小麦(Triticum aestivum L.)是世界主要粮食作物。利用杂交优势提高小麦产量、增强小麦抗性已经成为提高小麦产量的重要途径[1]。利用小麦雄性不育系[2]，尤其是温敏雄性不育系进行“二系法”杂交小麦育种，逐渐成为杂交优势利用的主要手段[3]。温敏雄性不育系花粉败育的机制研究对于小麦杂交制种具有重要的理论意义，其中，花粉育性的检测是开展相关研究的细胞学基础[4]。

BNS是一个新发现的雄性不育系[5]，其花粉发育在抽穗前对温度敏感，当温度小于8.9 ℃时彻底不育，温度在8.9～14.4 ℃之间育性逐渐恢复，温度大于14.4 ℃时育性完全恢复[6]。BNS366是BNS和普通小麦品种郑麦366经饱和回交转育而成的新品系[7]，具有与BNS一样的育性转换规律，与郑麦366仅存在温敏基因的差异，BNS366和郑麦366构成一对近等基因系。前人针对BNS366小孢子发育的细胞学观察一般以常规小麦品种为对照[8]，以其近等基因系郑麦366为对照开展细胞学观察，对于揭示BNS366小孢子发育过程中的细胞学现象具有更明显的优势，但目前缺乏相关报道。

前人已经对水稻[9-10]、烟草[11]、玉米[12]、萝卜[13]、油菜[14]、小麦[3]等做过细胞学育性检验研究。目前，研究花粉育性的手段主要有I2-KI[3,4,6] 、醋酸洋红[3]和苏木精[9,12,14-15]染色。李自超等[9-10]认为，I2-KI染色法不能准确反映水稻花粉的育性。醋酸洋红[3,8,13]、苏木精[9,12,14-15]和改良苯酚品红[16]均为细胞核染液。前人对醋酸洋红使用最多，染色效果及对花粉育性的检验也最为理想[3,8,13]；其次是苏木精，用其对花粉育性研究的误差不大[9,12,14-15]。有关改良苯酚品红对于花粉育性的研究目前报道较少。在以往的研究中，多使用上述4种方法的一种或两种进行细胞育性的检测和比较[3,4,6,8-10,12-15]，对这4种方法的系统性比较鲜见报道。本研究以BNS366和郑麦366为试验材料，探究4种染色方法的染色效果及其对小麦花粉育性检测的准确性，以建立温敏雄性不育小麦BNS366小孢子发育和花粉育性检测的最佳方法。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验材料为温敏小麦雄性不育系BNS366，以其近等基因系郑麦366为对照，均由河南科技学院小麦中心选育并提供种子。所有材料于2016年10月11日正常秋播于河南师范大学小麦试验田，次年选代表型植株进行研究。

图1是由美国RYAN公司生产的由拖拉机牵引的草坪打孔机，幅宽1.8m；机架上安装有12个轮盘，两个1组，每个轮盘上安装8个孔径为19mm的打孔齿，设计工作深度为102mm，生产率为1.2hm2/h[12]。该公司生产的打孔机多用于家庭草坪和高尔夫球场等人工草坪。通过地表形成的孔洞，增加土壤的透气、透水性能，从而使营养物质能够进入到土壤中，促进草坪草根系的营养繁殖，达到改善草地的作用[13]。

1.2 方 法

1.2.1 细胞学观察

在温敏小麦雄性不育系BNS366和郑麦366雄蕊发育的单核靠边期(小麦穗芒从旗叶叶鞘中伸出长度≤1 cm)、二核期(小麦穗从旗叶叶鞘中伸出1/2穗长)、三核期(小麦穗从旗叶叶鞘中刚刚完全伸出)和开花期(小麦穗中部小穗1、2位小花花药为黄色，花丝伸长至花药接近内外稃顶部)，在上午9:00～10:00，各取10个穗子固定，分别用I2-KI、醋酸洋红、苏木精和改良苯酚品红法染色、制片，在Leica DMIL倒置荧光显微镜下用白光观察、拍照和统计，分析小孢子发育过程和花粉粒育性表现。可育率=可育花粉数/花粉总数×100%。花粉育性统计结果取平均值。具体制片和观察过程如下。

