拟轮枝镰孢[Fusarium verticillioides(Sacc.)Nirenberg]是水稻恶苗病的重要病原菌。它的有性态是串珠赤霉(Gibberella moniliformis),属于藤仓赤霉复合种(G. fujikuroi species complex,GFC)。该菌可引起多种作物的严重病害,可以引起玉米幼苗、茎、穗、籽粒病害[1];是西南地区引起玉米穗腐病的主要病原真菌[2-3];也可以引起骏枣黑点病[4];还能为害香蕉[5]、高粱[6]等。另外,该病原菌在定殖过程中会产生一些结构相关的聚酮毒素,其中B1型伏马菌素(FB1)是最主要的伏马菌素类型,可导致马的脑白质软化症以及猪的肺水肿,还会引起人类疾病如癌症和先天性畸形等[7]。

针对考试大纲侧重内容，依据学情、导游职业素养能力要求及考试题型，广泛收集资料，选取多种教学素材，进行课前、课中、课后整个教学过程的教学资源准备与课件设计，并将其上传到智慧课堂网络平台，以供教学和学生学习与保存。

杰乐贝干酒庄成立于1828年，坐落于法国波尔多圣爱美隆葡萄园的中心地带，有近200年酿造历史，拥有28000平方米生产面积、20000平方米仓储面积、4条灌装线。酒庄拥有专业的酿酒团队，对葡萄进行精心挑选，根据市场的需求使用创新工艺酿造精品酒款。一直以来，杰乐贝干都是圣爱美隆的酿酒先驱，2006年，酒庄被ADVINI集团收购，倡导使用可持续发展的生产理念，并且获得众多国际组织严格的可持续发展认证。

1.2 仪器和试剂 利用SLAN-965全自动医用PCR分析系统进行检测，主要试剂由潮州凯普生物化学有限公司提供的高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）。

水稻恶苗病的发生遍及亚洲和其他的水稻产区,该病最明显的症状是感染的水稻幼苗黄化和徒长,成株的根、冠、茎、叶鞘和穗也会受到感染。水稻恶苗病是种传病害,并且主要是通过种子调运而传播的[8-9]。目前的研究表明,水稻恶苗病是拟轮枝镰孢(F.verticillioides)、藤仓镰孢(F.fujikuroi)、层出镰孢(F.proliferatum)和F.andiyazi[10]导致的。其中,拟轮枝镰孢、藤仓镰孢、层出镰孢都属于GFC复合种。到目前为止,GFC复合种至少由10个不同的交配型群体(A～J)组成[11-12],拟轮枝镰孢属于交配型群体A,藤仓镰孢属于交配型群体C,层出镰孢属于交配型群体D[13-14]。GFC复合种内成员形态特征非常相似,难以区分,如藤仓镰孢和层出镰孢,仅采用形态分类学方法常导致鉴定错误[15]。过去已有的水稻恶苗病诊断方法包括病原菌分离鉴定和基于PCR的分子检测,这些技术或所需诊断时间长,或诊断结果准确度低。因此,有必要建立快速诊断由拟轮枝镰孢引起的水稻恶苗病的新技术。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是由日本荣研株式会社的Notomi等[16]研发的。该技术的特点是设计4条特异性引物,包括正向外引物、正向内引物、反向外引物和反向内引物,对应于6个区域的靶基因序列;它可以在恒定温度扩增目标基因(60～65 ℃),这是由于链置换DNA聚合酶(即Bst DNA polymerase)的作用;30～80 min便可观测结果,具有操作简单、特异性强、灵敏度高、产物易检测等特点[17]。由于反应前在反应管内加入了羟基萘酚蓝(HNB),反应结束后可对结果进行直接的判定。阳性呈天蓝色,阴性则仍然为紫色[18],

吃饱肚子，早日脱贫致富，一直以来是浔龙河村全体村民的共同心愿，但苦于没有好的致富门路。直到9年前，浔龙河村还是“省级贫困村”。

本研究将3-磷酸甘油酸激酶(3-phosphoglyceric phosphokinase)基因Pgk作为靶标,建立了拟轮枝镰孢的LAMP检测技术。通过直接检测田间疑似病害样本病组织中的拟轮枝镰孢,可以快速诊断由拟轮枝镰孢引起的水稻恶苗病。

