甜瓜是世界性的主要水果之一,营养丰富,香甜可口。我国是甜瓜生产和消费大国,随着消费需求的增加,甜瓜种植面积逐渐增加。然而,在生产上各种病害限制了甜瓜的优质高产,其中蔓枯病是主要病害之一。在部分产区蔓枯病是最严重、最普遍发生的病害,并且一旦发生蔓延后很难控制[1],蔓枯病在大田的发病率可达20%～30%,在连作地及温室则高达80%[2-3]。

甜瓜蔓枯病是一种真菌性病害,其病原菌为Didymella bryoniae(Auersw)。目前控制蔓枯病的主要措施是化学防治,但发病严重时化学防治则无法有效控制病情,而且容易产生环境污染以及病原菌抗性。因此,选育优良的抗蔓枯病品种才是防治病害最经济有效的途径[2]。目前虽然已经筛选出一些抗蔓枯病的抗源材料[3-4],但是对于甜瓜抗蔓枯病的抗性机制还尚不清楚。

植物内源激素不仅调控植物细胞的生长分裂,而且参与植物对病害的抵抗作用。研究表明,主要的抗病防御信号途径包括乙烯、茉莉酸和水杨酸介导的3条信号途径,并根据病原物与植株的互作反应类型,分别参与不同的防御反应[5-6]。对于乙烯信号途径而言,ACC合酶基因(ACS)是乙烯合成的关键基因,而乙烯受体基因ETR1、乙烯信号转导相关基因CTR1和乙烯不敏感蛋白基因EIN2都是乙烯防御信号途径中的关键基因[7-8]。Song等[9]研究发现棉花对枯萎病抗性能力的提高与乙烯含量的降低成正相关。对于茉莉酸信号途径来说,丙二烯氧化合酶基因(AOS)是茉莉酸合成过程中的关键基因,植物防卫素基因PDF1.2和茉莉素受体蛋白基因(COI1)被认为是茉莉酸防御信号途径中的关键基因[10]。Balbi等[11]发现植物受到病原菌侵染后,体内的茉莉酸含量会增加。此外,乙烯和茉莉酸还是诱发系统性抗性产生的关键信号分子。在抗病防御反应过程中,水杨酸可以诱导植物产生获得性抗性,在植物受到病原菌侵染后,感染部位产生水杨酸并运输到其他部位,水杨酸的积累激活了病程相关基因非表达子NPR1表达[12],而苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)、异分支酸合酶基因(ICS)和水杨酸转运蛋白基因(enhanced disease susceptibility 5,EDS5)都是水杨酸合成过程中的关键基因。

目前,蔓枯病菌侵染甜瓜后有关植物内源激素及内源激素防御途径的相关研究较少。因此,本研究利用甜瓜抗蔓枯病抗源PI420145和甜瓜感蔓枯病品种‘白皮脆’为材料,在接种蔓枯病菌后的不同时间段进行取样,测定分析蔓枯病侵染前后植株乙烯、茉莉酸、水杨酸的含量,以及相关基因的表达量,研究内源激素在防御蔓枯病菌侵染甜瓜中的作用,为揭示甜瓜抗蔓枯病抗性机制奠定基础。

1　材料与方法

1.1　材料

甜瓜抗蔓枯病抗源PI420145和感蔓枯病品种‘白皮脆’,由南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室提供。

参考文献References:

1.2　蔓枯病菌接种

参照Zhang等[14]的方法进行接种。植株接种后用塑料拱棚保湿,相对湿度95%以上,外加黑膜保持黑暗环境,温度26～30 ℃。于21:00接种,在接种后的0、1、2、3、5、7 d时取样,每次均取3株甜瓜的第3片叶片,用于提取RNA和测定内源激素。