(1)取材和固定：将不同花药发育时期所取样品剪去麦穗顶部6个小穗和基部6个小穗，留下中部小穗后置于FAA固定液(50%乙醇、冰醋酸和福尔马林按18∶1∶1的体积比配制)中保存备用。

(2)I2-KI法染色、制片和观察：取一个洁净载玻片，滴1～2滴I2-KI溶液，取(1)中固定好的麦穗1个，沿麦穗自下而上从不同小穗1、2位小花中取3～5枚花药，每枚花药均来自不同小穗，用镊子夹碎使花粉粒流出，去除残渣，盖上盖玻片。花粉粒饱满、圆形、淀粉积累多、染色深的为可育花粉，否则为败育花粉。其中，花粉粒干瘪为典败，呈圆形不能染色或染色浅分别为圆败或染败。

(3)醋酸洋红法染色、制片和观察：取(1)中固定好的麦穗1个，用70%乙醇置换两次，每次30 min；用70%乙醇保存在4 ℃冰箱中备用。取一个洁净载玻片，滴1～2滴醋酸洋红(Sigma)溶液，从麦穗上取3～5个花药(方法同I2-KI法染色)，镊子夹碎，去除残渣，盖上盖玻片(三核期和开花期玻片制好后，酒精灯上烤片，将载玻片从酒精灯外焰中反复穿过，保持样品所在区域不至沸腾，感觉载玻片底部发热微烫，30 min左右，下同)。能看到细长拉伸呈鱼尾状精核的为可育花粉；花粉粒畸形、只能看到营养核，看不到正常发育的精核或花粉无任何着色部分都视为不育。

在空间选择方面，因现代航运服务集聚示范区主要以航运、船舶交易等为主题，这就决定其需要在空间上与相关航运资源相近，因此，广西航运服务集聚区应布局在与船舶停泊区附近地区。此外，要把广西航运服务集聚区打造成航运高端服务示范区，就必须把航运服务集聚区的功能与城市服务功能相融合，同时依靠城市高端服务的支持，因此，广西航运服务集聚区布局还要与城市高端服务功能在空间上相毗邻。

(5)改良苯酚品红法染色、制片和观察：将(3)中在4 ℃冰箱中保存备用的麦穗取出，取一个洁净载玻片，滴1～2滴改良苯酚品红溶液，从置换后的麦穗上取3～5个花药(方法同I2-KI法染色)，镊子夹碎，去除残渣，盖上盖玻片(郑麦366三核期和开花期玻片制好后，酒精灯上烤片0.5 min后镜检观察细胞核染色情况，细胞核观察不清楚时增加烤片次数，每次0.5 min，至镜检观察到清晰的细胞核，一般最多烤片两次。

1.2.2 套袋自交结实率调查

醋酸洋红为细胞核染料[8]，本试验结果显示其将细胞核染成红色。周美兰等[8]曾用其对小麦花粉进行染色，能十分清晰地观察到细胞核的形态。本试验中，除了三核期细胞核还没发育完全，观察效果不是十分清楚外，其余各个时期的细胞核都能十分清楚地观察到，且此染色法去除了淀粉的影响，可直接观察到开花期小孢子中有两个正常的精核，从理论上讲此法更加有效。本试验中，结实率为74.88%，醋酸洋红法染色得出的育性为79.15%，两者差异不显著，能极好地反映花粉的育性。