1　材料与方法

1.1　供试菌株

拟轮枝镰孢标准菌株(ATCC MYA-4922)购自美国模式培养物保藏所(ATCC)。所有供试菌株(表2)经过形态学观察和ITS(内转录间隔区)、TEF-1α(翻译延伸因子)序列比对鉴定,保存在南京农业大学植物保护学院卵菌与真菌分子生物学实验室。

1.2　菌株培养与基因组DNA的提取

[10]　　　Wulff E G,Sørensen J L,Lübeck M,et al. Fusarium spp. associated with rice Bakanae:ecology,genetic diversity,pathogenicity and toxigenicity[J]. Environmental Microbiology,2010,12(3):649-657.

1.3　引物设计与筛选

选择合适的靶标基因是建立具有种间特异性的LAMP检测技术的关键环节。首先查找相关文献选取TEF-1α(translation elongation factor 1 alpha)基因、RPB1(RNA polymerase Ⅱ subunit 1)基因及Pgk基因等一系列潜在靶标。在NCBI网站查找并下载拟轮枝镰孢及其相近种的靶标序列,然后使用BioEdit软件进行序列比对,对各个靶标依次比对筛选。在序列比对分析时,我们发现Pgk基因在拟轮枝镰孢种内的不同菌株间高度保守,在镰孢菌种间有明显差异,因此将Pgk基因作为检测拟轮枝镰孢的首要备选靶标。在拟轮枝镰孢的Pgk序列中选取一段特异序列(300～400 bp)作为目标序列,用Primer Explore V4软件在线设计引物。根据引物长度、引物自由能及GC含量等,从软件设计的多组引物中选取部分进行筛选。我们对种内不同来源的菌株进行通用性试验,与属内相近种以及属间多种病原菌进行特异性试验,最终筛选出一组通用性好、特异性强、灵敏度高、能快速准确地检测拟轮枝镰孢的引物(表1)。引物由金斯瑞公司合成后用ddH2O溶解。

首先，采取开放合作的态度。搭建党史院系与高校交流合作平台，加强制度对接。不同系统之间的通信的党史研究会议上，形成长效机制，促进党史研究通过研讨会和其他形式的各种系统之间的人才流动，构建人才就业机制有利于党史研究和开放系统的发展，不断加强和有关部门，社会力量和党史研究的多方联动，建立有效的评价体系，实现党史研究的联动，形成合力。二是加强党史教育培训。深化全面普及，教育在党的历史上是一个重要手段，加强地方政府之间的通信系统和部门，真正使党的历史进企业、进农村、进机关、进军营，进入校园，进入社区，以便所有人都能感受到活力党的历史，党的历史的力量。

1.4　LAMP反应体系和结果判断

本研究使用的LAMP反应体系(26 μL)为:2.5 μL 10×ThermoPol Buffer[0.1% Triton-X,20 mmol·L-1 Tris-HCl,10 mmol·L-1 KCl,10 mmol·L-1(NH4)2SO4,pH8.8],4 μL MgSO4(50 mmol·L-1),4 μL 甜菜碱(5 mol·L-1),3.5 μL dNTPs(10 mmol·L-1),FIP和BIP引物(20 μmol·L-1)各2 μL,F3和B3引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL,LF和LB引物(10 μmol·L-1)各1 μL,2 μL HNB(2.4 mmol·L-1),1 μL Bst DNA 聚合酶(8 U·μL-1),2 μL模板DNA。62 ℃恒温反应70 min。每次反应设置阳性对照(标准拟轮枝镰孢DNA作为模板)和阴性对照(ddH2O作为模板),试验至少重复3次。以HNB为反应指示剂,反应后肉眼观测反应管颜色变化判断结果,阳性为天蓝色,阴性为紫色。

 

表1　拟轮枝镰孢的LAMP引物Table 1　The LAMP primers used for Fusarium verticillioides

  

