人体内的活性氧自由基(ROS)和活性氮自由基(RNS)的产生和清除在正常情况下处于平衡的状态,当机体遭受外界刺激时,抗氧化防御体系出现故障,使细胞内的 ROS 和 RNS 水平升高,对组织造成损伤,这种状态被称为氧化应激[1]。机体主要依赖抗氧化酶系统,如超氧化物歧化酶(SOD),或抗氧化物质，如还原型谷胱甘肽(GSH)、金属硫蛋白等进行抗氧化[2]。流行病学研究表明,食品中的天然抗氧化剂，如维生素E、蓖麻碱和黄酮类化合物等也能通过清除自由基、提高抗氧化酶的活性或影响细胞抗氧化通路等不同机制而起到抗氧化作用[3-5]。

花青素又称花色素，它是一种广泛分布在植物中的天然色素,在自然界中主要以花青素母体花色苷元与不同的单糖或寡糖结合的花色苷存在,花色苷中的糖基还可以与一个或多个有机酸,如丙二酸、桂皮酸、咖啡酸等通过酯键形成酰基化的花色苷。花青素B环上的羟基和甲氧基的数目、取代糖基的位置及结构、糖基上的酰化基团等均会影响它们的稳定性[6]。一般来说,随着B环的羟基化程度的增加,花青素的稳定性降低,但随着甲基化、糖基化和酰基化程度的增加,花青素的稳定性提高[7],此外,花青素的稳定性受pH、温度、光等的影响较大。花青素类化合物具有较强的抗氧化、抗炎、抑制血糖和血脂升高等作用[8-12]。然而,由于花青素苷元在生理pH下极不稳定,目前对于花青素的抗氧化研究主要集中在花色苷或者酰基化花色苷上[13-14]。尽管有学者认为花色苷在体内会在小肠黏膜的乳糖根皮苷水解酶(LPH)作用下,先发生水解生成花色苷元,然后经小肠黏膜被吸收[15],但在动物和临床试验中,体内检测到的花青素母体分子的浓度极低;也有学者认为花青素在体内可能会在活性氧或肠道微生物作用下发生降解,其抗氧化作用可能是由这些降解产物产生的[16],因此，花青素在体内的抗氧化性研究一直被人们所忽略。笔者在近期的研究中发现,尽管在体外矢车菊素(Cy)的热稳定性远远小于矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G),但在活性氧H2O2的作用下,Cy的氧化降解速度却远小于C3G,而近期有研究表明,在摄入花色苷或富含花色苷的蓝莓汁后,在体内所检测到的花色苷元及其Ⅱ相代谢产物远远超过花色苷[17-18],这表明花青素在体内可能比人们猜想的要稳定得多,其在体内的抗氧化性和其他生理功能应该引起关注。本研究以H2O2诱导的人肝癌HepG-2细胞氧化应激为模型,比较研究花青素——矢车菊素(Cy)和其对应的花色苷矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)(两者的结构式见图1)对细胞氧化应激的保护作用,目的在于为探究花青素的抗氧化构效关系以及体内的作用机制提供依据。

  

图1 两种花青素的结构式Fig.1 Structural formula of two anthocyanins

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑米,购自南京苏果超市,产地江苏;HepG-2细胞,南京大学生命科学学院;AB-8 型大孔吸附树脂,天津市海光化工有限公司;乙腈,色谱纯,德国Merck集团;醋酸,色谱纯,美国Tedia试剂公司;甲醇、H2O2、盐酸,分析纯,国药集团化学试剂有限公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒、总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒 (ABTS法)、超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒 (WST-8法),碧云天生物科技有限公司;还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(微板法)、细胞丙二醛(MDA)测定试剂盒(微板法),南京建成生物科技研究所;二甲基亚砜(DMSO),细胞培养级,美国Sigma-Aldrich公司;DMEM 高糖培养基、胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA) 消化液、胎牛血清(FBS)、青霉素-链霉素(双抗),美国Gibco公司;pH=7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)、无Ca2+和Mg2+的Hank′s平衡盐溶液(HBSS),南京森贝伽生物科技有限公司;RIPA裂解液,中国Solarbio公司。

