川芎(Ligusticum chuanxiong Hort.)作为一种常用的中药材,具有活血行气、祛风止痛的功效,主要用于妇科病,如月经不调、闭经痛经的治疗[1]，当前还被用于治疗动脉硬化[2]、缺血性中风[3]、心绞痛[4]和高血压[5]等。川芎中的化学成分主要有生物碱、苯酞类化合物和酚酸类化合物[6-8]。前期试验证明川芎中的苯酞类化合物——藁本内酯和欧当归内酯A对肝病都具有一定的治疗效果。但藁本内酯纯品在室温下不稳定,15 d即有58%异构化,主要反应途径为脱氢、氧化、水解和降解等[9],在加热的条件下主要转化为洋川芎内酯I和洋川芎内酯H[10]。作为藁本内酯二聚体的欧当归内酯A(Levistolide A),稳定性良好[11],具有更好的研究前景。

“有效”一词，最早出自于《汉书·元帝纪》中的“娄敕公卿，日望有效。”后演变至今，指能实现预期目的，有效果。今主要是对“期望产生预期结果的一种主观愿望的表达。”［7］在思想政治理论课互动式教学真实的场域中，互动的有效性表现为双主体、教学内容和教学形式三方面的规定性。

响应面分析法(RSM)作为优化工艺条件的一种方法,在较多领域中得到了广泛的应用[12-14]。其特点是在试验条件寻优的过程中,可以连续地对试验的各个水平进行分析。本文以欧当归内酯A质量分数为指标,在单因素试验的基础上,采用RSM考察超声辅助提取过程各因素的影响,优选欧当归内酯A的最佳提取工艺条件。

1 试验

1.1 主要仪器与试药

Waters 2695型高效液相色谱仪(HPLC)、Waters 717 plus 自动进样器、Waters 2996型二极管阵列检测器,美国Waters Technologies公司。

川芎药材,购自上海凌云路雷允上大药房;石油醚(分析纯)、乙酸乙酯(分析纯)、乙醇(分析纯)、甲醇(色谱纯),上海凌峰试剂有限公司;欧当归内酯A标准品,质量分数>98%,上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 供试样品溶液的制备

2.公共舆论的集体迷失与场域重构。1978年，我国财政部批准《人民日报》等多家新闻单位试点“事业单位企业化管理”，该方针成为我国媒介体制市场化进程的一个重要标志。此后，我国的媒介属性发生了巨大的变化，市场化逻辑逐步渗入媒体的日常运作，其传统的政治宣传功能出现弱化。在这个过程中，传统的国家——舆论模式出现松动并伴生出阶段性的公共舆论的集体迷失现象。究其原因，这种迷失根源于公众、媒体和政府在社会变迁过程中的认知失调和错位。

为保证预制光缆敷设工艺，预制光缆敷设时应要求厂家现场测量，并做好敷设、安装、整理工作，保证光缆路径规范、编码统一、标示一致。

1.3 试验方法

1.3.1 HPLC 条件

Agilent ZORBAX SB-Aq C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);梯度洗脱程序:0～12 min～30 min,40%A～55%A～80%A,流动相为乙腈(A)-水(B);流速1 mL/min;进样量10 μL;检测波长280 nm;柱温30 ℃。

取适量供试样品溶液,用微孔滤膜(0.22 μm)滤过,取续滤液,按照1.3.1节的色谱条件进样测定,将得到的供试样品标准溶液中欧当归内酯A色谱峰面积积分值,代入回归方程得到供试样品溶液中欧当归内酯A质量浓度(ρ),再将ρ代入w=ρV/m(w为川芎粉末中欧当归内酯A质量分数(欧当归内酯A在单位质量川芎药材中的质量),mg/g;V为供试样品溶液体积,本实验中为25 mL;m为川芎粉末质量,本实验中为2.00 g)中,计算药材中欧当归内酯A质量分数。

