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植物愈伤组织诱导培养实验的方法改进

更新时间:2009-03-28

愈伤组织是外植体因受伤或在离体培养时,其未分化的细胞和已分化的细胞进行活跃的分裂增殖而形成一种无极性、能旺盛分裂的薄壁细胞团[1].愈伤组织培养是植物组织培养中最常见的培养形式,植物愈伤组织诱导培养实验是植物组培实验教学中最基础的实验内容,同时,该实验教学内容在细胞生物学实验、植物生理学实验教学中也有设置,均属于基础验证性实验,许多实验教材和文献资料对该实验皆有详细介绍[1-6].笔者结合多年教学实践,立足应用型本科实验教学,结合当地环境和具体实际条件,对植物愈伤组织诱导培养实验加以改进优化,有利于学生学习、掌握组培无菌操作的基本方法和步骤及愈伤组织诱导的基本技术,有效提高实验和教学效果.

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1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 植物材料 胡萝卜、大蒜、菊花.

1.1.2 培养基 胡萝卜愈伤组织的诱导培养基:MS+2.0 mg·L-12·4-D+0.5 mg·L-16-BA+3%蔗糖+0.36%琼脂粉(凝胶强度>1300 g·cm-2),pH5.8;大蒜叶片愈伤组织的诱导培养基:MS+0.05 mg·L-1NAA+2 mg·L-16-BA+3%蔗糖+0.36%琼脂粉(凝胶强度>1300 g·cm-2),pH5.8;菊花茎段愈伤组织的诱导培养基:MS+0.1 mg·L-1NAA+2 mg·L-16-BA+3%蔗糖+0.42%琼脂粉(凝胶强度>1300 g·cm-2),pH5.8.

1.2 实验方法

1.2.1 材料预处理 将新鲜的胡萝卜清洗干净,用刮皮刀除去表皮1~2mm,削去两端,横切成2~3 cm小段,放入洁净的瓶子中;将未萌动的食用大蒜的瓣状小鳞茎剥皮、清洗干净,削去两端,放入洁净的瓶子中;选取表面光滑、无病虫害的菊花枝条,清洗干净,取植株的嫩枝条剪成长约5 cm的茎段,装入洁净的瓶子中.瓶子口覆盖4层纱布,置于自来水下细流冲洗0.5 h左右,后滤干水分.

1.2.2 外植体消毒 在超净工作台上,将预处理的胡萝卜肉质根块、大蒜瓣叶、菊花茎段外植体进行杀菌消毒.先用70%的乙醇消毒30 s,10%的次氯酸钠浸泡5 min,弃次氯酸钠浸泡液,再用10%的次氯酸钠浸泡3 min,无菌水荡洗3~4次,洗净残留的消毒液.再倒满无菌水浸泡2 h,弃无菌水后备用.

1.2.3 外植体接种 在超净工作台上无菌条件下,将预处理后的胡萝卜用刀切除其两端各约2mm厚的组织,将剩下的横切成3段长约1 cm左右的小段,然后将小段的韧皮部和木质部切去,留下形成层,再切成长3~5mm,宽2~3mm的小块,接种在胡萝卜愈伤组织的诱导培养基中;将大蒜外层瓣叶去掉,用刀片将储藏叶切成长、宽各3mm的小块,将小块内侧面向上接种在大蒜叶片愈伤组织的诱导培养基中;将消毒好的菊花茎段剪成0.5~1 cm长的小段,将菊花茎段形态学下端接种于愈伤组织的诱导培养基中.每瓶接种3个材料,盖好瓶盖,做好标记.

1.2.4 愈伤组织诱导培养 将接好胡萝卜、大蒜、菊花的外植体培养瓶置于组培培养室架上,在16±1℃黑暗条件下培养胡萝卜和菊花5 d、培养大蒜3 d,再移置23±3℃环境下培养,适时观察外植体伤口变化和愈伤组织诱导情况,观察愈伤组织质地、颜色、大小等生长情况(见图1、2、3),做好记录.

(1)交流输入,无备电:采取就近接入市电的直接供电方式。这种方式最简单,适合对网络质量要求不高,同时信号源为交流输入的场景。

  

图1 胡萝卜愈伤组织诱导

  

图2 大蒜叶片愈伤组织诱导

  