酶标仪,美国Molecular Devices公司;冷冻离心机,美国Thermo Fisher 公司;倒置显微镜,中国舜宇公司;CO2培养箱,美国Thermo Fisher公司;Retsch ZM200型超离心研磨仪,弗尔德(上海)仪器设备有限公司;Allegra 64R型 高速冷冻离心机,美国Beckman公司; Waters 1525-2998-2707-WFCII型半制备高效液相色谱仪(HPLC)、Waters XBridge TM prep C18(10 mm×150 mm,5 μm)制备柱，美国Waters公司。

依托省级“新能源发电的电力系统综合自动化实训基地”和“西门子工业自动化技术实验室”，满足了智能仪表研发和仪表应用能力培养的实训需求，保证顺利开展后续专业课程的实训环节，包括智能仪表实训和PLC技术实训。

1.2 方法

1.2.1 花青素的制备

采用MTT法测试不同浓度花青素对HepG-2细胞存活率的影响,结果见图3。由图3可见:当培养液中花青素浓度在0～0.5 mmol/L范围内,细胞存活率均为80%～100%,即不会对HepG-2细胞产生明显毒性,因此选择样品浓度50、200、400 μmol/L分别作为高、中、低3种浓度剂量组进行细胞氧化应激实验。

1.2.2 花青素的纯化

采用Waters 1525-2998-2707-WFCII型半制备高效液相色谱仪按以下方法对1.2.1节中制备得到的Cy与C3G进行分离纯化。以含6%醋酸的水为流动相A、6%醋酸的乙腈为流动相B,用Waters XBridge TM prep C18(10 mm×150 mm,5 μm)制备柱进行分离,流动相洗脱梯度为:0～1 min,10%流动相B;>1～10 min,10%～30%流动相B;>10～13 min,30%～10%流动相B;>13～18 min,10% 流动相B。自动进样器进样,每次进样量250 μL,流速为2.84 mL/min,柱温35 ℃,用二极管阵列(DAD)检测器检测,在520 nm下用Waters Fraction Collector Ⅲ型收集器进行收集。Cy通过收集7.90～8.20 min的流出组分获得,C3G通过收集4.40～5.00 min的流出组分获得。收集的Cy和C3G分别用真空旋转蒸发仪在35 ℃下浓缩,然后进行冷冻干燥,得到花青素冻干粉,其纯度通过520、320和254 nm 3种波长下的HPLC检测,纯度均大于99.5%。

1.2.3 HepG-2的培养

3)泛雅平台很有效地解决了一刀切教学模式下，无法掌握每个学生的学习情况，通过平台的作业完成情况以及课程浏览情况，结合每单元结束后的测试，能够充分了解学生对课程的掌握度。但是学生们无法掌握自己相对于其他同学的学习情况，平台可以发布课程完成度榜单以及教师给学生评价系统以激励学生努力学习，提高效率。

1.2.4 噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率

不同浓度的Cy与C3G对HepG-2细胞氧化应激模型SOD水平的影响如图5所示。从图5中可以看出:对照组在H2O2作用下SOD酶活力由正常细胞的(110.61±3.97) U/mL 降低到对照组的(34.04±3.96) U/mL,而在高、中、低各个浓度组花青素作用下细胞的SOD酶活力均显著高于氧化应激组对照组;在50、200 和400 μmol/L的Cy作用下,其SOD活力分别提高到(54.41±5.76)、(70.99±5.91)和(84.43±3.88) U/mL,即随着Cy浓度的增加,其SOD酶活力也显著提高;C3G的浓度对SOD酶活的影响则比Cy要小,当C3G的浓度为50、200 和400 μmol/L时,其SOD活力分别为(43.59±2.82)、(46.07±2.82)和(52.12±4.18) U/mL。由此可以看出,即使在最低浓度50 μmol/L时,经Cy作用的细胞的SOD活性也显著高于C3G的高剂量。

