0 引言

肉孢子虫病是由肉孢子虫科肉孢子虫属(Sarcocystis)原虫引起的一种食源性人兽共患寄生虫病，呈现世界性分布，感染率较高[1-3]。文献[2-6]报道目前能够感染猪的肉孢子虫有3种，即米氏肉孢子虫(S.miescheriana)、猪人肉孢子虫(S.suihominis)和猪猫肉孢子虫(S.porcifelis)，其中，米氏肉孢子虫对猪具有明显的致病性，猪人肉孢子虫对人有一定的致病性，而猪猫肉孢子虫作为有效种尚存争议。国内外对于肉孢子虫的鉴定，通常先经过病原形态学初步鉴定，再辅助流行病学调查和分子生物学鉴定等多种方法综合分析，从而得出可靠结论[4-7]。

肉孢子虫寄生于多种动物和人的肌纤维、脏器血管内皮细胞、小肠和胆管等部位，会引起仔猪发热、消瘦、贫血、呼吸困难和运动障碍，导致母猪泌乳量降低和流产，严重时出现死亡[3,8-9]。人体感染后，因个人情况不同，有的表现消化道症状，有的头痛、发热，严重者出现贫血、肌肉疼痛，甚至局灶性心肌炎、嗜酸性粒细胞增多等现象[10-14]。此外，由于肉孢子虫寄生在猪的肌纤维内产生包囊毒素，会引起食物中毒[1,14]，这使得受感染猪肉的食用价值明显降低。

据文献报道，目前能感染人的肉孢子虫有猪人肉孢子虫、人肉孢子虫(S.hominis)、内氏肉孢子虫(S.nesbitti)和黑氏肉孢子虫(S.heydorni)共4种[13-14]，其中,黑氏肉孢子虫是最近被确定为在牛和人间循环感染的新种[15]。米氏肉孢子虫和猪人肉孢子虫在光学显微镜下可见：包囊平行于肌纤维，呈两端略尖的棒状或梭形，大小为0.53～1.25 mm，肉眼不容易辨别[2-3]。目前，猪肉占中国人消费肉类的64%，但是对市售猪肉中肉孢子虫感染情况的报道比较少，猪源肉孢子虫分子流行病学方面的数据更是缺乏[3,12]。因此，分析中国猪源肉孢子虫流行的种类和亚型，具有重要的兽医公共卫生意义。本文通过压片镜检和巢式聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术，对从洛阳市区不同超市和菜市场随机采集的164份市售猪肉样品，进行了肉孢子虫感染情况调查和病原种类鉴定，为评估猪源肉孢子虫对猪场的危害和对人的感染风险提供重要的参考数据。

为了处理重叠峰严重的标记荧光蛋白信号，提出了具有可调的新阈值函数.经过仿真实验，发现新可调阈值函数去噪质量优于传统的硬、软阈值函数，同时也证实具有可调特性的新阈值公式在处理重叠峰较严重的数据时，具有更好的去噪效果.

1 材料与方法

1.1 采样

在2015年4月至2016年11月期间，随机采集由洛阳市3个生猪屠宰厂供应的新鲜猪瘦肉，分布于涧西区、西工区、洛龙区、老城区不同超市和菜市场。每个售肉点每次采集100～200 g的猪肉，装入食品保鲜袋内，编号，并做好记录，及时带回实验室分析。

1.2 肌肉压片镜检

剥离每份新鲜肉样上附着的肌膜和脂肪组织，在日光灯下肉眼观察肉样表面是否有白色线状或点状物的可疑虫体存在，如果有，则剪下压片镜检；如果没有，则随机沿着肌纤维方向剪取米粒大小的肉样，置于载玻片上，用盖玻片稍加用力压至半透明。每份肉样在不同位置分点取样做成20张压片，逐个在 4×10倍和10×10倍显微镜下进行肉孢子虫包囊筛查、计数[16-18]。阳性样品进行显微数码拍照，并用镊子将其剥离至干净的1.5 mL离心管内，做好标记后放入-20 ℃冰箱内保存，准备做进一步分子鉴定。

在任何一块被检肉样上发现肉孢子虫包囊，即判为阳性；未发现肉孢子虫包囊的为阴性。参考猪肉旋毛虫检疫标准，以每份肉样的20张压片为单位，计算肉孢子虫感染强度：检出包囊3个以下的，定为轻度感染；4～7个的定为中度感染；8个以上的定为重度感染[18]。