引物名称Primername引物序列(5'→3')Primersequence长度/bpLengthF3(forwardouterprimer)CCCACGCTACATGATGCTAA20B3(backwardouterprimer)GATCTTGTCGGAGACCTTGG20FIP(forwardinnerprimer)(F1c+F2)GAAACCGGAGGCCTTCTGGGCTTTCGGCACTGCTCACC38BIP(backwardinnerprimer)(B1c+B2)GAAGGAGCTCGAGTACTTCGCCAGGATGGCGAGGAAAGGA40LF(loopforwardprimer)AGGTCGACACCGACCATG18LB(loopbackwardprimer)AAGGCTCTCGAGGAGCCCAAG21

1.5　特异性试验

为了评价拟轮枝镰孢LAMP检测方法的特异性,首先,通过检测不同来源的拟轮枝镰孢菌株(表2)基因组DNA来进行试验;然后选择水稻上其他的病原菌,其他寄主上的镰孢菌和非镰孢菌(表2)的基因组DNA进行LAMP扩增。反应结束后观察颜色的变化,判定LAMP反应的特异性。

 

表2　供试菌株及LAMP检测结果Table 2　The isolates tested and results of FvPgk-LAMP assays

  

种名Species寄主Host来源Origin菌株数量No.ofstrain检测结果Results拟轮枝镰孢F.verticillioides玉米MaizeAmerica(ATCCMYA-4922)1+水稻Rice江苏Jiangsu4+大豆Soybean山东Shandong1+大豆Soybean江苏Jiangsu1+大豆Soybean安徽Anhui1+藤仓镰孢F.fujikuroi水稻Rice江苏Jiangsu2-大豆Soybean山东Shandong1-层出镰孢F.proliferatum水稻Rice江苏Jiangsu2-大豆Soybean山东Shandong1-F.andiyazi水稻Rice江苏Jiangsu1-尖镰孢F.oxysporum大豆Soybean湖北Hubei1-木贼镰孢F.equiseti大豆Soybean安徽Anhui5-禾谷镰孢F.graminearum小麦Wheat江苏Jiangsu1-茄腐镰孢F.solani大豆Soybean安徽Anhui1-黄色镰孢F.culmorum大麦BarleyDenmark(CBS417.86)1-燕麦镰孢F.avenaceum大豆Soybean江苏Jiangsu1-厚垣镰孢F.chlamydosporum大豆Soybean北京Beijing1-三线镰孢F.tricinctum大豆Soybean江苏Jiangsu1-长足镰孢F.longipes大豆Soybean山东Shandong1-甘蔗镰孢F.sacchari大豆Soybean山东Shandong1-变红镰孢F.incarnatum大豆Soybean山东Shandong1-锐顶镰孢F.acuminatum大豆Soybean北京Beijing1-稻瘟病菌Magnaporthegrisea水稻Rice江苏Jiangsu1-平头炭疽Colletotrichumtruncatum大豆Soybean江苏Jiangsu1-胶孢炭疽C.gloeosporioides大豆Soybean山东Shandong1-多主棒孢Corynesporacassiicola大豆Soybean未知Unknown1-大豆炭腐病菌Macrophominaphaseolina大豆Soybean江苏Jiangsu1-大豆紫斑病菌Cercosporakikuchii大豆Soybean湖北Hubei1-立枯丝核Rhizoctoniasolani大豆Soybean安徽Anhui1-冬青丽赤壳Calonectriailicicola大豆Soybean江苏Jiangsu1-玉蜀黍平脐蠕孢Bipolarismaydis大豆Soybean江苏Jiangsu1-米曲霉Aspergillusoryzae大豆Soybean美国America1-大豆北方茎溃疡病菌Diaporthephaseolorumvar.caulivora大豆Soybean未知Unknown1-大豆南方茎溃疡病菌Diaporthephaseolorumvar.meridionalis大豆Soybean未知Unknown1-大豆茎褐腐病菌Phialophoragregataf.sp.sojoae大豆Soybean未知Unknown1-大豆拟茎点种腐病菌Phomopsislongicolla大豆Soybean湖北Hubei1-大豆疫霉Phytophthorasojae大豆Soybean江苏Jiangsu1-瓜果腐霉Pythiumaphanidermatum大豆Soybean江苏Jiangsu1-终极腐霉P.ultimum大豆Soybean江苏Jiangsu1-大丽轮枝Verticilliumdahliae棉花Cotton江苏Jiangsu1-

