植物不定芽的再生是一个多级发育过程,其中包括体细胞对于植物激素信号的感知与传递、启动细胞分裂增殖、获得具有器官再生能力的去分化以及形成器官的再分化过程[1-3]。1986年,Feldmann等[4]建立了拟南芥不定芽再生的高效培养体系。首先将拟南芥外植体预培养在富含生长素的愈伤组织诱导培养基(callus induction medium,CIM)上,再将外植体移至富含细胞分裂素的芽诱导培养基(shoot induction medium,SIM)[5-6]。不定芽再生被广泛运用于植物快速繁殖和作物遗传改良等生物技术过程中[1,7]。因此,深入研究两步培养法中不定芽发生的机制具有重要的理论和应用价值。

拟南芥过量表达细胞分裂素的hoc突变体在不含植物激素的培养基上能由根外植体发育形成完整植株[8],而过量表达细胞分裂素负调控因子A型ARR则会抑制不定芽的形成[9]。对生长素应答启动子DR5的研究发现,在诱导愈伤组织阶段生长素响应被显著促进[10]。不定芽再生过程早期生长素相关基因如AUX/IAA在CIM预培养时表达量上调[11]。细胞分裂素调节基因在SIM上培养时表达量上调[12],SIM培养基上芽的形成会促进芽顶端分生组织细胞分裂素响应信号的再分布[13]。此外,生长素和细胞分裂素信号途径还会调节芽感应能力,诱导其他基因的表达。CUC2(CUP-SHAPED COTYLEDON2)基因的表达在增殖的愈伤组织中明显上调[14]。而一些与分生组织形成相关的基因比如WUS(WUSCHEL)、 CLV3(CLAVATA3)等基因则不在愈伤组织中表达[13]。还有研究表明在芽出现之前许多编码信号和转录元件的基因显著上调,在这些阶段有大量基因调节活动在发生改变[15],因此深入探讨在愈伤组织形成及离体芽再生阶段相关基因的表达及其与植物激素的关系,对于研究不定芽再生的分子机制具有重要意义。

Xu等[16]利用基因芯片技术对愈伤组织形成阶段的根外植体和地上部外植体进行了动态转录组分析,发现过量表达转录因子HB52和CRF3的外植体在不添加生长素的培养基上也能产生愈伤组织。Che等[11]利用基因芯片技术研究了拟南芥3种再生途径的基因表达情况,发现了一系列可以作为不同发育过程分子标签的基因。这些研究在一定程度上揭示了部分发育过程的基因调控机制,但所使用基因探针数目有限,只能检测到有限基因的改变。我们采用了RNA-Seq技术对两步培养法中愈伤组织形成阶段及不定芽再生阶段基因的表达情况进行了测序、比较和分析,发现两个阶段众多差异表达的基因及转录物功能单位,并对显著富集的生长素与细胞分裂素合成代谢途径相关基因进行了分析,为揭示不定芽发生的分子和激素调控机制提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

植物材料拟南芥为Columbia生态型(Col-0)。1/2 MS培养基为自配。RNA提取试剂盒、反转录试剂盒等均购自TaKaRa公司。

1.2　愈伤组织生成及不定芽再生培养

拟南芥种子经春化、消毒后直线播撒在含1/2 MS培养基的培养皿上,置于22 ℃、16 h光照/8 h黑暗的条件下培养。培养7 d后,随机切取根尖5 mm的根段,将切取的根段外植体放在富含生长素的愈伤组织诱导培养基(CIM,含2.2 μmol·L-1 2,4-氯化苯氧乙酸,0.2 μmol·L-1激动素的B5培养基)上培养4 d后,再将外植体转移至芽诱导培养基(SIM,含5.0 μmol·L-1异戊烯基腺嘌呤,0.9 μmol·L-1 3-吲哚乙酸的B5培养基)上继续培养,培养温度为21 ℃,光照24 h。

1.3　总RNA的提取

分别取CIM培养基上培养0 d(C0),CIM培养4 d(C4)和SIM培养3 d(S3)的拟南芥根外植体提取总RNA,每个样本点进行3个生物学重复。为了保证提取RNA的质量,每个时间点选取150个根外植体。采用RNeasy Plant Mini Kit(Tiagen,China)提取总RNA。利用DNase Ⅰ(Qiagen,UK)对样品中DNA进行消化处理。所有RNA样本用10 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检查RNA样本的完整性,然后用紫外分光光度计测量RNA浓度,分析D260/D280和D260/D230值,检验RNA样品的浓度和纯度。

1.4　建立cDNA文库和Illumina测序

通过带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA,富集的mRNA利用Oligo(dT)引物和反转录酶合成cDNA的第1、2条链。经限制性内切酶NlaⅢ剪切后,对所得的cDNA片段进行纯化,末端修复及3′末端加‘A’碱基,并将DNA 片段两端连接上特定的测序接头。电泳回收105 bp 大小的DNA片段,PCR 扩增富集测序样本。以上具体试验操作步骤均按照Illumina Gene Expression Sample Prep Kit说明书进行。随后将已加入接头的DNA片段绑定在流通池(flow cell)上进行反应,扩增不同片段。在下一步反应中,4种荧光标记的染料采用边合成边测序(sequencing by synthesis)的原理,使用Illumina HiSeqTM 2000 system对文库进行测序。

根据“四看”（看季节，看天气，看水质，看鱼的活动情况）和“四定”（定时，定点，定质，定量）原则灵活掌握，合理投饵，确保池鱼吃的匀、好、足，降低池鱼饵料系数，增强池鱼体质，增加鱼体免疫力和抗病力，养出的鱼规格大，产量高，肉质鲜美，口感好。