1.3.2 标准曲线的绘制

分别精确称取适量的欧当归内酯A于10 mL容量瓶中,加入甲醇定容,将其配制成质量浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05和0.06 mg/mL的欧当归内酯A标准品溶液。分别取适量标准品溶液,用微孔滤膜(0.22 μm)滤过,取续滤液,按照1.3.1节的色谱条件进样测定,将得到的色谱峰面积进行积分。经拟合,得到回归方程Y=3.66×107ρ+6.41×104，r2=0.999 5，其中,横坐标为欧当归内酯A质量浓度(ρ),纵坐标为欧当归内酯A的色谱峰面积积分值(Y)。由回归方程拟合系数r2=0.999 5可知,样品检测质量浓度在0.01～0.06 mg/mL范围内与峰面积积分值具有显著的线性关系。

川芎经粉碎机粉碎,过180 μm筛,干燥保存。准确称取川芎粉末2.000 g置于100 mL锥形瓶中,加入一定量的溶剂,放入超声波辅助提取器,超声辅助提取,布氏漏斗减压抽滤,滤液经旋转蒸发仪减压旋转蒸干,加入甲醇溶解,定容至25 mL棕色容量瓶中,放入4 ℃冰箱保存、备用。

1.3.3 欧当归内酯A的定量测定

在MIDAS/GTS中，坡体的剪应变是反映坡体变形破坏的重要指标，也是判断坡体变形破坏位置的主要依据.图8、图9分别为双排桩支护前Ⅱ-Ⅱ剖面X、Y方向的剪应变云图，图10、图11分别为采用双排桩支护后Ⅱ-Ⅱ剖面X、Y方向的剪应变云图.

近年来肿瘤免疫治疗一直备受关注。本届大会日本近畿大学Kudo等 （摘要LB-2）报告，在CheckMate-040研究中Child-Pugh B级晚期HCC患者应用NIVO单抗治疗可获得持久应答，安全性情况与Child-Pugh A级患者相似，中位生存时间为7.6个月。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果分析与讨论

2.1.1 提取溶剂的确定

Y=0.52+0.022B+1.986×10-3C+4.227×10-3D-3.783×10-3BC-2.146×10-3BD+0.011CD-0.015B2-0.013C2-0.011D2。

由表1可见：提取溶剂为乙醇和乙酸乙酯时,欧当归内酯A质量分数分别为0.435和0.467 mg/g,提取效果较好,但乙酸乙酯粗提取物中欧当归内酯A的相对质量分数(0.514%)远高于乙醇提取物中的(0.329%),所以选择乙酸乙酯作为欧当归内酯A的提取溶剂。

2.1.2 液固比对欧当归内酯A提取效果的影响

选择乙酸乙酯为提取溶剂,固定提取温度40 ℃、提取时间30 min、超声功率180 W和频率53 kHz,以液固比为5、10、15、20和25 mL/g分别进行提取试验(进行3次平行试验),考察料液比对欧当归内酯A提取效果的影响,结果见图1。由图1可知:在一定范围内,随着液固比的增大,欧当归内酯A质量分数逐渐增大;液固比达到10 mL/g后,欧当归内酯A质量分数随着液固比的增大出现下降的趋势。这可能是因为液固比达到一定的比例后,欧当归内酯A的溶出量达到动态平衡,随着液固比的进一步增大,其他物质的溶出量增加,欧当归内酯A溶出量的动态平衡被打破,导致欧当归内酯A的溶出量减少,直至达到新的动态平衡。

 

表1 提取溶剂对欧当归内酯A质量分数的影响Table 1 Effects of solvents on mass fraction of Levistolide A

  

提取溶剂w(粗提物)/(mg·g-1)w/(mg·g-1)相对质量分数/%甲醇201 30 3300 164乙醇132 20 4350 329石油醚55 30 2990 541乙酸乙酯90 80 4670 514

注：粗提物质量分数(w(粗提物))为粗提物在单位质量川芎药材中的质量;相对质量分数为欧当归内酯A占粗提物的百分比。

  

图1 液固比对欧当归内酯A质量分数的影响Fig.1 Effect of liquid to material ratio on mass fraction of Levistolide A