1.3 肌肉组织中肉孢子虫包囊基因组DNA的提取

按照操作说明书，用动物组织基因组DNA提取试剂盒(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)对镜检包囊阳性的肉样进行基因组DNA提取，然后于-20 ℃保存备用。

1.4 巢式PCR扩增与测序

用DNASTAR 7.0生物软件对猪、牛、水牛、骆驼和野鹿源不同种肉孢子虫的18S rRNA序列进行比对分析，在其保守序列区用Oligo 6软件设计肉孢子虫属特异性巢式PCR引物(SAR18SN1F/R、SAR18S2F/R)，引物序列见表1。然后送往上海生工生物有限公司合成部进行合成。

罗译：I appreciate his ability to act in accordance with the old tradition of learning...[6]65

 

表1 巢式PCR引物序列

  

引物名称引物序列(5'→3')扩增长度/bpSAR18SN1F(外上游引物)GGTAAGCTTTTATACGGCGA1700SAR18SN1R(外下游引物)CAAAACTTTCCATTCCGCAC1700SAR18S2F(内上游引物)TACTACATGGATAACCGT1122SAR18S2R(内下游引物)ATTCCTTTAAGTTTCAGC1122

以肉孢子虫包囊阳性样品基因组DNA为模板，用2×Taq Master Mix和内、外引物在ABI 9700型PCR仪内进行巢式PCR扩增反应。反应条件：第1轮扩增反应条件为94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性 40 s、55 ℃退火40 s、72 ℃延伸2 min，进行35个循环，最后再72 ℃延伸10 min。然后取2 μL第1轮PCR产物作为模板，进行第2轮扩增，反应条件为94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性40 s、56 ℃退火40 s、72 ℃延伸90 s，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。反应全部结束后将第2轮PCR产物进行琼脂糖凝胶(质量分数为1%)电泳检查。最后将第2轮阳性PCR产物送到上海生工生物有限公司进行双向测序。

1.5 基于18S rRNA 序列分析

对镜检肉孢子虫包囊阳性样品的18S rRNA进行巢式PCR扩增，部分扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。由图2可知：镜检阳性样品均扩增出目的片段，其大小在1 100 bp左右。从A、B、C三个屠宰厂各挑取7份巢式PCR阳性样品进行测序，最终得到14个肉孢子虫分离株完整准确的18S rRNA序列。

2 结果

2.1 洛阳市区猪源肉孢子虫的感染状况

本次调查的洛阳市涧西区、洛龙区、西工区和老城区4个区共164份市售新鲜猪肉，肉眼均看不出明显的包囊。压片镜检下观察到猪肉中的肉孢子虫包囊如图1所示。由图1可以看出：肉孢子虫包囊均平行于肌纤维寄生，视野下包囊内充满大量颜色偏暗、呈颗粒状均匀分布的慢殖子，包囊外观主要为棒状或柳叶状，其大小为(367～1 976) μm×(176～246) μm。

  

(a) 棒状包囊(b) 柳叶状包囊

图1 压片镜检下观察到猪肉中的肉孢子虫包囊(箭头所指)

洛阳市区猪源肉孢子虫感染情况如表2所示。此次调查共检猪肉样品164份，包囊检出数为44份，总检出率为26.8%。本次调查的肉样分别来自A、B、C 三个生猪屠宰厂，均检出肉孢子虫包囊。洛阳市4个区均检出肉孢子虫包囊，检出率为13.6%～31.2%，涧西区和洛龙区的检出率明显高于西工区和老城区(P<0.05)。44份感染肉孢子虫的样品中，有34份为轻度感染，占检出总数的77.27%；有9份为中度感染，占检出总数的20.45%；仅有1份为重度感染。说明洛阳市市售猪肉中肉孢子虫感染比较普遍，多为轻度和中度感染。

 

表2 洛阳市区猪源肉孢子虫感染情况

  

市区生猪屠宰厂检出率(阳性数/样品数)感染强度/份轻度感染中度感染重度感染涧西区A20.5%(8/39)620B40.9%(9/22)810C43.8%(7/16)421西工区A0(0/7)000B30.8%(4/13)310C28.6%(2/7)200洛龙区A25.0%(4/16)400B45.5%(5/11)320C18.2%(2/11)110老城区A0(0/7)000B22.2%(2/9)200C16.7%(1/6)100总计26.8%(44/164)3491

  