细胞存活率=(OD样品/OD空白)×100%

(1)

1.2.5 氧化应激模型的建立

利用1.2.4节中的方法筛选出的H2O2浓度,建立氧化应激模型,具体方法如下:取对数生长的HepG-2 细胞以5×105个/mL 密度接种于96孔板上,共设5组,每组6个平行实验,于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h 后,去除培养液,参照1.2.4节中的方法加入不同浓度的Cy或者C3G处理,在CO2培养箱中培养4 h后移去含花青素的培养液,并用PBS清洗两次,然后加入100 μL H2O2继续培养4 h,除上清液并用PBS 洗1次,分别依据BCA蛋白浓度测定试剂盒、总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法)、超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(WST-8法),还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(微板法)和细胞丙二醛(MDA)测定试剂盒(微板法)说明书中的方法测定相应指标。T-AOC测定结果用每毫克蛋白中的抗氧化能力相当于标准品trolox(水溶性维生素E)的物质的量(μmol/mg)表示;SOD测定结果用每毫升细胞裂解液上清液中的酶活力(U/mL)表示;GSH测定结果用每毫克蛋白中的GSH物质的量(μmol/mg)表示;MDA测定结果用毫克蛋白中的MDA物质的量(nmol/mg)表示。

1.3 数据分析

对一至六缸的气环进行测量，第一道气环的背隙在0.7mm至0.9mm之间，符合标准；第二道压缩环的背隙在0.9mm至1.0mm之间，符合标准；第三道油环的背隙在0.5mm至0.6mm之间，符合标准［5］。

2 结果及分析

2.1 H2O2诱导HepG-2细胞氧化应激模型浓度的筛选

不同浓度的H2O2作用于HepG-2 细胞4 h 后的细胞存活率见图2。由图2可知:100 μmol/L的H2O2对细胞存活率与对照组相比没有显著变化(P>0.05),400、800和1 000 μmol/L H2O2作用的细胞存活率与对照组相比显著降低(P<0.05),且H2O2浓度越高,细胞存活率越低。同时,100 μmol/L H2O2作用于HepG-2细胞4 h后,与对照组比较,T-AOC、SOD酶活力、GSH和MDA含量均发生了显著变化(表1)。结合图2中的结果表明,由100 μmol/L H2O2诱导4 h的HepG-2细胞氧化应激模型可以构建一个较为理想的抗氧化实验平台。

取对数生长的HepG-2细胞,用1%的青霉素-链霉素混合溶液、89%的DMEM高糖培养基和10%的胎牛血清配成的培养液,按照1×104个/mL接种于25 cm2培养瓶内,于37 ℃、5% CO2、相对湿度90%的恒温培养箱培养2～3 d传代。

  

图2 H2O2对HepG-2 细胞存活率的影响Fig.2 Effect of H2O2 on validity of HepG-2 cell

 

表1 H2O2对HepG-2 抗氧化水平的影响Table 1 Effect of H2O2 on anti-oxidative levels of HepG-2 cell

  

组别T⁃AOC/(μmol·mg-1)SOD活力/(U·mL-1)m(GSH)/(μmol·mg-1)m(MDA)/(nmol·mg-1)对照组129 73±2 29110 61±3 9730 71±2 1913 03±0 21100μmol/LH2O2组36 14±2 31∗∗∗34 04±3 96∗∗∗3 10±0 86∗∗∗45 48±3 5∗∗∗

注：与对照组相比，***P<0.001。

2.2 Cy和C3G对HepG-2细胞的毒性作用

  

图3 Cy与C3G对HepG-2细胞存活率的影响Fig.3 Effects of Cy and C3G on viabilities of HepG-2 cell