1.3　内源激素含量的测定

剪取叶片0.5 g,用80%(体积分数)预冷的甲醇(内含1 mmol·L-1二叔丁基对甲苯酚),冰浴研磨至匀浆;4 ℃放置5 h,12 000 r·min-1 4 ℃离心15 min;上清液过C18柱,真空干燥后加入样品稀释液即为样品激素提取液。内源激素乙烯(ETH)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)的测定采用酶联免疫吸附法(ELISA)[15]。试剂盒由南京森贝伽生物科技有限公司提供,每个样品重复3次。

她隐隐约约听到一两句，头不由自主地侧了侧，耳朵本能地去捕捉那些声音。其实，不听也能知道她们要说什么。她拉回了自己的耳朵和头，斩钉截铁地向前走，她要把那些闲言碎语用高跟鞋的脆响掐断。

1.4　RNA提取及荧光实时定量PCR

总RNA提取采用Trizol试剂法,利用反转录试剂盒(TaKaRa)进行纯化及反转录为cDNA。利用 SYBR GreenⅠ试剂盒(TaKaRa)以及CFX96 荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司),进行PCR扩增。反应体系为20 μL:cDNA模板1 μL,上、下游引物各0.5 μL,2×SYBR Premix Ex Taq Mix 10 μL,ddH2O 8 μL。qRT-PCR 反应条件为:95 ℃ 10 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共 40 个循环。对各个样品的熔解曲线进行分析,确定每个引物均为特异性扩增。所有样品3次重复,利用 Actin 基因作为内参基因。采用 2-ΔΔCT方法计算基因的相对表达量。

根据已经报道的乙烯、茉莉酸、水杨酸等激素标记基因,信号途径相关基因以及合成途径相关基因,挑选了其中比较关键的基因CTR1、ETR1、EIN2、ACS、PDF1.2、AOS、COI1、NPR1、EDS5、PAL、ICS,通过同源比对以及在NCBI中搜索相关基因序列设计引物,引物序列见表1。

 

表1　荧光实时定量PCR引物Table 1　The primers designed for qRT-PCR analysis

  

基因Genes引物序列Primersequences产物大小/bp Productsize基因描述GenedescriptionCTR1ETR1EIN2ACSPDF1.2AOSCOI1NPR1EDS5PALICSActinF:5'-AGTCACCATGCAACAACCAT-3'R:5'-AATAAGGGAAGCCAACAACG-3'F:5'-GTCTCCCAGGAACACAAGGT-3'R:5'-ATGAATGGTCTTTCATGGCA-3'F:5'-TTTGCGTTCTGAGAAGGATG-3'R:5'-GAACCAGGACCCTCAGATGT-3'F:5'-AGCCTATCCAAAGACATGGG-3'R:5'-AGGCCAAAGCTTGACATCTT-3'F:5'-TGAAATTCTCAAGGCTGCTG-3'R:5'-CATCGCTCGACTTGGAGATA-3'F:5'-TTCCTCGTCTTCTTCCTCTC-3'R:5'-ATACTCTTCCCTCCCCTGAT-3'F:5'-GTTGTGCCTGATCAAGTTGG-3'R:5'-TCTTGGTCCTGCTAGGGAGT-3'F:5'-TGCAAGTTGCCTAATCTTGG-3'R:5'-GGATCTCTGCTTTGGGAGTC-3'F:5'-GCTTGCTGACTGGGAATACA-3'R:5'-TTGGGCATTCATTCTTGTGT-3'F:5'-ATGGCTTCATATTGCTCTGAG-3'R:5'-ATGCCTCAAGTCAATTGCTTG-3'F:5'-TCAATGCTTGCTGCTACTGT-3'R:5'-GTTGCTTCCGTCAATCACTT-3'F:5'-GTGATGGTGTGAGTCACACT-GTTC-3'R:5'-GGCAGTGGTGGTGAACATG-3'1261161081041341238414112223422282乙烯信号途径基因Ethylene-signalingpathwaygene乙烯信号途径基因Ethylene-signalingpathwaygene乙烯信号途径基因Ethylene-signalingpathwaygene乙烯信号途径基因Ethylene-signalingpathwaygene茉莉酸信号途径基因Jasmonicacid-signalingpathwaygene茉莉酸信号途径基因Jasmonicacid-signalingpathwaygene茉莉酸信号途径基因Jasmonicacid-signalingpathwaygene水杨酸信号途径基因Salicylicacid-signalingpathwaygene水杨酸信号途径基因Salicylicacid-signalingpathwaygene水杨酸信号途径基因Salicylicacid-signalingpathwaygene水杨酸信号途径基因Salicylicacid-signalingpathwaygene内参基因Referencegene