1.3 数据分析

采用Excel 2010和SPSS 16.0进行数据统计、处理和分析。

2 结果与分析

2.1 小孢子发育进程中不同染色法染色效果

2.1.1 I2-KI法染色效果

总之，在专业课程领域实现专业课程思政，是党和国家对高等教育提出的一个新要求，是非思政类的高等教育者的一项新使命。在具体的专业课程思政教学实践过程中，任课教师还根据实际的教学成效不断改进，努力实现全程全方位育人的专业人才培养目标。

2.1.2 醋酸洋红法染色结果

在单核靠边期，BNS366和郑麦366小孢子中均能看到一个红色细胞核(图2A和图2E)，在二核期可清晰看见两个细胞核(图2B和图2F)。BNS366在三核期到开花期多数小孢子中细胞核消失，少数小孢子可见一个细胞核(图2C和图2D)。郑麦366在三核期小孢子中开始出现三个细胞核(图2G)，但细胞核没有发育完全，染色并不明显；开花期(图2H)细胞核完全发育，可清楚观察到多数小孢子中有两个红色鱼尾状细胞核(精核)与一个红色圆形细胞核(营养核)。郑麦366在三核期小孢子内模糊可见内容物但积累不充分，至开花期内容物充满整个花粉粒。说明醋酸洋红染色法可以观察到BNS366和郑麦366小孢子发育进程，并判断出BNS366败育期介于单核靠边期与二核期之间；醋酸洋红染色法可以清晰观察细胞核的发育进程，也可以反映细胞内容物的积累情况，但观察效果比较模糊，且不能明确指示细胞内容物的主要成分。

 

A～D:BNS366; E～F:郑麦366; A、E:单核期; B、F:二核期; C、G:三核期; D、H:开花期. 下同。

A-D:BNS366; E-F:Zhengmai 366; A,E:Uninucleate period; B,F:Binucleate period; C,G:Trinucleate period; D,H:Flowering period.The same in other figures.

图1 BNS366和郑麦366花粉粒I2-KI染色

Fig.1 Pollen grains of BNS366 and Zhengmai 366 stained with I2-KI

  

图2 BNS366和郑麦366花粉粒醋酸洋红染色

 

Fig.2 Pollen grains of BNS366 and Zhengmai 366 stained with acetate carmine

2.1.3 苏木精法染色结果

BNS366和郑麦366小孢子单核靠边期与二核期细胞图像均清晰，细胞核和细胞质对比明显，能清楚观察到细胞核(图3A、图3B、图3E和图3F)，与醋酸洋红法染色相比，细胞核的清晰度更高。BNS366三核期和开花期小孢子中细胞核不明显(图3C和图3D)。郑麦366三核期小孢子中有内容物的积累，细胞核没有发育完全，染色不清楚(图3G)。郑麦366开花期多数小孢子中能观察到两条鱼尾状的精核和一个营养核(图3H)。与醋酸洋红染色法相比，苏木精染色法观察到的郑麦366在三核期和开花期细胞核清晰度较低。郑麦366在三核期小孢子内出现内容物但积累不充分，到开花期内容物充满整个小孢子。说明在无内容物出现前，苏木精染色法比醋酸洋红法更容易观察到小孢子细胞核的发育情况。发现BNS366花粉败育时期介于单核靠边期到二核期。内容物形成后，细胞核与内容物之间的颜色反差小，与醋酸洋红法相比细胞核清晰度较差，可以指示内容物的积累情况，但与醋酸洋红法相似，既对内容物的指示不清晰，也不能显示内容物的种类。

2.1.4 改良苯酚品红法染色结果

用改良苯酚品红法染色，BNS366小孢子所有时期和郑麦366小孢子单核靠边期与二核期，内容物没有积累，染色清晰，可明显看出细胞核的形态(图4A～图4F)，清晰度比I2-KI染色法高，但比醋酸洋红法和苏木精法染色清晰度低，与上述3种染色方法观察到的细胞核变化趋势相似。郑麦366小孢子三核期出现三个没有发育完全的细胞核(图4G)，开花期(图4H)多数细胞核呈鱼尾状，不容易看到醋酸洋红法和苏木精法染色所看到的典型三细胞核图像；在三核期可见内容物的积累但不充分，至开花期内容物充满整个花粉粒。说明用改良苯酚品红法染色，可以对小麦小孢子发育情况进行观察，但其对细胞核染色效果不如醋酸洋红法和苏木精法，对内容物的指示效果不如I2-KI法染色。