黑米麸皮花青素C3G按照文献[19]的方法制备。Cy的制备方法:将制得的黑米麸皮花青素C3G冻干粉0.3 g溶于150 mL 6 mol/L的盐酸溶液中,置于70 ℃水浴中酸解6 h后取出,冷却至室温后,用冷冻离心机离心,取沉淀加水复溶,用乙酸乙酯萃取除去溶液中的小分子酚酸后经冷冻干燥得到Cy粗提物冻干粉。

2.3 Cy和C3G对细胞抗氧化作用的比较

2.3.1 Cy和C3G对细胞总抗氧化能力的影响

图6给出了不同浓度的Cy与C3G对HepG-2细胞氧化应激模型中GSH质量摩尔浓度(m(GSH))的影响。由图6可以看出:对照组中,在H2O2作用下GSH质量摩尔浓度由正常细胞组的(30.71±2.19) μmol/mg降低到(3.10±0.86) μmol/mg,在花青素的作用下,细胞中的GSH水平显著提高,即使在低剂量组50 μmol/L的Cy和C3G的作用下,细胞中的GSH质量摩尔浓度分别提高到(12.37±1.17)和(9.27±0.74) μmol/mg,相对于对照组分别提高了约4倍和3倍。HepG-2细胞氧化应激模型中GSH含量与两种结构花青素浓度均呈正相关性,Cy对氧化应激模型细胞中GSH含量的增加作用高于C3G。中剂量组的Cy(200 μmol/L)的作用与高剂量组的C3G(400 μmol/L)对细胞内GSH浓度的影响相同。

每组均进行至少3组平行实验,实验数据以平均值±标准差(SD)表示,采用统计产品与服务解决方案软件(SPSS)进行统计性分析,所有显著性分析均基于P< 0.05的显著水平。

  

a～f—根据统计性分析的结果，不同字母的数据间有显著性差异。图4 Cy与C3G对细胞T-AOC水平的影响Fig.4 Effects of Cy and C3G on levels of T-AOC in cells

2.3.2 Cy和C3G对细胞内SOD酶活力的影响

取对数生长的HepG-2细胞,根据细胞计数值调整细胞悬液浓度至5×105个/mL,按每孔100 μL,接种于96孔培养板后置于5% CO2培养箱中培养24 h,然后再加入100 μL不同浓度的H2O2 (100、400、800和1 000 μmol/L) 或花青素(0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mmol/L),每种浓度设6个平行实验,继续培养4 h,然后加入100 μL 5 mg/mL MTT溶液,在CO2培养箱中继续培养1 h后吸出上清液,每孔加入100 μL DMSO,在37 ℃条件下避光并振荡30 min,放入酶标仪中,在570 nm 波长下测定光密度(OD)值,所得结果舍去一个最大值和一个最小值求平均值,通过式(1)计算HepG-2细胞存活率。

  

图5 Cy与C3G对细胞内SOD水平的影响Fig.5 Effects of Cy and C3G on levels of SOD in cells

2.3.3 Cy和C3G对细胞内GSH水平的影响

图4给出了不同浓度的Cy与C3G对HepG-2细胞氧化应激模型总抗氧化能力水平的影响。由图4可以看出:两种花青素的高、中、低3种剂量组均可提高HepG-2细胞氧化应激模型中的T-AOC;对照组在H2O2作用下T-AOC由空白组的(129.73±2.29) μmol/mg降低到(36.14±2.31) μmol/mg,在低剂量组50 μmol/L的Cy作用下,其T-AOC提高到(101.11±4.26) μmol/mg;而在50 μmol/L C3G作用下,其T-AOC为(60.33±3.35) μmol/mg,相对于对照组平均提高了24.19 μmol/mg,但显著低于Cy。在各种浓度下Cy对细胞氧化应激模型中T-AOC的提高均显著强于C3G,两种结构花青素虽然对HepG-2细胞T-AOC的影响与其作用浓度呈正相关性,但仍可以看出：随浓度由低剂量变为中、高剂量时，T-AOC提高并不大,C3G的高浓度和中浓度组的T-AOC无显著差别;而Cy即使是在最低浓度50 μmol/L时,其T-AOC也显著高于C3G的最高剂量,且Cy在最高浓度400 μmol/L时,可以将细胞总抗氧化能力提高到正常水平。