1.5　数据分析

采用Excel 2016和SPSS 20.0进行数据处理分析和差异显著性分析。

  

图1　接种蔓枯病菌后‘白皮脆’和PI420145叶片乙烯(ETH)、茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)含量的变化Fig.1　Changes of ethylene(ETH),jasmonic acid(JA)and salicylic acid(SA)contents in leaves of ‘Baipicui’and PI420145 after inoculated with Didymella bryoniae

2　结果与分析

2.1　不同抗性甜瓜接种蔓枯病菌后叶片内源激素含量的变化

由图1可以看出:感蔓枯病甜瓜材料‘白皮脆’接种蔓枯病菌后,叶片中乙烯(ETH)含量呈先上升后下降的趋势,在接种后3 d达到峰值,且显著高于抗蔓枯病甜瓜抗源PI420145(P<0.05)。PI420145叶片中ETH含量变化不明显,在接种后的0～2 d内与‘白皮脆’中ETH含量几乎相同,但后期含量均低于‘白皮脆’。

‘白皮脆’接种蔓枯病菌后,叶片中茉莉酸(JA)含量整体呈先上升后下降的趋势,在接种后5 d到达峰值。PI420145叶片中JA含量在接种后1 d急剧下降,之后变化幅度较小,且在接种后0、2、7 d时其含量均高于‘白皮脆’。

‘白皮脆’在接种蔓枯病菌后,叶片中水杨酸(SA)含量整体呈上升趋势;PI420145叶片中SA含量整体呈先上升后下降的趋势,在接种后3 d达到峰值。在接种后0、2、3、5 d时,PI420145叶片中SA含量显著高于‘白皮脆’。

由图3可知，在30～40℃时，随着浸提温度的升高，浸提液中刺葡萄皮花青素的OD值上升；40℃时浸提液中刺葡萄皮花青素的OD值达到最大；50～70℃时，花青素的浸提量比在40℃条件下浸提量变小。因此，选择40℃作为刺葡萄皮花青素的浸提温度。

Ji R Q,Dong X B,Feng H,et al. Expression of PDF1.2 in oxalate oxidase transgenic oilseed rape(Brassica napus L.)[J]. Plant Physiology Communications,2009,45(5):479-482(in Chinese with English abstract).

2.2　不同抗性甜瓜接种蔓枯病菌后叶片内源激素相关基因表达的变化

2.2.1　乙烯相关基因　从图2可以看出:接种蔓枯病菌后,乙烯相关基因ETR1在2种材料中表达量的变化趋势一致,均在接种后1和3 d时出现峰值。在接种后0和3 d,PI420145中ETR1的表达量显著高于‘白皮脆’,其他时间均显著低于‘白皮脆’。

  

图2　接种蔓枯病菌后‘白皮脆’和PI420145中乙烯相关基因表达量的变化Fig.2　Changes of expression level of ETH-related genes in leaves of‘Baipicui’and PI420145 after inoculated with D.bryoniae*P<0.05,**P<0.01. The same as follows.