图3 菊花茎段愈伤组织诱导

2 结果与分析

2.1 优选实验材料

针对不同外植体,优定较为准确琼脂用量,对实验效果能产生较好作用.笔者在多年的“植物愈伤组织诱导实验环节”实验教学中,对比分析不同的培养基琼脂用量对实验效果的影响,得出:(1)采用用量0.3~0.42%、凝胶强度>1300 g·cm-2的琼脂粉,操作方便且培养效果好.一般没标注凝胶度的琼脂粉或琼脂条,杂质多且色黄,实验时用量需取0.7~1.0%,还应先试其凝固能力后再决定用量;而凝胶强度>1300 g·cm-2的琼脂粉纯度高杂质少,色浅透明质量好,实验时用量取0.3~0.42%即可,且无需先试其凝固能力,准确的琼脂用量能节约实验成本;(2)根据不同实验用材微调琼脂用量,达到外植体基质和有效吸收养分的适合点,从而节约成本.胡萝卜、大蒜愈伤组织诱导时组织块横切面大些,接种块采用横放,其培养基中用凝胶强度>1300 g·cm-2的琼脂粉,用量0.36%;菊花茎段需直立扦插,采用凝胶强度>1300 g·cm-2的琼脂粉,用量0.42%,增加琼脂粉用量有利用于外植体固定;(3)根据诱导愈伤组织的不同外植体和培养时长,适度增减培养瓶中的培养基装量,节约成本.培养基营养成分足够愈伤组织培养期外植体吸收即可,避免过度使用培养基而造成浪费,从而节省实验成本.胡萝卜、大蒜、菊花茎段愈伤组织诱导期一般分别为 20 d、10 d、25 d,瓶装培养基高度分别采用 0.8~1.0 cm、0.6~0.8 cm、1.0~1.2 cm.

植物组培实验、细胞生物学实验、植物生理学实验中的“植物愈伤组织诱导实验环节”属于基础验证性实验,其实验目的是指导学生学习诱导植物外植体形成愈伤组织的方法.为此,笔者认为:教材中的实验外植体采用银杏叶、长春花、喜树等[1]木本或灌木材料,增加了实验的难度和实验的时间进度,且取材在南方地区受地域或季节等条件制约.笔者在教学工作实践中反复对照试验,选取本地易得的当年生草本植物大蒜叶、菊花茎段等作为组培愈伤组织诱导的外植体实验材料,其再生能力强、具有代表性[4,7-9].这些材料来源广泛、成本较低、存储方便,且取材不受地域、季节限制,培养后容易成活,诱导愈伤组织时间短、染菌率和褐化率低、效果好.

2.2 优选培养基添加剂和激素

无菌操作技术的娴熟程度,直接关系到组培材料及培养物的杂菌污染率,操作不当也容易造成外植体的损伤,影响愈伤组织的诱导.

作为验证性实验,配方中添加CH,不仅增加实验难度、而且提高了实验成本,实验效果与笔者优化添加成分后的配方对比没有明显优势.CH若经高温蒸汽灭菌,蛋白质会产生一定损失;若采用过滤灭菌,用材成本高、酪蛋白溶在水里较稠不好抽滤,导致操作时间长,增加了实验难度和成本.笔者在配方中添加适量2·4-D和6-BA,不添加CH.2·4-D对愈伤组织的形成有促进作用,6-BA对愈伤组织的形成有辅助作用[10-12],且6-BA还能刺激多酚氧化酶的活性,减轻褐变发生[13],操作方便、效果也理想.

2.3 优定琼脂用量

琼脂的质量纯度和用量不仅影响培养基的硬度,而且影响培养物对营养成分的吸收,进而影响培养结果.实验教材中表述培养基琼脂用量一般是0.3~1.0%,但没有标注凝胶度、亦没有标明琼脂凝胶度的质量和纯度.

实验材料合适与否,对实验效果的明显程度甚至成功与否,将产生决定性作用.因为不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导条件反应差异性较大,有的部位诱导分化成功率高,有的部位很难脱分化,或者再分化频率很低[5].一般情况下,木本植物的单宁或色素含量较高,其合成前体物酚类的糖苷化合物在诱导培养过程中较草本植物而言,易发生褐变,木本植物相对于草本植物诱导愈伤组织的难度偏大;就草本植物而言,一般情况下,一年生草本植物比多年生草本植物易诱导愈伤组织.

[3]周 鑫.植物组织培养[M].北京:航空工业出版社,2012:52-55.

2.4 优择消毒液组合

实验教材中外植体的消毒多采用75%的酒精溶液浸泡30 s,再用0.1%的升汞浸泡5~12 min不等[2].其消毒效果虽然较好,但也有其不足之处,升汞剧毒,危害程度较大,易吸入、食入、经皮吸收,使用过程需格外小心,且其残毒、残留液去除较难,用后的废液回收处理麻烦、成本高,若没得到恰当的处理而直接排入水体还会给环境带来相当大的污染.

舒曼曾在有名的饺子馆“老独一处”实习过,和馅、擀剂子是个小内行,于是一切活儿由他来做,大丫做他的帮手。

2.5 优化无菌操作环节

外植体须在无菌条件下操作和培养,培养基中含有大量的有机物质、糖等,需要采用高压蒸汽灭菌或过滤除菌.实验教材中外植体愈伤组织诱导,培养基较普遍采用MS基本培养基,添加适量2·4-D、CH(水解酪蛋白)等[2].

