 

表3 红细胞体积的变化与上清游离血红蛋白含量的比较(±s)

  

n 红细胞体积变化FHb(g)r值值(fl) 率(%)方法11043.55±2.8145.59±3.573.87±0.62-0.3448方法21043.95±3.0546.03±3.953.99±1.01-0.6617合计2043.75±2.9045.81±3.673.93±0.82-0.5344

 

表4 冰冻解冻去甘油红细胞保存期间上清游离血红蛋白含量(mg)变化的比较(±s)

  

MAP悬浮n0.9%氯化钠悬浮7 d14 d21 d28 d6 h12 h24 h方法1560.50±13.9494.00±16.01125.50±16.20198.33±32.70558.33±5.7564.00±6.4580.83±9.70方法2564.50±22.94118.00±39.55162.00±53.30264.50±93.08569.83±13.2396.33±20.77136.00±29.40 P值 >0.05>0.05<0.05<0.05>0.05<0.05<0.05 n

讨 论

甘油(丙三醇)是国内血站普遍使用的冻存Rh阴性、类孟买等稀有血型红细胞的冷冻保护剂,是一种能够穿透细胞膜的细胞内冷冻保护剂,可有效减少红细胞冷冻时发生冰晶损伤和溶质损伤;同时甘油又是一种高渗溶液,甘油化过程通过细胞膜渗透进入红细胞内使其体积不断增大,直至细胞内外甘油浓度达到平衡,去甘油化过程则是通过细胞外渗透压的梯度递减,使红细胞内甘油不断渗出而实现红细胞体积逐渐复原。本实验数据显示,红细胞破坏主要集中在去甘油化和甘油化过程,尤以去甘油化过程为甚,同时红细胞破坏与甘油化红细胞体积变化率呈现负相关关系,由此可见细胞外渗透压的改变对冰冻红细胞质量影响较大,是与红细胞破坏率直接相关的主要外在因素[1],而红细胞的变形能力则是影响红细胞破坏率的内在因素。

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图1 MAP悬浮冰冻解冻去甘油红细胞上清血红蛋白含量

  

图2 0.9%NaCl悬浮冰冻解冻去甘油红细胞上清游离血红蛋白含量

目前冰冻红细胞有两种不同的制备方法,一种是保留甘油化红细胞外多余的甘油溶液进行冻存,另一种则是离心去除甘油化红细胞外多余的甘油溶液后再冻存(此为ACP215操作手册中推荐使用的制备方法[2])。前者可简化冰冻红细胞的制备操作[3],而后者可使冰冻红细胞体积减小,减少冰箱占用面积并能缩短冰冻时间[4],又可节省去甘油程序中甘油从细胞内外渗的时间[5] ,国内文献报道两种做法制备生成的冰冻解冻去甘油红细胞在细胞形态和质量指标上均无明显差异[4],因此后者被多数血站所采用。但是通过实验发现,在排除甘油残余量对红细胞体积变化影响的前提下,后者制备生成的甘油化红细胞及其冰冻解冻去甘油红细胞的平均体积均高于前者(P<0.01,P<0.05),虽然两种制备方法在红细胞破坏上的差异无统计学意义,但在冰冻解冻去甘油红细胞贮存质量的比较上,后者红细胞破坏率呈现高于前者的总体趋势,且在贮存终末期两者的差异有统计学意义。究其原因应与制备过程的离心操作直接相关,红细胞具有强大的变形能力,在动脉循环中能够忍受液体剪切力的作用,还能在微循环中忍受很大的扭曲变形,却不破裂或丢失其完整性,这源于细胞膜及其细胞骨架[6]。红细胞膜骨架(erythrocyte membrane skeleton)是一种能变形的圆盘状网架结构,主要成分为血影蛋白(又称收缩蛋白)和肌动蛋白。红细胞膜附着在上面,有助于红细胞形状的改变。冰冻红细胞制备中甘油化红细胞体积较原始体积净增大(45.81±3.67)%,细胞骨架已被极度拉伸,在此种情况实施离心操作,势必使细胞骨架中的细微结构因离心剪应力的作用而发生不可逆的损伤,较之未离心的情况,红细胞平均体积的增大应是这一作用的直观表象,导致的直接后果就是随着血液保存时间的延长,制备生成的冰冻解冻去甘油红细胞的溶血率增高,红细胞稳定性下降,这也印证了冻存前省略细胞外多余甘油溶液的去除操作不仅可简化操作、更重要的是可以增加红细胞稳定性的推断[5]

参 考 文 献

1 杨冬燕,段恒英,王娟娟.全自动细胞处理系统制备冰冻红细胞的关键控制点及效果评价[J] .重庆医学,2009,37(9):1078-1082.

2 Haemonetics Corporation. Haemonetics ACP215 Glycerolization Procedure-Operation Mannual-(P/N 85278-30,July 2007). France: Haemonetics Corporation 16-17.

3 Lelkens C C M, de Korte D,Lagerberg J W M.Prolonged post-thaw shelf life of red cells frozen without prefreeze removal of excess glycerol[J].Vox Sang,2015,108(3):219-225.

4 王惟,谭菲,柴婷婷.冰冻红细胞冰冻前去除甘油的效果研究[J] .临床输血与检验,2015,17(4):349-350.

5 张雅莉,张贝,靳朝霞, 等.冰冻解冻去甘油红细胞制备过程质量控制方法[J].临床输血与检验,2014,16(1):68-69.

6 姚伟娟.流体剪切力与红细胞膜骨架形成之间的关系研究进展.中国科技论文在线,2013,http://www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201303-83.

 
林豪,黄文华,江伟梅,林建霞,陈灯锦
《临床输血与检验》 2018年第02期
《临床输血与检验》2018年第02期文献

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