接种蔓枯病菌后,CTR1在‘白皮脆’中的相对表达量变化幅度较小;在PI420145中,接种后2 d时,CTR1的相对表达量急剧上调,到达峰值,且显著高于同一时期‘白皮脆’中的表达量,之后下调表达,接种后7 d几乎不表达。

接种蔓枯病菌后,ACS在‘白皮脆’中先下调后上调表达,并在接种后7 d达到峰值;在PI420145中,接种蔓枯病菌后,ACS呈下调表达,接种后0～3 d,ACS的表达量均显著高于‘白皮脆’,但5和7 d时极显著低于‘白皮脆’。

Cooper等[16]研究表明,番茄果实中乙烯含量的降低可以提高其抗病能力。本试验中,接种蔓枯病菌后,PI420145和‘白皮脆’叶片中乙烯含量的变化同样表明乙烯含量的降低可以提高其抗病能力。乙烯相关基因的表达模式也不尽相同。本试验中,‘白皮脆’和PI420145中ACS的表达趋势与乙烯含量变化一致。ETR1属于乙烯识别受体基因,对乙烯的应答为负调控,CTR1与受体结合保持对下游途径的负调控,但是在蔓枯病菌入侵后,ETR1和CTR1在‘白皮脆’和PI420145中的作用并不显著。EIN2在乙烯信号途径中正向调节并参与防卫反应[17],本试验中的结果与其相一致。

总体上,在接种前期(0～3 d),ACS和EIN2在PI420145中的表达量显著高于‘白皮脆’,接种后期(5～7 d)均显著低于‘白皮脆’。

2.2.2　茉莉酸相关基因　从图3可以看出:接种蔓枯病菌后,茉莉酸相关基因COI1在‘白皮脆’中分别在接种后1和3 d出现了2次峰值;在PI420145中,接种后2 d COI1基因表达量急剧下调,之后表达量持续上调,并在接种后7 d达到最高值。

接种蔓枯病菌后,PDF1.2在‘白皮脆’中于接种后1 d出现峰值,之后表达量急剧下调,至接种后3 d,PDF1.2几乎不表达,接种后5、7 d的表达量又再次持续上调;在PI420145中,PDF1.2于接种后1 d达到峰值,之后表达量下调,接种后3 d表达量再次上调,并极显著高于同一时期‘白皮脆’中的表达量,接种后5、7 d下调至基线附近。

接种蔓枯病菌后,丙二烯氧化合酶基因(AOS)在‘白皮脆’中的表达量在接种后1和7 d时出现峰值;在PI420145中,AOS表达量先上调后下调表达,并且随着接种时间的推移,表达量呈逐渐下调的趋势。

总体上,在接种前期,除了接收后2 d PDF1.2在PI420145中的表达量低于‘白皮脆’,其余时期的表达量均显著高于‘白皮脆’。接种后期COI1在PI420145中的表达量显著高于‘白皮脆’,PDF1.2和AOS的表达量显著低于‘白皮脆’。

  

图3　接种蔓枯病菌后‘白皮脆’和PI420145叶片茉莉酸相关基因表达量的变化Fig.3　Changes of expression level of JA-related genes in leaves of‘Baipicui’and PI420145 after inoculated with D.bryoniae

  

图4　接种蔓枯病菌后‘白皮脆’和PI420145叶片中水杨酸相关基因表达量的变化Fig.4　Changes of expression level of SA-related genes in leaves of‘Baipicui’and PI420145 after inoculated with D.bryoniae

2.2.3　水杨酸相关基因　由图4可见:接种蔓枯病菌后,在‘白皮脆’中PAL表达量呈先上调后下调表达趋势,接种后1 d出现峰值;在PI420145中,PAL表达量在接种后3 d达到峰值,极显著高于同一时期‘白皮脆’中的表达量。

接种蔓枯病菌后,EDS5在‘白皮脆’中的表达量于接种后1 d达到峰值,之后表达量急剧下降,几乎不表达,接种后3和5 d,EDS5的表达量缓慢上升,最后表达量又略有下降;在PI420145中,接种蔓枯病菌后,EDS5的表达趋势与‘白皮脆’一致。

接种蔓枯病菌后,NPR1在‘白皮脆’中先下调后上调表达;在PI420145中,NPR1表达量在接种后3 d达到峰值,极显著高于同一时期‘白皮脆’中的表达量,其他时间的表达量均不高。