2.1.3 提取温度对欧当归内酯A提取效果的影响

在提取时间30 min、超声功率180 W、频率53 kHz和液固比为10 mL/g的条件下,考察提取温度对欧当归内酯A提取效果的影响,结果见图2。由图2可以看出:提取温度在20～30 ℃时,欧当归内酯A质量分数随温度的升高迅速增大;提取温度在30～50 ℃时,欧当归内酯A质量分数变化不明显,只出现略微下降的趋势;提取温度超过50 ℃后,其质量分数逐渐下降。这可能是因为温度升高,加快了传质过程,相同时间内欧当归内酯A质量分数增大,随着温度的进一步升高,部分欧当归内酯A发生了分解,欧当归内酯A质量分数出现略微下降的趋势。

  

图2 提取温度对欧当归内酯A质量分数的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on mass fraction of Levistolide A

2.1.4 提取时间对欧当归内酯A提取效果的影响

将表3中数据采用Design-Expert 8.0.5b软件进行处理,得到液固比(B)、提取温度(C)、提取时间(D)与欧当归内酯A质量分数(Y)之间的二次回归模型方程

  

图3 提取时间对欧当归内酯A质量分数的影响Fig.3 Effect of ultrasonic extraction time on mass fraction of Levistolide A

2.1.5 超声功率对欧当归内酯A提取效果的影响

在提取温度40 ℃、液固比10 mL/g和提取时间30 min的条件下,考察超声功率对欧当归内酯A提取效果的影响,结果见图4。由图4可知:随着功率的增加,欧当归内酯A质量分数迅速上升,在功率为126 W时达到最大值,随后下降并趋于平缓。这可能是因为超声具有热效应,超声功率的增大导致局部温度升高,部分发生分解。

由单因素试验结果分析可知,提取时间、液固比、提取温度这3个因素对欧当归内酯A质量分数影响较为显著,结合Box-Behnken中心组合设计(BBD)原理,选择上述3个因素为响应因子,欧当归内酯A质量分数为响应值,设计响应面分析试验。试验设计及结果见表2和3。

  

图4 超声功率对欧当归内酯A质量分数的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on mass fraction of Levistolide A

2.1.6 响应面试验各因素范围的确定

根据单因素试验分析结果,确定各因素范围:当超声功率为126 W时,欧当归内酯A质量分数达到最大值,为了减少试验次数和能耗,将提取过程中超声功率固定在126 W;液固比范围选取为5、10和15 mL/g;提取温度范围选取30～50 ℃;提取时间范围选取45～75 min。

2.2 RSM结果分析与讨论

字迹非常的清秀，清秀得使我不禁想到黛玉妙玉之类的美人来。我放眼四处张望，猛然想到了我们班上的姚菲菲，她今天下午点名时也未到的！我激动得心都怦怦跳了起来。

 

表2 分析因素和水平Table 2 Factors and levels

  

水平液固比/(mL·g-1)提取温度/℃提取时间/min-15304501040601155075

2.2.1 模型方程的建立与方差分析

在提取温度40 ℃、超声功率180 W、频率53 kHz和液固比10 mL/g的条件下,考察提取时间对欧当归内酯A提取效果的影响,结果见图3。由图3可知:提取时间为60 min左右时,欧当归内酯A质量分数最高；随着提取时间的延长,欧当归内酯A质量分数出现略微下降的趋势。这可能是由于提取时间延长导致溶剂挥发,欧当归内酯A溶出量的动态平衡被打破,使欧当归内酯A的溶出量减少;或者是随着超声时间延长,由于超声波的热效应,导致局部温度过高,欧当归内酯A部分分解所致。

在提取温度40 ℃、超声功率180 W、频率53 kHz和提取时间30 min的条件下,以不同溶剂(甲醇、乙醇、石油醚和乙酸乙酯),按照液固比10 mL/mg,进行超声辅助提取,结果见表1(n=3,即进行3次平行试验)。

由方差分析结果(表4)可知:模型的P<0.000 1,差异极显著;失拟项F值为0.95,P=0.497 8>0.05,差异不显著,说明此方程对试验结果有较好的拟合度且误差较小,可用其对试验结果进行分析和预测。

 

表3 试验结果Table 3 Test results

  

序号BCDw/(mg·g-1)101-10 48120-1-10 4983-1010 47741100 51150110 5136-1-100 46370000 52180000 52190-110 488100000 5151110-10 513121-100 51513-1100 474140000 51715-10-10 467161010 515170000 520