M.DNA marker;1～7.镜检阳性样品,目的片段为1 122 bp;8.阴性对照。 图2 18S rRNA巢式PCR部分扩增产物电泳结果

2.2 猪源肉孢子虫的分子鉴定结果

用ChromasPro 1.7.7 (http://technelysium.com.au/wp/chromaspro/)对序列进行校对和拼接；用BioEdit 7.04 (www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html)对不同拼接序列进行编辑。为了构建系统发育树，从GenBank下载相关肉孢子虫和犬新孢子虫18S rRNA序列，其中犬新孢子虫作为种外群，然后用MEGA 7(http://www.megasoftware.net/)和DNAStar 7.1.0 (http://www.dnastar.com/t-dnastar-lasergene.aspx) 软件进行序列比对和系统发育分析[19]。另外，每个样品的18S rRNA序列使用BLAST在线分析工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)进行搜索分析。本研究将来自A、B、C三个屠宰厂的猪源肉孢子虫代表性分离株的18S rRNA序列提交GenBank，并获得序列ID号(KX929089-KX929094)。

在语言学大师索绪尔的眼中，符号是由 “能指”（signifier）与“所指”（signified）构成的二元实体。[8]商标犯罪侵犯的是社会主义市场经济秩序。细言之，以商业利用的方式而假冒他人的注册商标应用在自己的商品或者服务上，造成消费者对相关商品或者服务的混淆，从而无法清晰分辨各个商标所施指的商品或服务，致使商标指示市场的混乱。

通过在线工具BLAST搜索分析和DNASTAR 7.1.0子程序MegAlign的序列比对分析发现:14个猪源肉孢子虫的18S rRNA序列与米氏肉孢子虫的序列相似性最高，高达99.1%～100%；与猪人肉孢子虫的序列相似性为91.2%～92.0%。在使用邻接法构建的系统发育树上(见图3)，14个猪源肉孢子虫分离株(SmHN5～SmHN18)与已报道的米氏肉孢子虫在同一分支上。遗传多态性分析发现，14个分离株共检出11个单倍型，单倍型多样性Hd=0.956，核苷酸多样性Pi=0.003 61。14个分离株之间遗传距离为0.001～0.009，平均为0.003。表明洛阳市区市售猪肉中肉孢子虫主要为米氏肉孢子虫，但是存在较丰富的单倍型和一定的遗传多态性。

自2013年初习近平总书记提出“一带一路”战略构想以来，它就受到了社会的高度关注和回应。“一带一路”也随之成为与中国相关的最热门的词语之一，许多国家尤其是美国一直以来都非常关注中国的发展，都相继对其进行了报道。作为中国最大的项目之一，“一带一路”无疑也受到了中国报纸的大量宣传和报道。但是，新闻报道从来都不是客观的，它们作为政府的工具宣传政策或想法。因此，新闻报道尤其是权威报道可以通过一些语言学的方法和手段来反映政府的观点和意志，从而达到传播思想和影响大众观点的目的。

在缺少抗病品种或原有抗病品种抗锈性丧失，又无接班品种的麦区，需要进行药剂防治。我国先后使用对锈病有效的杀菌剂有敌钠酸、敌锈钠、氟钡制剂、氨基碘酸钙、氟硅脲、萎锈灵、灭菌丹、代森锌等。近年主要推广三唑酮（粉锈宁）、特谱唑（速保利）等。

  

SmHN5～SmHN10分离株来自A屠宰厂；SmHN11～SmHN15分离株来自B屠宰厂；SmHN16～SmHN18分离株来自C屠宰厂。图3 基于猪源肉孢子虫18S rRNA的系统发育树

3 讨论

肉孢子虫是一种重要的食源性人兽共患寄生虫[13]。目前，猪肉仍是中国消费量最大的肉食品，因此，弄清猪肉中肉孢子虫感染情况和流行的种类或亚型，对评估猪源肉孢子虫公共卫生风险和猪肉孢子虫病对猪场的危害程度具有重要的参考价值。猪源肉孢子虫包囊在肌肉压片镜检和组织切片镜检中不能准确定种，而基于18S rRNA分子鉴定是一种可靠的病原种类鉴定方法。本文基于18S rRNA巢式PCR检测结果发现，洛阳市区猪源肉孢子虫主要是米氏肉孢子虫，与文献[18]对豫北地区济源市猪源肉孢子虫种类鉴定结果一致。

