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深圳地区急性上吸呼道感染住院患儿人偏肺病毒感染现状及基因分析*

更新时间:2009-03-28

人偏肺病毒(human metapneumo virus,hMPV)是2001年荷兰学者首次从儿童呼吸道感染中分离出的一种新副黏液病毒,为一种不分节段的单链RNA病毒[1]。随后全球各地相继报道了儿童感染病例,hMPV是一种全球广泛流行的呼吸道病毒,是导致婴幼儿及免疫缺陷患者呼吸道感染的重要病原之一,也是导致婴幼儿急性呼吸道感染的发病率、住院率和病死率升高的重要原因之一[2]。国内外很多研究结果显示,不同地区、不同时期、不同人群和不同年龄人群中hMPV感染情况和临床流行特征均有所不同。为此,本文应用RT-PCR技术对2015年6月~2016年6月深圳地区两家区属医院AURTI住院患儿的呼吸道分泌物进行hMPV检测,以探讨本区hMPV感染的流行病学及流行株型别,现报告如下。

材料与方法

1 一般资料 收集2015年6月~2016年6月在深圳市龙华区人民医院和福田人民医院因AURTI住院患儿的鼻咽吸取物或咽试子标本1 720份。ARTIs疾病临床诊断标准均依据诸福棠主编的《实用儿科学》第7版[3]。患儿年龄3个月~6岁,平均1.5±3.9岁,其中男童792例,女童928例。按患儿年龄分为<1岁组(639例)、1~2岁组(421例)、3~4岁组(357例)和5~6岁组(303例)4组。同时收集同期健康儿童呼吸道标本60份。4组患儿性别、疾病构成及年龄差异均无统计学意义(P>0.05),标本采集均征得患儿家长签定知情同意书。

2 试剂与仪器 AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit由美国AxyPrep生物技术有限公司提供;One-step RT-PCR试剂盒(QIAGEN);RNA酶抑制剂(美国Promega);琼脂糖(西班牙BIOWEST);DNA Marker(TIANGEN);CEQ8 8 0 0测序仪由美国BECKMAN公司提供;PowerPacHC型电泳仪由美国BIORAD公司提供;White/Uhraviolet Transilluminator(美国UVP)。

3 方法

(1) 转子系统的各阶固有频率均满足工程上避开激振源频率15%的要求,且无倍频关系存在,所以从振动角度来看,转子不会产生共振,转子结构是安全的。

证明 类似地,时不变永久性离散资源分配的最优方法应该满足极大相容公理组ESCA2,即要求分配方法满足{Ax.1,Ax.5,Ax.6,Ax.7}.

3.4 引物设计:hMPV筛查引物参照国际参考株序列,用Primer5.0软件设计,并通过Internet在NCBI上用BLAST初步验证其特异性。hMPV阳性标本扩增M基因片段(416 bp),逆转录为cDNA后,hMPV-F:5'-CCCTTTGTTTCAGGCCAA-3',hMPV-R:5'-GCAGCTTCAACAGTAGCTG-3',引物均由Invitrogen公司合成。

3.3 hMPV核酸提取:用AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit提取病毒核酸。具体操作严格按说明书进行,提取的病毒核酸于-80℃冻存备用。

综上所述,在医院体检中心实施PDCA循环法护理质量管理,能够转变护理人员工作态度,提升护理质量及护理满意度,充分发挥出各护理人员及各护理部门的主要功能。

3.2 标本处理:将采集的鼻咽抽吸物或咽拭子置于3.0 ml 病毒保护液(含100 U/ml青霉素,100 U/ml链霉素,2 000 U/ml两性霉素B),置-80℃冰箱待检。解冻后置涡旋振荡器上充分振摇2 min,然后置离心机13 400 r/min离心15 min,取沉淀作病毒核酸提取。

3.1 标本采集:AURTI住院患儿入院24 h内由临床医生或护士用一次性无菌吸管抽取患儿鼻咽部抽吸物,或用一次性的咽拭子刮取患儿咽部分泌物于无菌管内,对照组儿童均采集咽拭子标本,及时送检。

在机电安装造价管理中,必须要严格控制设备材料情况,所以在原材料管理阶段,必须要在合同中进行明确,尤其是甲方在原材料采购中的作用,应该按照市场价格、产品质量等,确定造价管理的基本方向,避免在原材料管理中出现缺斤少两的问题,并且原材料的性能可以满足预期要求。

3.5 hMPV的筛查:用One-step RT-PCR Kit进行hMPV核酸片段扩增。扩增条件:反转录:50℃,30 min;预变性:95℃,15 min;以94℃,45 s;55℃45 s;72℃ 1 min循环40次,最后72℃延伸10 min。扩增产物以1.0 g/dl的琼脂糖凝胶电泳检测。

3.6 核酸序列测定及比对分析:随机选取6份RT-PCR阳性产物切胶纯化,用BECKMANCOULTER公司生产的CEQ8800测序仪进行正反测序,将测得的序列与GenBank公布的hMPV核酸序列进行比对。采用DNAStar软件中EditSep和Mega4.1 Beta做进化树分析,并采用Clustal W法进行序列比较分析。