1.6　灵敏度试验

测定标准拟轮枝镰孢基因组DNA的浓度后,进行10倍梯度浓度稀释,获得质量浓度分别为10 ng·μL-1、1 ng·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1和100 fg·μL-1的拟轮枝镰孢基因组DNA,进行LAMP扩增。反应结束后观察颜色的变化,确定拟轮枝镰孢LAMP检测体系的灵敏度。

1.7　人工接种水稻发病组织中拟轮枝镰孢的检测

将水稻种子催芽后播种于装满蛭石和营养土的塑料盆中,在25 ℃温室中生长20 d。取培养3～5 d的拟轮枝镰孢,切取5 mm×5 mm的菌丝块接种水稻下胚轴,继续置于25 ℃温室培养5 d。取病组织 200 mg,使用天根生化(北京)公司的新型植物组织提取基因组试剂盒(离心柱型),按照说明书的方法提取病组织DNA。将提取的病组织DNA作为模板用于LAMP扩增,同时提取接种空白PDA的健康植株组织DNA作为对照。

1.8　水稻恶苗病样本中拟轮枝镰孢的检测

为了验证所建立的拟轮枝镰孢LAMP检测技术诊断由该病原菌所致水稻恶苗病的可行性,于2016年从江苏南京和镇江采集疑似水稻恶苗病样本,选取典型发病部位,清洗晾干,使用DNAsecure Plant Kit提取病组织DNA,将其作为模板用于LAMP扩增,并以标准拟轮枝镰孢菌株DNA作为阳性对照,ddH2O作为阴性对照。

2　结果与分析

2.1　拟轮枝镰孢LAMP(FvPgk-LAMP)检测的特异性

对于校内各学生组织的新媒体，要提高队伍的专业性，只能靠定期的培训。不管是各新媒体的指导老师还是从事大量新媒体日常运行具体工作的学生，都可以实行培训准入制度。安排一些新媒体相关课程、讲座等的学习，通过考试等方式评价他们对新媒体相关知识的掌握情况。在现如今日新月异的社会环境和科技环境下，这种培训绝不是一劳永逸的，而是需要定期培训，不断更新。

  

图1　LAMP检测不同来源的拟轮枝镰孢Fig.1　Specificity of the LAMP assay using F.verticillioides strains from various origins　　1.阳性对照Positive control;2～4.拟轮枝镰孢(水稻,南京)F.verticillioides(rice,Nanjing,Jiangsu Province);5～7.拟轮枝镰孢(水稻,镇江)F.verticillioides(rice,Zhenjiang,Jiangsu Province);8.拟轮枝镰孢(大豆,南京)F.verticillioides(soybean,Nanjing,Jiangsu Province);9.拟轮枝镰孢(大豆,宿州)F.verticillioides(soybean,Suzhou,Anhui Province);10.拟轮枝镰孢(大豆,济宁)F.verticillioides(soybean,Jining,Shandong Province);11.阴性对照Negative control.

以拟轮枝镰孢标准菌株DNA作为阳性对照,以ddH2O代替DNA作为阴性对照,用镰孢菌近似种和其他非镰孢菌(表2)的基因组DNA为模板进一步验证该检测技术的特异性。结果显示除阳性对照外均呈阴性反应,表明建立的FvPgk-LAMP体系具有的特异性,可以将拟轮枝镰孢与其他病原菌区分开来(表2、图2)。

  