接种蔓枯病菌后,ICS在‘白皮脆’中的表达量于接种后1和5 d出现2次峰值;在PI420145中,ICS表达量在接种后2 d急剧上调,达到峰值,极显著高于同一时期‘白皮脆’中的表达量,在接种后3、5、7 d,ICS的表达量变化不大。

总体上,在PI420145中,除接种后1 d外EDS5表达量均显著高于‘白皮脆’,ICS、NPR1的表达量分别在接种后期和接种前期显著高于‘白皮脆’。

合格的全科医生需要为服务对象提供综合的，连续的，个性化的预防保健和健康维护。全科医学是独立于临床二级学科，并不是简单的临床各专科的整合[7]。在全科医生规范化培训教学中，要树立以预防为导向的诊疗理念以及“以患者为中心”的全科医学理念。把医疗服务、卫生服务、健康服务与人文关怀有机结合成一个整体。

双馈风力发电机作为一种广泛应用的旋转发电机应用于风力发电领域[2]，如果在设计初期不能对发电机每个部件及整体结构进行模态仿真分析，并选择合适的弹性支撑，一旦装机后出现发电机振动大，就可能导致零部件损坏、电动机扫膛、主轴弯曲及断裂等问题，直接影响到风力发电机安全运行等问题。因此对双馈风力发电机在设计初期进行模态仿真分析，避免发电机运行时出现振动方面的问题尤为重要[3]。

3　讨论与结论

接种蔓枯病菌后,在‘白皮脆’中EIN2表达量呈先上调后下调表达的趋势,且接种后5 d达到峰值;在PI420145中,EIN2表达量变化趋势与‘白皮脆’一致,但在接种后2 d就达到峰值,且显著高于同一时期‘白皮脆’中的表达量,接种后7 d几乎不表达。

茉莉酸在保护植物遭受病原菌入侵时发挥着重要的作用,随着病原菌的入侵,通过茉莉酸信号传递,植物可以对病原菌的胁迫作出积极主动的反应[18]。本试验中,蔓枯病菌入侵后,诱导‘白皮脆’中的茉莉酸含量上升;虽然PI420145中的茉莉酸含量有所下降,但在接种后0、2、7 d时茉莉酸含量均高于‘白皮脆’,PI420145中高水平的茉莉酸可能很大程度减缓了蔓枯病菌的入侵。在PI420145中AOS的表达趋势与其茉莉酸含量的变化基本一致,而在‘白皮脆’中其表达趋势与茉莉酸含量的变化存在一定差异,可能茉莉酸含量的高低还与其他因素有关。沉默茉莉素受体蛋白基因COI1的油菜植株可以明显降低对蚜虫的抗性[19]。本试验中,在PI420145中COI1的高表达可以提高其对蔓枯病的抗性。冀瑞琴等[20]研究表明PDF1.2的高表达可以增强油菜对菌核病的抗性。本试验中蔓枯病菌入侵后,PDF1.2 在PI420145中接种前期的高表达可以阻止或延缓病原菌的入侵。

水杨酸在植物防卫反应的信号途径和获得性抗性方面起着重要作用[21]。在转基因作物中,降低水杨酸水平,会导致对真菌的敏感性[22]。本研究中,接种蔓枯病菌后,‘白皮脆’和PI420145中的水杨酸含量均有上升,表明抗、感材料在受到蔓枯病菌侵染后都会促进水杨酸积累,但‘白皮脆’中水杨酸的积累还不足以阻止蔓枯病的侵染。PAL和ICS是水杨酸2条不同合成途径中的关键基因[23],但是这2个基因的表达模式不尽相同。徐兵划等[24]研究发现接种蔓枯病菌后,PAL在抗、感材料中表达量峰值均于接种后2 d出现,而本试验中结果与其不同。裸仁美洲南瓜接种灰霉病菌后,抗病品种中苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的表达量显著高于感病品种[25]。本试验中,接种后3～7 d,PAL在PI420145中的表达量同样高于‘白皮脆’。拟南芥受到病原菌侵染后,异分支酸合酶基因ICS1的表达量增加会增强拟南芥对病害的抵抗[26]。本研究表明,PI420145受到蔓枯病菌入侵时,水杨酸的合成途径主要通过异分支酸合成酶(ICS)途径完成,并且ICS在PI420145中接种后期的高表达增强了其抗性。高婷婷[27]研究表明接种白菜霜霉病菌后,抗霜霉病白菜中EDS5的表达水平快速上升,而感病品种中EDS5的表达水平变化不明显,本试验结果与之相一致。武健东等[28]研究表明,玉米矮花叶病毒和玉米小斑病原菌会诱导玉米中调节蛋白NPR1的上调表达,本试验结果与之相一致。