1 ALRTI住院患儿hMPV阳性率 1 720例AURTI住院患儿的鼻咽吸取物或咽试子标本共检出 hMPV阳性标本362例,阳性率为21.05%(362/1 720),其中男童阳性率为10.06%(173/1 720),女童阳性率为10.99%(189/1 720),男女患儿阳性率之间差异无统计学意义(χ2=0.917,P>0.05),而60例健康儿童hMPV均为阴性。

结 果

4 统计学处理 应用SPSS22.0软件进行统计学处理,计数资料用率(%)表示,组间比较采用χ2检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

在这次活动中,小亮没有把自己的学习目标张贴在学习目标墙上。我问他为什么不张贴出来,他说他不能确定自己的起点在哪里,也不知道自己该有一个什么样的目标,所以还没有制订出学习目标。于是,我给他提了3个建议:霸气点,比如总成绩进入班级前三;中庸些,比如总成绩进入班级前百分之五十;如果确实制订不出目标,也还是要勤奋学习,看自己真实的起点到底在哪里。

3 AURTI住院患儿感染hMPV的时间分布 1~3月AURTI住院患儿感染hMPV阳性率最高(49.74%),其次为10~12月份(12.83%),4~9月份阳性率最低(1.54%~2.76%),不同月份(除4~9月份外)h M P V阳性率之间差异有统计学意义(χ2=3.692~11.973,P<0.01~0.05),见表2。

 

表1 362例不同年龄AURTI住院患儿hMPV阳性率(n,%)

  

注:*<1岁组与其他组比较;#1~2岁组与3~4岁组和5~6岁组比较;@3~4岁组与5~6岁组比较

 

(岁) 例数(n) hMPV阳性率 χ2值 P值<1639 201(31.46) 6.105~11.973* <0.05~0.001 1~2 421 97(23.04)3.691~4.085# <0.05 3~4357 36(10.08)5~6303 28( 9.24) 1.205@ >0.05年龄

2 不同年龄AURTI住院患儿hMPV阳性率 <1岁组AURTI住院患儿hMPV感染阳性率为31.46%,明显高于其他组,差异有统计学意义(χ2= 6.105~11.973,P<0.05~0.01);1~2岁组阳性率高于3~6岁组,差异有统计学意义(χ2= 3.691~4.085,P<0.05);而3~4岁组与5~6岁组阳性率之间差异无统计学意义(χ2=1.205,P>0.05),见表1。

 

表2 AURTI住院患儿感染hMPV的时间分布(n,%)

  

注:*1~3月与其他组比较;@4~6月与7~9月比较;#10~12月与4~9月比较

 

月份 例数(n)hMPV阳性率 χ2值 P值1~3571 284(49.74)7.927~15.038* <0.05~0.01 4~6398 11( 2.76)7~9260 4( 1.54)1.205@ >0.05 10~1249163(12.83)3.691~4.085# <0.05

4 hMPV病毒核苷酸测定和序列分析 6株hMPV阳性毒株与19株hMPV代表株的基因序列进行BLAST比较,核苷酸同源性为91.0%~100.0%,6株hMPV毒株之间核苷酸同源性为90.8%~98.8%。进化树分析结果显示:SZ201601~03与中国广州毒株GZ01(GQ153651)在同一分支上,基因型为A型,属于A2b基因亚型;SZ201604~05与Hebei2012-2(KM094179)在同一分支上,属于B基因型,属于B1亚型,而SZ201606与BJ1816(DQ843658)在同一分支上,属于B基因型中的B2亚型。

讨 论

人偏肺病毒的蛋白主要有核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、融合蛋白、聚合酶、附加糖蛋白、基质蛋白2和小疏水蛋白,国外报道所分离得到的hMPV可分为两个基因型,而每个基因型又可分为两个亚型。毛华伟等[4]在国内率先成功分离出6株hMPV,从活病毒水平证实hMPV是导致中国儿童呼吸道感染的病毒性病原体。

不同国家和地区儿童hMPV感染率存在很大差异,如巴西乌贝兰迪亚地区5岁以下呼吸道疾病患儿hMPV阳性率为12.3%[5],德国的hMPV阳性率为3.0%[6],阿根廷[7]、美国[8]等也有相继报道,中国2009~2013年ALRTI住院患儿hMPV阳性率为1.5%[9],提示该病毒呈现全球流行,且阳性率之间存在很大差异性。国内不同地区hMPV感染阳性率也不同,如陈昕等[10]报道重庆地区为25.9%,朱小华等[11]报道江苏泰州地区为2.4%,金玉等[12]报道南京地区为5.5%,朱汝南等[13]报道北京地区为30.3%。而本研究结果显示,2015年6月~2016年6月深圳地区AURTI住院患儿hMPV阳性率为21.05%(362/1720),男女儿童阳性率的差异无统计学意义(P>0.05),且阳性检出率在国内位于较高水平,这可能与不同国家和地区所调查的时间、地区、人群、标本来源及采样和检测方法等因素不同有关,也这表明hMPV是引起本地区AURTI住院患儿感染的主要病原之一。