图2　LAMP检测其他病原菌的特异性Fig.2　Specificity of the LAMP assay for other pathogens　　1.阳性对照Positive control;2～4.藤仓镰孢F.fujikuroi;5～6.层出镰孢F.proliferatum;7.F.andiyazi;8.尖镰孢F.oxysporum;9.木贼镰孢F.equiseti;10.禾谷镰孢F.graminearum;11.茄腐镰孢F.solani;12.黄色镰孢F.culmorum;13.燕麦镰孢F.avenaceum;14.厚垣镰孢F.chlamydosporum;15.三线镰孢F.tricinctum;16.长足镰孢F.longipes;17.甘蔗镰孢F.sacchari;18.变红镰孢F.incarnatum;19.锐顶镰孢F.acuminatum;20.稻瘟病菌Magnaporthe grisea;21.平头炭疽Colletotrichum truncatum;22.胶孢炭疽C.gloeosporioide;23.多主棒孢Corynespora cassiicola;24.大豆炭腐病菌Macrophomina phaseolina;25.大豆紫斑病菌Cercospora kikuchii;26.立枯丝核Rhizoctonia solani;27.冬青丽赤壳Calonectria ilicicola;28.玉蜀黍平脐蠕孢Bipolaris maydis;29.米曲霉Aspergillus oryzae;30.大豆南方茎溃疡病菌Diaporthe phaseolorum var.caulivora;31.大豆北方茎溃疡病菌Diaporthe phaseolorum var.meridionalis;32.大豆茎褐腐病菌Phialophora gregata f.sp.sojae;33.大豆拟茎点种腐病菌Phomopsis longicolla;34.大豆疫霉Phytophthora sojae;35.瓜果腐霉Pythium aphanidermatum;36.终极腐霉P.ultimum;37.大丽轮枝Verticillium dahliae;38.阴性对照Negative control.

2.2　拟轮枝镰孢LAMP(FvPgk-LAMP)体系的灵敏度

对拟轮枝镰孢基因组DNA进行10倍梯度稀释(从10 ng·μL-1到100 fg·μL-1),以其作为模板进行LAMP扩增反应。结果如图3所示:1号为阳性对照,8号为阴性对照,2～4号均呈阳性反应,而5～7号呈阴性反应,表明该检测体系的灵敏度为100 pg·μL-1。

  

图3　LAMP体系的灵敏度Fig.3　Sensitivity of LAMP assay using serially diluted genomic DNA from F.verticillioides　　1.阳性对照Positive control;2. 10 ng·μL-1;3. 1 ng·μL-1;4. 100 pg·μL-1;5. 10 pg·μL-1;6. 1 pg·μL-1;7. 100 fg·μL-1;8. 阴性对照Negative control.

2.3　FvPgk-LAMP检测人工接种发病的水稻病组织中的拟轮枝镰孢

提取接种发病的水稻病组织基因组DNA,用LAMP技术进行检测,结果如图4显示:接种发病的水稻病组织样本均呈阳性,而健康的水稻植株检测结果为阴性。这表明建立的LAMP检测体系可以从发病的水稻病组织中准确地检测出拟轮枝镰孢,因而可以用于拟轮枝镰孢引起的水稻恶苗病的快速诊断。

  

图4　FvPgk-LAMP检测水稻发病组织中的拟轮枝镰孢Fig.4　Detection of F.verticillioides in inoculated rice by FvPgk-LAMP assay　　1.阳性对照Positive control;2～4.接种拟轮枝镰孢的水稻病组织DNA from inoculated tissues;5～7.健康植物组织DNA from healthy tissues;8.阴性对照Negative control.

2.4　FvPgk-LAMP检测田间发病的水稻病组织中的拟轮枝镰孢

使用该技术对2016年从江苏南京和镇江采集的21份疑似水稻恶苗病样本进行检测,其中10份样本检出拟轮枝镰孢。同时,我们对所有21份样本进行分离,并从10份阳性样本中的4份分离到拟轮枝镰孢,而阴性样本未分离到该菌。结果表明,本研究所建立的FvPgk-LAMP检测技术可以从田间采集的病组织中直接特异性地检测出拟轮枝镰孢,从而可以用于由该病原菌引起的水稻恶苗病的诊断。与传统诊断方法相比,此技术能够更加快速准确地得到诊断结果,从发病组织DNA提取到获得LAMP检测结果只需2 h左右。