在20世纪的70～80年代期间，我国针对城市污水湿地问题陆续开展相关技术项目，并得出多种有效的净化工艺方法，建立规模不同的示范工程。研究发现，采用芦苇湿地系统的策略，对进一步降低污水中的有机污染物，净化水系统，降低N、P等营养物，降低重金属等都具有显著效果。作为一项投资较少且见效快的项目，芦苇湿地系统同时具备后期维护运行成本低、操作方法相对较为便捷的优点，是对城市污水进行二次处理及利用的一种有效方法。

本研究表明,蔓枯病菌入侵后,PI420145中低含量的乙烯以及高含量的茉莉酸和水杨酸提高了其抗病能力,抑制了蔓枯病菌的继续侵入,而‘白皮脆’中高含量的乙烯以及低含量的茉莉酸和水杨酸使其更易感蔓枯病菌;PI420145在抵御蔓枯病菌的过程中主要通过水杨酸信号途径诱发系统获得性抗性阻止蔓枯病菌的进一步侵染,同时茉莉酸和乙烯信号途径也发挥了一定的作用,PI420145叶片中EIN2、PDF1.2、EDS5和NPR1在接种早期的高表达促使其比‘白皮脆’更早一步对蔓枯病菌的侵染作出反应;而在‘白皮脆’中,主要是由茉莉酸和乙烯介导的基础抗性发挥了一定的作用,但未能进一步阻止蔓枯病菌的侵染。此外,在蔓枯病菌侵染后,PI420145中的水杨酸途径和茉莉酸途径存在拮抗作用。但具体的抗性机制还有待于进一步研究。

蔓枯病菌采用A型菌株,利用李英等[13]的方法分离纯化得到,在PDA培养基上25 ℃黑暗培养7 d后,再在紫外灯下间歇照射(12 h光照/12 h黑暗)培养4 d。在显微镜下利用血球计数板将分生孢子悬浮液配制成1×106 mL-1。

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应用在石油生产运输中污染土壤的化学修复技术主要包括化学氧化技术、光催化降解技术、化学淋洗技术和化学改良技术。用化学方法修复污染土壤具有见效快、针对性强等优点，但是其最大的弊端在于易引起二次污染。但是其中光催化降解技术是一种新兴的土壤处理技术，具有无二次污染的优点。并且在生物表面活性剂应用于化学淋洗技术后，也大大降低了化学淋洗技术的二次污染风险。

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2.6 在2#仓滑模施工时为增加上人梯的稳定，也须进行连墙件预埋钢板的埋设，其水平间距L1=1.2m，每层5个，竖向间距为 H1=3.6m。

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自莱比锡大学分开后，蔡元培与但采尔十多年未见，想不到会因民族学会议而在异国相逢，双方感到分外亲切，谈论最多的却是民族学研究。但采尔告诉蔡元培，汉堡民族博物馆有极丰富的民族学资料，并竭力邀请他去该校专研民族学。蔡元培对民族学研究本身就充满热情，德国汉堡有很好的研究条件，又有这么一位好友邀请，便愉快地答应了。

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总体上,接种蔓枯病菌后,PI420145叶片中的乙烯含量低于‘白皮脆’,但在接种0和7 d时茉莉酸含量均高于‘白皮脆’,并且水杨酸含量也基本高于‘白皮脆’。

[21]　　　Govrin E M,Levine A. The hypersensitive response facilitates plant infection by the necrotrophic pathogen Botrytis cinerea[J]. Current Biology,2000,10(13):751-757.