销售商品赠送其他有偿购入的商品,该商品在购入时成本应直接计入“销售费用”账户,因此在商品发出时不需要确认成本;但采购时已计入进项税额的增值税在商品发出时做进项税额转出处理。

通过对接种器械消毒、合理使用的安排,能够有效减少实验培养的染菌率,同时提高操作效率.(1)对外植体分切处理器皿的准备作了改进.组培接种的外植体分切要使用不锈钢盘子或培养皿,若用70%~75%的酒精进行擦拭或采用灼烧进行消毒器皿,容易出现消毒不够彻底或局部灼烧温度不均衡破裂的情况;若采用灼烧后的不锈钢盘子处理分切外植体,容易出现因未把握好不锈钢盘子冷却程度烫伤外植体的现象.笔者采用高压蒸汽灭菌法直接消毒大量不锈钢盘后、及时取出烘干备用,每个学生每次接种时现取现用,能够有效节省操作时间和防止交叉污染.(2)对接种器械的准备作了改进.一般情况下,无菌接种时用一套剪刀、镊子、切刀等,采用灼烧灭菌,接种器械灼烧后都要等候冷却后方可使用,需要一定等候的时间,有的学生或因赶时间导致灭菌不够彻底,或因冷却时间不足灼伤外植体.笔者采用两套切刀、剪刀、镊子等接种器械,使用、灭菌、冷却交替循环,节省冷却的候时,灭菌效果好、无菌操作时间短、接种效率高,接种染菌率明显降低.

2.6 选择适合培养温度

调控温度对愈伤组织的诱导具有一定作用.教材中普遍认为,诱导培养愈伤组织的适合温度为23~32℃,一般在25±2℃下培养为宜[2-4].笔者通过反复试验对比表明,接种前期先在略低的温度下(16℃)培养胡萝卜和菊花5 d、培养大蒜3 d,再移置23±2℃下培养,染菌率和褐化率明显降低,愈伤组织的诱导率明显提高且长势好.

2.7 交叉课程实验内容的优化组合

植物组培的愈伤组织分化、植物生理学的胡萝卜体细胞胚发生及植株再生体系的建立实验、细胞生物学的植物细胞悬浮培养实验,这些实验都涉及愈伤组织的培养诱导阶段.笔者对这些实验选取相同的外植体,以植物组培的愈伤组织分化实验中诱导的愈伤组织,延续开展后两门课程的实验教学,有利于学生验证细胞的全能性、学生的无菌操作训练,又可避免实验的重复,大大提高学生对无菌操作的兴趣和上课的信心,实验教学效果好.

3 结论

结合当地环境和具体实际条件,通过对植物愈伤组织诱导培养的实验材料、实验试剂、外植体消毒、无菌操作、培养等实验环节进行改进,使实验材料易得、实验方法更加优化、愈伤组织诱导的染菌率和褐化率降低,有效提高实验和教学效果.同时对多门课程涉及的植物愈伤组织诱导培养实验加以组合、改进优化,有利于学生学习、掌握组培无菌操作的基本方法和步骤及愈伤组织诱导的基本技术,有效地提高了实验和教学效果.

参考文献:

[1]李 胜,李 唯.植物组织培养原理与技术[M].北京:化学工业出版社,2009:87.

通过反复对比实验表明:10%次氯酸钠组合70%乙醇消毒,实验效果好且具有一些优点:(1)清洗、浸泡环节,残留于外植体的消毒液容易去除,其废弃液中的次氯酸钠会缓慢分解,少量低浓度次氯酸钠对环境没有危害,回收处理也简单;(2)乙醇次氯酸钠组合消毒外植体,再用无菌水处理,能明显提高愈伤组织诱导的成功率.笔者通过对比实验表明:乙醇次氯酸钠组合消毒外植体,再用无菌水浸泡2 h,滤干无菌水后使用,可缓解消毒液对外植体的损伤,愈伤组织诱导的成功率与对照组(无浸泡)相比较有明显优势.

[2]龚一富.植物组织培养实验指导[M].北京:科学出版社,2011:20-23.

在市场规律的调控下,农村经济结构需要不断变化,以适应现代市场发展的需要。在调整农村经济结构过程中,信息技术在农业经济管理中的应用对提高农业经济管理水平起到促进作用。同时,为农村经济的发展提供先进的技术,对发展现代化农业具有十分重要的作用。现阶段,农村经济向集约化方向发展,适合现代农业发展的需要,这是市场规律调控下农村经济发展的成果。

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[4]王清连.植物组织培养[M].北京:中国农业出版社,2002:181-185.

[5]侯福林.植物生理学实验教程[M](第三版).北京:科学出版社,2015:115-116.

[6]肖义军,张彦定.细胞生物学实验[M].北京:科学出版社,2012:92-94.

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当前主要是对高校教师综合水平加以评估,具体进行模糊评判的计算相关程序内容,首先是将其中评价的因素主要构成集合U={教学水平,政治素质,育人工作,领导评价,科研水平},而其中评价等级的集主要为{好,较好,一般,较差},其中对应的量化过后的数值主要为{1.0,0.8,0.6,0.4}。

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孙剑川,郭团玉
《宁德师范学院学报(自然科学版)》2018年第01期文献

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