3　结论与讨论

水稻恶苗病是重要的种传病害,在国内外均有发生,我国许多稻区发病尤为普遍。水稻恶苗病常导致谷粒播后不发芽或不出土,这造成了水稻严重减产[22-24]。常见的症状是水稻苗徒长,但也有部分病株呈现矮化或外观正常,这为水稻恶苗病的诊断带来了极大的困难。目前,关于水稻恶苗病病原菌的研究大都集中于传统的分离鉴定技术[25-26],但分离方法不易得到全部的病原菌,而且耗时费力。分子鉴定技术主要是PCR-RFLP鉴定,Steenkamp等[27]基于H3基因建立了Fusarium circinatum(属于GFC复合种交配型群体H)的PCR-RFLP鉴定方法,该方法可以区分几乎所有GFC复合种交配型群体A～H的物种,但是无法区别藤仓镰孢菌和层出镰孢菌。Suga等[28]基于TEF基因建立了藤仓镰孢菌(F. fujikuroi)的PCR-RFLP鉴定方法,可以与GFC复合种的其他物种进行区分。然而,这种检测方法存在需要热循环、特异性不足、扩增效率较低等缺陷[17]。本研究建立的LAMP技术体系有以下优点:对模板DNA的纯度要求较低,可以从田间样本病组织的混合DNA中检测到目标菌;反应更快速,2 h左右即可完成病害诊断;反应结果更容易判别,由于HNB的加入,反应后可通过肉眼观察颜色变化直接判别结果。

社会学上认为同辈群体在青少年的社会化过程中发挥着非常重要的作用，在与同辈群体的频繁互动中，青少年极容易习得其他成员的价值观和行为方式。同辈群体的亚文化以及非正式的制约力也会对青少年形成非常大的压力，让青少年服从同辈群体的行为规范。如果身边有一群吸毒的朋友，那么吸毒就会成为行为规范，如果不吸毒就会和他们无话可说，被他们排斥。这种情况下，很多青少年都会选择吸毒。因此，青少年一定要慎重地结交朋友，遇到吸毒的朋友一定要远离。

近年来,操作简单、特异性强、灵敏度高、结果易判别的优势使得LAMP方法被广泛应用到多个领域,如细菌、病毒、寄生虫的检测,还被用于真菌和卵菌的鉴定。戴婷婷等[29]建立了橡树疫霉(P.ramorum)的LAMP检测技术;陆辰晨[30]基于CYP51C基因建立了可以分别特异性检测引起大豆镰孢根腐病的尖镰孢(F. oxysporum)、木贼镰孢(F.equiseti)、禾谷镰孢(F.graminearum)的3个LAMP技术体系,基于TEF-1α基因建立了茄腐镰孢(F.solani)和层出镰孢(F.proliferatum)的2个LAMP技术体系,还基于ITS基因建立了检测导致大豆立枯病的立枯丝核(Rhizoctonia solani)与导致大豆炭腐病的菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina)的2个LAMP技术体系;曾丹丹等[31]还将环介导等温扩增技术应用于大豆种子带菌的检测。将LAMP应用于真菌和卵菌的检测,设备简单、反应时间短、结果易判定,特别适用于在检验检疫机构和基层农业科研与管理单位使用。

本研究以Pgk基因作为靶标,设计并筛选出一组特异性引物,建立了从水稻组织中直接鉴定拟轮枝镰孢的FvPgk-LAMP检测技术,为从发病水稻样本检测拟轮枝镰孢,进而快速诊断由拟轮枝镰孢引起的水稻恶苗病提供了一种有效的方法。该技术已被成功应用于中国江苏南京和镇江疑似水稻恶苗病的快速诊断。

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Chen X J,Wen C J. Preliminary study of maize ear rot in Sichuan[J]. Journal of Southwest Agricultural University,2002,24(1):21-23(in Chinese with English abstract).

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Zhang X F,Zou C J,Li X,et al. Identification of pathogen causing maize ear rot and inoculation technique in southwest China[J]. Journal of Southwest Agricultural University,2012,25(6):2078-2082(in Chinese with English abstract).

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[9]　　　Webster R K,Gunnell P S. Compendium of Rice Diseases[M]. St. Paul,Minn:The American Phytopathological Society Press,1992.

将供试腐霉和疫霉转接到V8固体培养基平板上[19],其他菌株转接到PDA(马铃薯葡萄糖固体培养基)平板上,25 ℃黑暗条件下培养3 d后,在菌落边缘切取10个菌丝块(2 mm×2 mm)。腐霉和疫霉菌丝块转移至V8液体培养基,其他菌株菌丝块转移至PDB(马铃薯葡萄糖液体培养基)[20],25 ℃培养5～7 d,过滤PDB液体后收集菌丝,并经灭菌滤纸吸干后液氮冷冻研磨成菌丝粉,-70 ℃冰箱保存备用。运用CTAB法提取菌丝DNA[21],并保存于-20 ℃。采用Nanodrop 2000分光光度计测定DNA浓度。

[11]　　　Leslie J F,Anderson L,Bowden R L,et al. Inter- and intra-specific genetic variation in Fusarium[J]. International Journal of Food Microbiology,2007,119:25-32.