从表4回归模型系数显著性检验可知:模型一次项B极显著、C不显著,D显著;二次项B2、C2和D2极显著;交互项BC显著,BD不显著,CD极显著。总体影响较为复杂,表明各因素对欧当归内酯A质量分数影响不是简单的线性关系。

2.2.2 响应面分析

当固定提取时间为60 min时,液固比和提取温度对欧当归内酯A质量分数的影响如图5所示。由图5可以看出:在一定的范围内,欧当归内酯A质量分数随液固比的增大和提取温度的升高,呈快速上升趋势,而后稍微下降,并趋于平缓;液固比曲线变化较大,表明其对欧当归内酯A质量分数影响极显著;温度曲线变化较小,表明其对欧当归内酯A质量分数影响较小。

提取温度(40 ℃)保持不变时,液固比和提取时间对欧当归内酯A质量分数的影响如图6所示。由图6可知:在一定的范围内,欧当归内酯A质量分数随液固比的增大和提取时间的延长而增大,后略微下降。

 

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance

  

方差来源自由度平方和/10-5均方/10-5F值P值显著性模型9686 70076 310119 51<0 0001∗∗B1375 600375 600588 20<0 0001∗∗C13 1573 1574 940 0616D114 29014 29022 380 0021∗BC15 7425 7428 970 0201∗BD11 8431 8432 890 1332CD144 25044 25069 31<0 0001∗∗B2196 94096 940151 83<0 0001∗∗C2171 05071 050111 28<0 0001∗∗D2149 07049 07076 86<0 0001∗∗残差74 4690 639失拟项31 8560 6190 950 4978纯误差42 6140 653总和16692 100

注：**P<0.001为差异极显著;*P<0.05为差异显著。

液固比为10 mL/g时,提取温度和提取时间对欧当归内酯A质量分数的影响如图7所示。由图7可知:欧当归内酯A质量分数随着提取温度的升高和提取时间的延长,呈先上升后趋于平衡,最后呈逐渐下降的趋势。其总体变化较为复杂,且曲线均较陡峭,表明交互项CD对欧当归内酯A质量分数的影响为差异极显著。

2.2.3 最佳工艺验证试验

根据所得到的模型方程,预测最优提取工艺为:液固比13.5 mL/g,提取温度40.32 ℃,提取时间62.15 min,欧当归内酯A质量分数的预测值为0.527 mg/g。实际试验过程中将提取工艺修改为:液固比13 mL/g,提取温度40 ℃,提取时间62 min。采用此工艺条件进行验证试验,3次平行试验,欧当归内酯A质量分数分别为0.525、0.526和0.525 mg/g,平均值为0.525 mg/g,与预测值相近,表明本试验所建模型优化的工艺参数准确可靠。

3.注重突破节约资源和环境保护方面的技术瓶颈。加大投资力度，由政府直接引进或者制定政策扶持企业引进节能减排先进技术，如能源领域的节能减排、燃料电池、太阳能、风能、生物质能等新能源技术，如生活方面的节水和资源综合利用的技术，如建筑方面建筑节能、绿色照明、节能监测和技术服务体系建设等，积极引导支持企业和全社会提高能源资源利用效率，减少排放。根据东营本地的资源环境、产业体系、污染状况，有针对性地资助或者联合开发本地需求的节能环保技术。如针对石油石化、橡胶轮胎产业的能量梯级利用技术、区域热电联产、余热余压利用、废料回收利用等技术，如符合东营需要的盐碱地改造、耐盐植物选育推广等技术。

2.3 《中国药典》试验方法的提取结果

参照《中国药典》中的提取方法[1],精确称取川芎样品1.000 g(n=3),加入乙醚20 mL,加热回流提取1 h,滤液经旋转蒸发仪减压挥干,加入甲醇后,定容于10 mL容量瓶中,进样前,取适量用微孔滤膜(0.22 μm)过滤,取续滤液,采用1.3.1节中的色谱条件进样,测定欧当归内酯A色谱峰面积,经积分得到峰面积积分值,计算欧当归内酯A质量分数,得到欧当归内酯A的平均质量分数为0.353 mg/g。本文工艺条件提取的欧当归内酯A质量分数比药典中的方法提取的欧当归内酯A质量分数提高了48.7%。