[22]　　　Delaney T P,Uknes S,Vernooij B,et al. A central role of salicylic acid in plant disease resistance[J]. Science,1994,266(5188):1247-1250.

[23]　　　Wildermuth M C,Dewdney J,Wu G,et al. Isochorismate synthase is required to synthesize salicylic acid for plant defence[J]. Nature,2001,414(6863):562-565.

[24]　　　徐兵划,钱春桃,王红英,等. 甜瓜蔓枯病抗性聚合材料中防卫基因的表达分析[J]. 南京农业大学学报,2014,37(5):63-68. DOI:10. 7685/j.issn.1000-2030.2014.05.010.

Xu B H,Qian C T,Wang H Y,et al. The expression analysis of defense genes in the genes pyramided melon(Cucumis melo L.)resistance to gummy stem blight[J]. Journal of Nanjing Agricultural University,2014,37(5):63-68(in Chinese with English abstract).

1.2.2 生长指标的测定 2015年、2016连续于7月中旬测定4种模式下油用牡丹地径、冠高、冠幅、枝顶高、叶量和复叶数等生长指标，每种模式随机测定30个植株。2016年观测油用牡丹的复叶数、复叶总数、结果荚枝数以及角数。

3、分闸线圈的原因。如果由于分闸线圈在操作次数上使用过多，导致温度过高而烧毁，或者由于分闸后线圈的内部铜套并不圆，或者不光滑、有毛刺等状况都会产生卡阻，影响操作机构的顺利分闸。

[25]　　　刘佳. 美洲南瓜苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因克隆、表达分析及品种抗灰霉病研究[D]. 兰州:甘肃农业大学,2013.

Liu J. Cloning and expression analysis of phenylalanine ammonialyase gene(PAL)from Cucurbita pepo and the study on varieties resistance to Botrytis cinerea[D]. Lanzhou:Gansu Agricultural University,2013(in Chinese with English abstract).

[26]　　　Zhang Y,Xu S,Ding P,et al. Control of salicylic acid synthesis and systemic acquired resistance by two members of a plant-specific family of transcription factors[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(42):18220-18225.

[27]　　　高婷婷. 大白菜抗霜霉病防御信号途径中相关基因的表达分析[D]. 扬州:扬州大学,2013.

城镇居民人均可支配收入既可以宏观地反映经济发展水平，又可以微观地体现居民的生活质量。陈迅和CAYLA J等发现收入与居民能源消费量之间存在正相关关系，认为居民收入对能源消费量影响的主要原因在于收入水平对居民生活能源消费中设备购买的束缚。收入对电能消费有影响显著，收入水平越高，相应的电能消费也越多。［21-22］因此，本文选取城镇居民人均可支配收入为财富因素的代表性指标。

Gao T T. Expression analysis of major genes involved in signaling pathways during infection of Chinese cabbage with Hyaloperonospora parasitica[D]. Yangzhou:Yangzhou University,2013(in Chinese with English abstract).

[28]　　　武健东,洪玲,江海洋,等. 玉米抗病相关基因NPR1的同源克隆及表达分析[J]. 安徽农业大学学报,2015,42(5):651-656.

Wu J D,Hong L,Jiang H Y,et al. Cloning and expression analysis of the disease-related gene NPR1 in maize[J]. Journal of Anhui Agricultural University,2015,42(5):651-656(in Chinese with English abstract).

【案例5】在双曲线的标准方程中，设计捕鱼达人中奖程序，让学生将焦点在x轴的双曲线和焦点在y轴的双曲线所对应的性质写在卡通小鱼下面，让学生捕捉小鱼到正确的渔网中，这样的演练使学生蠢蠢欲动，跃跃欲试。