2.2 花粉育性与自交结实率比较

由表1可知，以郑麦366开花期花粉为材料，采用I2-KI染色法观察到的花粉可育率最高，极显著高于其自交结实率；采用苏木精法和醋酸洋红法染色观察到的花粉可育率较低，与自交结实率的吻合度高；采用改良苯酚品红法染色观察到的花粉可育率最低，极显著低于自交结实率。说明采用苏木精法和醋酸洋红法染色确定小麦花粉育性的可靠性更强。

  

图3 BNS366和郑麦366花粉粒苏木精染色

 

Fig.3 Pollen grains of BNS366 and Zhengmai 366 stained with haematoxylin

  

图4 BNS366和郑麦366花粉粒改良苯酚品红染色

 

Fig.4 Pollen grains of BNS366 and Zhengmai 366 stained with carbol fuchsin

 

表1 不同染色方法得到的郑麦366花粉可育率与其自交结实率之间的差异性分析

Table 1 Differences in Zhengmai 366 pollen fertility rates and their selfing seedset rate analyzed by different staining methods %

  

I2⁃KI法I2⁃KI⁃stain醋酸洋红法Acetatecarmine⁃stain苏木精法Haematoxylin⁃stain改良苯酚品红法Carbolfuchsin⁃stain自交结实率Selfingseedsetrate92．41aA79．15bAB82．92abAB57．10cC74．88bB

数据后不同小写和大写字母分别表示0.05和0.01水平上的差异显著。

Values followed by different small and capital letter are significantly different at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

3 讨 论

3.1 不同染色方法对BNS366和郑麦366小孢子发育过程观察结果的影响

采用4种不同染色法，均可以清楚看到BNS366在二核期仅有少数小孢子内出现两个细胞核，在三核期和开花期则多数小孢子内细胞核缺失，且小孢子内容物缺失，由此可以判断BNS366小孢子败育的时期在单核靠边期到二核期间，这与贺晓敏等[8]的研究结果相一致。表明在本试验条件下观察到的细胞学特征准确可靠，可以尝试采用这4种染色方法进行进一步细胞学研究。

未来海域常规油气产量浅水保持稳定，深水和超深水逐渐发力。中东、亚太及非洲地区产量增长较明显，欧洲地区在高峰产量后递减明显。

3.2 不同染色方法对BNS366和郑麦366小孢子发育精细观察和花粉育性预测结果的影响

3.2.1 I2-KI法染色

ZHANG F N,LI G D,FAN X J,et al.Differential expression analysis of two male fertility-related genes in wheat thermo-sensitive male sterile line BNS and YS(Triticum aestivum L.) [J].Journal of Plant Genetic Resources,2015,16(2):369.

3.2.2 醋酸洋红法染色

对试验材料于抽穗后开花前分别套袋，使其自交，成熟期各随机选取10个麦穗，按国内法[17]调查和统计自交结实率。

3.2.3 苏木精法染色

苏木精同样为细胞核染料[9]，可将小麦花粉母细胞的细胞核染成紫蓝色。李自超等[9]采用该方法检测水稻的育性时，实际调查的结实率为63.75%，统计的花粉可育性率为67.90%，两者较为接近，认为此法能很好地反应花粉的育性。在本试验中，小麦结实率为74.88%，苏木精法染色统计的花粉可育性率为82.92%，与醋酸洋红法染色的花粉可育率三者之间差异均不显著，用此法也能检测花粉育性。但苏木精法染色在三核期和开花期的染色效果不如醋酸洋红法好，且在烤片时需反复烤片，操作较为复杂，在有醋酸洋红法的前提下，不建议使用苏木精法检测花粉育性。若单单只是为了观察花粉发育前期细胞核，此法的染色效果优于醋酸洋红法。