  

图6 Cy与C3G对细胞内GSH水平的影响Fig.6 Effects of Cy and C3G on levels of GSH in cells

2.3.4 Cy和C3G对细胞内MDA的抑制作用

图7给出了不同浓度的Cy与C3G对HepG-2细胞氧化应激模型中MDA质量摩尔浓度(m(MDA))的影响。MDA作为脂质过氧化的主要产物,可以有效反映细胞所受氧化损伤的水平[20]。由图7可以看出:两种花青素的高、中、低3种剂量组均对HepG-2细胞氧化应激模型中MDA质量摩尔浓度的升高有显著的抑制作用；对照组中,在H2O2作用下细胞的MDA质量摩尔浓度由正常细胞组的(13.03±0.21) nmol/mg升高到了(45.48±3.50) nmol/mg；而在50、200和400 μmol/L的Cy作用下,其MDA质量摩尔浓度分别降低到(28.36±3.20)、(22.64±1.82)和(16.82±1.52) nmol/mg,在高剂量组的Cy作用下,其MDA质量摩尔浓度与正常细胞无显著性差异。与其他抗氧化指标相似,在各种浓度下Cy对细胞模型中的MDA质量摩尔浓度升高的作用均显著强于C3G,Cy在低、中浓度时,其细胞内MDA质量摩尔浓度水平分别相当于C3G组的中、高浓度MDA含量水平。

由上述实验可以发现，Cy对细胞氧化应激的保护作用显著强于C3G，这可能是由于Cy分子量比C3G更小,且其脱掉葡萄糖苷后极性减小,具有更强的细胞过膜转运能力,从而更容易在细胞内累积。尽管它们在细胞内的抗氧化机制还需进一步研究,但从对于氧化应激所引起的细胞损伤的抑制作用来看,花色苷元在降低由氧化性损伤所导致的糖尿病、癌症等慢性病发病率以及保护心血管方面的作用可能比花色苷更强。

总之,胸、腹腔镜联合治疗食管癌患者术后并发症发生率较高,尤其以肺部感染发生率较高,加强外科基础护理并给予综合护理,能有效预防术后并发症的发生,提升患者术后生活质量。

  

图7 Cy与C3G对细胞内MDA水平的影响Fig.7 Effects of Cy and C3G on levels of MDA in cells

3 结论

以H2O2诱导HepG-2细胞氧化应激模型可以有效模拟机体受到氧化作用时产生大量氧自由基,引发细胞膜脂质的过氧化,并大量损耗内源性抗氧化体系,造成GSH 含量和SOD活性降低的应激状态。外源性抗氧化剂可以通过降低氧化应激过程中生成的活性氧和MDA以及增加抗氧化酶的活性而降低细胞的氧化性损伤和由此而引起的疾病。本研究结果发现,Cy与C3G均可显著提高H2O2诱导HepG-2细胞内T-AOC水平、SOD活性和GSH含量,减少氧化产物MDA含量,并且作用效果随着花青素的浓度增加而增强。Cy对细胞氧化应激的保护作用显著强于C3G。本研究结果可以为进一步研究花青素在体内的构效关系提供参考。

发动机冷却泵水垢多会导致发动机温度过高，加速零件磨损，降低功率，烧耗润滑泵的机油。最科学的土办法是：挑选两个大丝瓜，除去皮和籽，清洗净后放入水箱内，定期更换便可除水垢。水箱水不宜经常换，换勤了会增加水垢的形成。

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