目前，肉孢子虫没有被列为生猪屠宰法定必须检疫项目[3]，为了真实反映当前猪肉中肉孢子虫感染情况，本研究直接从超市和菜市场采集肉样带回实验室，每份肉样随机分点取样压片镜检20张，仔细观察，最大限度降低了肉孢子虫的漏检率。为了提高准确性，同时用巢式PCR对压片镜检阳性的样品进行验证和病原种类鉴定。相对于中国其他地区[16,18]，本文猪源肉孢子虫检出率较高，为26.8%，除了地域差异外，与检测方法的灵敏度也有一定关系。大多数文献报道的数据是在生猪屠宰检疫过程进行[3,16,18]，而生猪屠宰检疫是流水线作业，在有限时间内要完成大量肉样的检测，很难保证精细检疫，漏检率较高。另外，不少检疫人员不熟悉肉孢子虫包囊，多种因素导致屠宰生猪肉孢子虫检出率偏低。

米氏肉孢子虫的终末宿主是犬、狼等犬科动物[1,20-22]，对于猪场来说，护场犬和流浪犬是主要的传染源。虽然近几年河南地区养猪模式发生很大变化，集约化猪场占据主流，但是依然存在一定数量养殖水平相对较低的养殖户。根据走访调查，猪场或养殖户饲养护场犬比较普遍，护场犬时常会吃到病死猪，米氏肉孢子虫会在犬小肠形成卵囊或孢子囊，随粪便排出体外。粪便中卵囊或孢子囊可以直接通过犬的活动污染猪的饲料或饮水，也可以间接通过老鼠、苍蝇等传播载体污染饲料或饮水，导致猪感染米氏肉孢子虫，最终在肌肉中形成包囊[1,3,22]，说明猪场的护场犬是猪群米氏肉孢子虫感染率高的主要原因。因此，为了有效控制猪肉孢子虫病，猪场尽量不要养犬，如果养犬应定期用磺胺类药物给犬驱虫，同时严格控制流浪犬进入猪场。

4 结论

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本文通过肌肉压片镜检和基于18S rRNA巢式PCR技术，从洛阳市区的超市和菜市场销售的新鲜猪肉中均检测出肉孢子虫，总检出率为26.8%，多为轻度感染和中度感染，感染的虫种主要为米氏肉孢子虫，与文献[18]对豫北地区济源市猪源肉孢子虫种类鉴定结果一致。说明在河南省洛阳市猪场流行的主要是米氏肉孢子虫，至于有无其他肉孢子虫种类或亚型，还有待扩大调查样品的数量和选择分辨率更高的遗传标记基因来验证。

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(1)严格审查处方。药房药师需对处方严格审查,以药理学为指导,判断处方药物配伍是否合理,及时将其中的不合理用药、不安全用药问题排除。同时,药师应对处方药物中涉及的药物用量、用法充分掌握,有患者咨询时可准确解答告知,特别注意提醒患者不同药物应用下可能出现的不良反应,叮嘱谨慎用药。

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记Var(^mH(x))=Vn(x),Bias(^mH(x))=E(^mH(x))-m(x)=Bn(x),则m(x)核估计^mH(x)的均方误差为

《外交保护条款草案》虽不能等同于国际惯例或法律确信，但它是法律规则产生的重要辅助途径[22]。中国宜积极参与制订外交保护国际规则并提出有利于维护中国投资利益的规则提案。

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在工作、学习或生活中遭受了挫折，会产生消极情绪；受到了他人的挖苦、讽刺或负面评价等会产生负面情绪；甚至无缘无故地，也会莫名其妙地情绪低落。消极情绪是我们情感体验的一种，跟积极情绪一样，都是生活中的一部分。偶尔的消极低落是正常的，它有利于我们从另一方面思考问题，但如果一味沉浸在消极当中，则会阻碍我们进步。

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试验分为4组，对照组（100%基础精料+黄贮饲料）、试验1组（80%基础精料+膨化秸秆生物发酵饲料）、试验2组（70%基础精料+膨化秸秆生物发酵饲料）、试验3组（60%基础精料+膨化秸秆生物发酵饲料）。其中100%精料即按体重的1.2%给予精料。

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沉水植物的种植方法较多，各有特点。试验综合考虑沉水植物的特点、种植水域环境以及经济成本后，采用播种法、移植法和扦插法进行对比研究。播种法种植时，苦草、金鱼藻和狐尾藻播种种子，黑藻播种休眠芽。移植法和扦插法则均采用单株形式。试验开始后每7 d观测统计存活植株数量，并随机拔出10株测量株高及鲜重，之后将植物原位种植。

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