3 结论

1)采用超声波辅助技术提取川芎中的欧当归内酯A,通过单因素试验确定各因素的影响范围,采用BBD设计、RSM对提取工艺参数进行优化,得到最优工艺条件为:液固比13 mL/g,提取温度40 ℃,提取时间62 min。在此工艺条件下,欧当归内酯A质量分数为0.525 mg/g,与药典所用的方法得到的质量分数(0.353 mg/g)相比提高了48.7%。

2)拟合得到欧当归内酯A质量分数与各因素的二次方程模型,该模型对试验拟合较好,能较好地预测欧当归内酯A质量分数随各参数变化的规律。

  

图5 液固比和提取温度对欧当归内酯A质量分数影响的响应曲面图和等高线Fig.5 Response surface and contour plots for effects of ratio of liquid tomaterial and extraction temperature on mass fraction of Levistolide A

  

图6 液固比和提取时间对欧当归内酯A质量分数影响的响应曲面图和等高线Fig.6 Response surface and contour plots for effects of ratio of liquid tomaterial and extraction time on mass fraction of Levistolide A

  

图7 提取时间和提取温度对欧当归内酯A质量分数影响的响应曲面图和等高线Fig.7 Response surface and contour plots for effects of extraction time and temperature on mass fraction of Levistolide A

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[M].北京:中国医药科技出版社,2010:38.

[2] ZHANG L,DA L,JIANG Y R.Effects of active components of Red Paeonia and Rhizoma chuanxiong on angiogenesis in atherosclerosis plaque in rabbits[J].Chinese jouranl of integrative medicine,2009,15(5):359.

[3] YANG X,ZENG X,WU T.Chuanxiong preparations for preventing stroke[J].Cochrane database of systematic reviews,2010(1):65

[4] CHAN S S,JONES R L,LIN G.Synergistic interaction between the Ligusticum chuanxiong constituent butylidenephthalide and the nitric oxide donor sodium nitroprusside in relaxing rat isolated aorta[J].Journal of ethnopharmacology,2009,122 (2):308.

[5] HOU Y Z,ZHAO G R,YUAN Y J.Inhibition of rat vascular smooth muscle cell proliferation by extract of Ligusticum chuanxiong and Angelica sinensis[J].Journal of ethnopharmacology,2005,100 (1/2):140.

[6] CHAN S S,CHOI A O,JONES R L.Mechanisms underlying the vasorelaxing effects of butylidenephthalide,an active constituent of Ligusticum chuanxiong,in rat isolated aorta[J].European journal of pharmacology,2006,537(1/2/3):111.

[7] GUO Z F,GUO T T,GUO M.Preparation of molecularly imprinted adsorptive resin for trapping of ligustrazine from the traditional Chinese herb Ligusticum chuanxiong Hort.[J].Analytica chimica acta,2008,612(2):136.

[8] 郝淑娟,张振学,田洋.川芎化学成分研究[J].中国现代中药,2010,12(3):22.

[9] 李桂生,马成俊,李香玉.藁本内酯的稳定性研究及异构化产物的GC-MS分析[J].中草药,2000,31(6):405.

[10] LI S L,YAN R,TAM Y K,et al.Post-harvest alteration of the main chemical ingredients in Ligusticum chuanxiong Hort.(Rhizoma Chuanxiong)[J].Chemical and pharmaceutical bulletin,2007,55(1):140.

[11] 徐婷,王俊超,赵少甫,等.川芎中欧当归内酯A的提取纯化与结构表征[J].南京工业大学学报(自然科学版),2018,40(2):71.

[12] 吴茂东,王永禄,周维娜.响应面分析法优化阿奇霉素掩味微囊处方工艺[J].南京工业大学学报(自然科学版),2010,32(5):87.

[13] 蒋莉,马飞,梁国斌.木质素活性炭的制备及工艺优化[J].新型炭材料,2011,26(5):396.

[14] 王航,顾正位,韩春超.响应面分析法优化姬松茸液体发酵的培养条件[J].中国食品添加剂,2014(4):103.