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任何人群均可感染hMPV,van den Hoogen等[1]报道5岁以下儿童都感染过hMPV,且可反复感染。法国Freymouth等[14]报道住院儿童hMPV感染多发于3个月~1岁年龄组。本研究结果显示,深圳地区AURTI住院患儿hMPV感染多发于1岁以下(31.46%),其次为1~2岁患儿,3岁以上患儿hMPV阳性率很低,与相关文献报道相符合[15],这可能与2岁以下患儿的免疫力低、免疫系统发育不全或缺失等有关。

研究表明,hMPV感染在全世界范围内流行且阳性率存在很大差异,但在同一地区内hMPV感染具有一定的规律性和周期性的,多发于冬春季节。如荷兰地区当年11月~次年5月为hMPV发病高峰,美国Falsey等[16]报导纽约地区12月~3月为hMPV高发时间。本研究结果显示,2015年6月~2016年6月深圳地区ALRTI住院患儿hMPV感染高发于1月~3月,其次为10月~12月,与国内外相关文献相一致[17,18],这可能与冬春季节天气比较潮湿,有利于hMPV生长繁殖有关。

本研究随机选取6份hMPV阳性产物进行切胶纯化和测序,然后将测得的序列与GenBank中已公布的19株hMPV M基因的核苷酸序列比较,核苷酸同源性为91.0%~100.0%,6株hMPV毒株核苷酸之间同源性为90.8%~98.8%。基因进化树分析结果显示,6株hMPV阳性毒株中有3株属A基因中的A2b亚型,2株属B基因中的B1亚型以及1株为B2亚型,这表明了2015年6月~2016年6月深圳地区AURTI住院患儿hMPV感染同时存在A和B两个基因型流行,这可能与深圳地区是一个流动人口最密集的地区有关。

综上所述,hMPV是深圳地区ALRTI住院患儿感染的重要病原之一,好发于冬春季节和1岁以下儿童,且存在A和B两个基因型同时流行,给ALRTI患儿的诊断和治疗带来极大困难。因此,各地临床医生应高度重视ALRTI住院患儿体内AURTI检查,以便对AURTI住院患儿hMPV感染作出快速而准确的诊断。

参 考 文 献

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3 胡亚美,江载芳,主编.诸福棠实用儿科学[M].第7版.北京:人民卫生出版社,2002:117l-1180.

4 毛华伟,杨锡强,王莉佳,等.重庆地区急性呼吸道感染患儿鼻咽吸取物标本中人偏肺病毒的分离研究[J].中华儿科杂志,2007,45(1):42-45.

5 Cameiro B M,Yokosawa J,Arbiza J,et al. Detection of all four human metapneumovirus subtypes in nasopharyngeal specimens from children with respiratory disease in Uberlandia,Brazil[J].Med Virol,2009,81(10):1814-1818.

6 Reiche J,Jacobsen S,Neubauer K,et al.Human metapneu movirus:insights from a ten year molecular and epidemiological analysis in Germany[J].PLoS One,2014,9(2):e88342.

7 Velez Rueda A J,Mistchenko A S,Viegas M,et al.Phylogenetic and phylodynamic analyses of human metapneumovirus in Buenos Aires(Argentina)for a three year period(2009-2011)[J].PLoS One,2013,8(4):e63070.

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10 陈昕,张志勇,李荣培,等.重庆地区急性下呼吸道感染住院患儿人偏肺病毒感染的流行学研究[J].中国循征儿科杂志,2010,5(4):256-262.

11 朱小华,许广杨,李为春.2014-2015年泰州地区急性呼吸道感染病毒病原学研究[J].临床肺科杂志,2016,21(10):1912-1914.

12 金玉,张静,赵德育,等.南京地区儿童人偏肺病毒感染的流行病学及临床特征分析[J].中华实验和临床病毒学杂志,2011,25(1):11-13.

13 朱汝南,钱渊,邓洁,等.北京地区六岁以下儿童急性呼吸道偏肺病毒感染[J].中华儿科杂志,2003,41(6):441-444.

14 Freymouth F,Vahret A,Legrand L,et al.Presence of the new human metapneumovirns in French children with bronchiolitis[J].Pediatr Infect Dis J,2003,22(1):92-94.

15 盛曙君.呼吸道感染患儿人偏肺病毒的感染情况[J].浙江预防医学,2013,25(1):65-66.

16 Falsey A R,Erdman D,Anderson L J,et al.Human metapneumovirus infectionsin young and elderly adults[J].J Infect Dis,2003,187(5):785-790.

17 张云宏,孙宇,贾云霞,等. 太原地区急性呼吸道人偏肺病毒和人博卡病毒感染患儿临床特征分析[J].临床儿科杂志,2016,34(2):93-95.

18 刘爱玲,谭辉赟,吴敏,等. 深圳汕头地区呼吸道感染患儿人偏肺病毒的检出及病原学初步研究[J].现代检验医学杂志,2014,29(6):32-40.

 
刘爱玲,刘淑燕,刘军,朱彩云,郭龙华
《临床输血与检验》 2018年第02期
《临床输血与检验》2018年第02期文献

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