1.2.2 纳入研究的产妇治疗前签署知情同意，并进行生物反馈训练 将食指和中指进入阴道，指腹贴住阴道后壁后穹隆后再退后2 cm。嘱产妇收缩阴道，感觉阴道壁紧紧包绕二指，反复3次。然后进行盆底功能康复治疗，采用加拿大VISHEE瑞翼盆底肌电生物反馈仪和法国PHENIX系列神经肌肉刺激治疗仪USB4结合治疗，对于不同的产妇盆底情况，适当调整治疗方案。1个疗程共治疗15次，前6次每天治疗，后9次隔天治疗1次，然后对产妇盆底肌力治疗前后进行比较。

企业作为治理主体的重要组成部分，在电商行业中不论是电商平台本身，还是物流企业及其相关供应链条企业都应主动承担起相应的责任，无论是在商品包装上的二次利用效率还是快递运输服务等涉及社会公众服务与利益的环节加以改善，并主动承担起治理的责任，与政府建立合作关系。这样做的目的，一方面能够为其树立良好的公众形象，有利于其长期发展；另一方面负面效应不利于企业的持久发展，企业为实现其远期目标必然要服务于社会，积极参与到治理政策制定，接受民众的监督，同时积极配合政府部门的相关工作，并开展一定的公益事业，主动改善其出现的问题，并及时进行回应和补偿。

合作探究：引导学生开展活动式学习，采用分组探究、游戏教学等方式，教师设计知识模块和任务项目，通过超星学习通对学生指定或者随机分组讨论，学生小组通过讨论和互助后，提交成果并进行展示发言。例如让学生通过小组讨论，分析汽车地毯的功能和作用。

改良苯酚品红也为细胞核染料[18]，能将细胞核染成紫红色。改良苯酚品红法染色效果不如上述醋酸洋红和苏木精两种染核试剂，染色结果并不十分理想，且需要两次烤片，在开花期经过烤片后仍不能十分明显地观察到两个鱼尾状的精核。且在前人检测育性的研究中，很少人使用此种染色方法。本试验中，小麦结实率为74.88%，此染色法统计花粉育性为57.10%，极显著低于结实率。在检测花粉育性时，不建议使用此法。

BNS366小孢子在单核靠边期(图1A)可见一个细胞核，到二核期(图1B)少数小孢子中可见两个细胞核，但均模糊不清，三核期(图1C)和开花期(图1D)未见淀粉积累，细胞核弥散，部分细胞内找不到细胞核，单核靠边期之后小孢子外形逐渐皱缩成不规则三角形或瘪皮球状。郑麦366单核靠边期小孢子染色结果(图1E)和BNS366相似，二核期(图1F)可见部分小孢子具有两个细胞核，与BNS366相比较多，但仍然模糊不清，三核期(图1G)小孢子内可见淀粉积累，但淀粉积累仍不充分，开花期(图1H)大部分小孢子内淀粉达到充足状态，在三核期和开花期完全看不到细胞核，花粉粒外形为饱满圆形。表明，BNS366小孢子发育从二核期已经开始出现异常，正常具有两个细胞核的花粉粒较少，三核期之后完全没有淀粉的积累，其败育在单核靠边期向二核期转变时开始。用I2-KI染色法能够清晰观察到小麦小孢子内淀粉积累的情况，通过开花期花粉粒内淀粉的积累情况可以辅助判断花粉的育性，但对小孢子发育过程中细胞核的观察帮助不大。