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根据应用服务层提供的应用接口，可以实现对在押人员身体状况的健康管理、病情研判，并使医护人员结合病情实施有效的疾病和治疗干预方案；同时对Web 平台用户和移动通讯终端（Android、iOS）提供了医疗健康信息以及数据分析和信息挖掘服务的接口，帮助用户更好的对生命体征数据进行预测和分析预判。

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以拟轮枝镰孢标准菌株DNA为阳性对照,以ddH2O代替DNA为阴性对照,检测了不同来源的拟轮枝镰孢菌株,结果(图1、表2)显示所有菌株均呈阳性反应。这表明本研究所建立的LAMP检测技术可以用于检测不同来源的拟轮枝镰孢。

在水利工程的施工过程中，需要将环境保护纳入监理人员的工作内容中，从而在施工过程中对资源的利用、现场生活用水、水源污染、空气气质量检测、植被恢复、水土流失的治理等内容进行严格的监督与管理，并且环保部门要进行阶段性检查，从而落实环保型施工的各项措施，更好地促进水利工程可持续发展建设。

1.4 研究方法 对照组患儿使用匹多莫德口服液(苏州长征-欣凯制药有限公司，国药准字H20030464，0.4 g/次，2次/d)，观察组患儿联合使用匹多莫德(苏州长征-欣凯制药有限公司，国药准字H20030464，0.4 g/次，2次/d)和葛根素(青岛金峰制药有限公司，国药准字H20010174，0.4 g/次，1次/d)治疗，治疗时间均为4周。

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[19]　　　郑小波. 疫霉菌及其研究技术[M]. 北京:中国农业出版社,1997.

那么如何激发学生的学习主动性，如何实现师生之间的线上教学互动，如何帮助老师实现微课教学、翻转课堂等等成为现在亟待解决的问题。原来传统的教学资源和教学模式不能适应移动学习需求，我们需要开发建设适合移动终端学习的数字化学习资源，探索“互联网+”环境下的高职信息化教学模式改革的方法。

Zheng X B. Phytophthora spp. and Its Research Technique[M]. Beijing:Chinese Agriculture Press,1997.

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以往研究在进行医院经济运行分析时还存在一些问题。首先，使用的方法以描述性分析为主，建议未来随着研究的深入，可进一步结合多变量因素分析等其他分析方法；其次，评价对象较少涉及中医医院等专科医院，缺乏专科医院与综合医院的比较。因此，未来可针对中医等专科医院进行经济运行分析，并和其他类型的医院进行比较，此外，由于医院各科室间差异较大，故亦可进行医院各科室间的经济运行分析；最后，在评价指标体系的构建和发展上，较少使用多种统计学方法来筛选指标，某些指标间可能存在很强的相关性，因此，在根据经验的基础上，未来可考虑搭配其他的统计学方法筛选评价指标，此外，亦可发展适用于各类型医院的评价指标体系。

[22]　　　陈利锋,徐敬友. 农业植物病理学[M]. 北京:中国农业出版社,2007.

Chen L F,Xu J Y. Agricultural Phytopathology[M]. Beijing:Chinese Agriculture Press,2007.

商家回应：非常抱歉客官，这次服务没有监管到位给您带来不愉快，再次向您表示歉意，每个客人提出的意见我们都会非常重视，便于我们更好的管理提高以后细节方面的服务质量，望您给我们提供确切的信息或者电话我们177XXXXXXXX，我们一定会不厌其烦的第一时间为您解决，去落实，去整改。再次感恩您提出的宝贵意见，祝您生活愉快。

[23]　　　季芝娟,马良勇,李西明,等. 水稻品种恶苗病抗性快速鉴定方法研究[J]. 浙江农业科学,2008,1(1):89-91.

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