本试验结果表明I2-KI法能很好地反映出花粉粒中淀粉积累的情况，但对小麦花粉育性预测结果偏高；醋酸洋红法整体对花粉染色效果较好，且可育率与结实率接近，对花粉育性检测准确；苏木精法对育性检测误差不大，但对成熟花粉染色步骤麻烦，染色效果不如醋酸洋红法，但对发育前期花粉染色效果优于醋酸洋红法，可对小麦发育前期花粉进行染色鉴定。改良苯酚品红法染色效果不好，且对育性检测误差较大，不建议使用。

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为使动态风险评价具有准确性和客观性，需要以系统、科学和可操作性为准则对影响因素进行选择。因此，根据专家经验和获取数据的实际情况，选取“船舶”和“环境”为主要研究对象，分析自然、地理与交通和船舶相互作用引发船舶风险，则评价指标集U0={U1,U2,U3,U4,U5}。这5个因素相互关联、相互影响，形成船舶进出港口航行动态风险因素的有机整体。

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在色谱分离过程中发现，溶剂体系的pH对色谱的出峰时间有很大影响。当体系pH由3变为2时，出峰时间可以减少2.0 h左右，而分离度变化不大。

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I2-KI染色可使淀粉深染 [10]。禾谷类花粉发育过程中会逐渐积累淀粉，成熟期淀粉积累达到顶峰。发育良好的花粉能被I2-KI染成蓝黑色，发育不良的花粉常呈畸形，不含淀粉或淀粉积累较少，往往被I2-KI染成黄褐色[16]。人们常用染色法观察花粉中淀粉的含量和特性[8]。在本试验中，I2-KI法能十分准确地反映花粉粒中淀粉的积累情况。在李自超等[8]的试验中，实际调查的水稻结实率为49.91%的情况下，I2-KI法得到的花粉可育率为78.30%，远远高于结实率。李自超等[9]认为此方法对于败育时期较早的花粉(单靠期或二核期的败育)比较有效，但对于三核时期的败育，由于此时已经积累了较多淀粉，难以用此法区分，因此不能反映花粉的真实育性。本试验中，结实率为74.88%，I2-KI法的花粉可育率为92.41%，同样极显著高于结实率。因此认为I2-KI法染色能观察到花粉中淀粉积累的过程，但对于检测花粉的育性仍存在难以鉴别出染色深但实际不育花粉的缺陷。

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(4)苏木精法染色、制片和观察：取(3)中在4 ℃冰箱中保存备用的麦穗1个，取一个洁净载玻片，滴1～2滴Weigert苏木素染色液(Solarbio)，从麦穗上取3～5个花药(方法同I2-KI法染色)，镊子夹碎，去除残渣，盖上盖玻片(郑麦366三核期和开花期的花粉粒染色10 min左右盖片)，酒精灯上烤片0.5 min后镜检观察细胞核染色情况，细胞核观察不清楚时增加烤片次数，每次0.5 min后继续镜检观察，直至镜检观察到清晰的细胞核为止，一般需烤片3次[15]。

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这个人喝下热水之后，觉得自己可以站起来了，甚至还可以像想象中一个快死的人那样走路了。他每走一两分钟，就不得不停下来休息一会。他的步子软弱无力，很不稳，就像跟在他后面的那只狼一样又软又不稳；这天晚上，等到黑夜笼罩了光辉的大海的时候，他知道他和大海之间的距离只缩短了不到四哩。

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随着经济发展、社会进步和人民生活水平的提高，山东省无棣县需水量日益增长，再加上县城工业园的形成，原有月湖水厂的供水能力将无法满足供水需求，无棣县水务局和无棣县自来水公司决定采用明湖水库水作为水源，新建一座5.0万m3/d的供水厂，一期实施2.5万m3/d的构筑物。

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耗能能力也是评价结构抗震性能的重要指标，本文用滞回环包络图的面积来计算结构的耗能能力.表3为5个模型的延性系数和滞回耗能.

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3.2.4 改良苯酚品红法染色

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