1.5　数据分析

其间，郝哲先后完成了“沙地红枣高效水肥一体化研究与示范”“沙地红枣丰产园建设关键技术集成研究与示范”“沙地鲜食枣设施栽培技术研究与集成应用”等科研项目4项，申请国家专利3项，制订榆林市地方标准技术规范4项；创建了日光温室栽培、塑料大棚栽培和防雨棚栽培3种沙地鲜食枣设施高效栽培模式，突破了栽培设施设计建造、高效栽培模式、优良品种选用、根际土壤复配改良、直播建园、矮化密植、轻简化整形修剪、控产保果、水肥一体化和病虫害绿色防控及扣棚降温与安全升温等现代枣园建设多项关键技术，集成了鲜食枣设施高效栽培技术体系，并在全市多个县区及宁夏等地示范推广，取得了较好的成效。

  

图1　拟南芥芽再生培养体系Fig.1　The in vitro shoot regeneration system with root explants in Arabidopsis thaliana　　A.拟南芥不定芽再生培养体系,红色箭头所指为提取RNA的3个时间点;C0、C4、S3、S6、S20分别代表CIM培养0 d、CIM培养4 d、SIM培养3 d、SIM培养6 d、SIM培养20 d。下同。B.5个不同时期拟南芥根外植体的生长状态,标尺=500 μm。A.The in vitro shoot regeneration system using root as explants in Arabidopsis thaliana,red arrows show times during development when RNA samples were taken;C0,C4,S3,S6 and S20 presented 0 d on CIM,4 d CIM,3 d SIM,6 d SIM,20 d SIM,respectively. The same as follows.B.The pictures of Arabidopsis thaliana root explants in different stages of de novo shoot regeneration,bar=500 μm.

2　结果与分析

2.1　RNA-Seq测序和评估

本研究采用两步培养体系来再生不定芽,首先在富含生长素的CIM上对外植体进行预培养诱导其伤口形成愈伤组织,然后转至富含细胞分裂素的SIM上诱导不定芽的形成(图1-A)[17]。拟南芥在CIM上预培养4 d(C4)后,在根外植体端点部分出现膨大,逐渐形成愈伤组织。再将其移至SIM培养基,培养3 d(S3)外植体膨大更明显,培养至6 d(S6)后根外植体上可见绿点,继续培养绿点颜色逐渐加深。在SIM上培养至20 d(S20)明显可见不定芽的形成(图1-B)。分别提取C0、C4和S3时间点的总RNA,构建cDNA文库,进行RNA-Seq试验。

采取C0、C4和S3三个时间点样本进行RNA-Seq分析,将3个时间点样本分别与拟南芥参考基因进行比对,统计所得有效读段数及其有效读段的比例(表1)。

为了鼓励企业自主研发，我国政府出台了多项企业所得税优惠政策，但在实际运行中这些优惠政策的实施效果如何，需要进行深入细致的研究。这构成了本文的研究重点。

 

表1　样品C0、C4和S3分别与拟南芥参考基因的比对结果Table 1　Alignment statistics of C0,C4,S3 to A.thaliana reference genes

  

指标IndexC0-ⅠC0-ⅡC0-ⅢC4-ⅠC4-ⅡC4-ⅢS3-ⅠS3-ⅡS3-Ⅲ匹配读段数/106 Totalnumberofmappedreads34.634.636.036.037.936.037.036.135.4匹配读段所占比例/%Mappedreadspercentage81.784.885.386.385.585.185.685.484.8Read-1*/10621.220.421.120.922.121.121.621.120.9Read-2*/10621.220.421.120.922.121.121.621.120.9未匹配读段数/106 Totalnumberofunmappedreads7.76.26.25.76.46.36.26.16.3

注:Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ代表不同取样时间点的3个生物学重复;Read-1*和Read-2*分别表示正义链和反义链的有效读段(clean reads)数。

Note:Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ presented 3 biological repeats of different sampling points;Read-1* and Read-2* showed forward and reverse primer derived reads,respectively.

2.2　拟南芥愈伤组织形成阶段差异表达的基因及转录物功能注释与分类

为了检测在愈伤组织形成阶段基因的差异表达情况,我们将C4时间点的基因表达量和C0时间点的进行了比对。FDR≤0.05且差异倍数不低于2倍(|log2FC(C4/C0)|≥1)的基因确定为差异表达基因。依据这些标准,我们共检测到4 332个差异表达基因,有1 399个基因上调,2 933个基因下调。表2为C4与C0(愈伤组织形成阶段)比较前50个差异基因。最显著上调的基因AT3G59580编码转录因子Nin-like家族蛋白。另有编码转录因子TCP家族蛋白的基因AT3G18550、LBD19基因AT2G45410和WRKY 63基因AT1G66600显著上调。另外,一些与胚胎形成相关的基因如晚期胚胎富集蛋白基因(late embryogenesis abundant protein genes,LEA):AT4G21020、AT2G03740、AT2G03850也明显上调。编码与生长素相关的GH3.12(AT5G13320)、GH3.3(AT2G23170)及编码细胞分裂素氧化酶2(cytokinin oxidase 2,CKX2,AT2G19500)的基因也发生了变化。

 

表2　拟南芥愈伤组织形成阶段前50个差异表达的基因Table 2　Top 50 differentially expressed genes during callus formation of A.thaliana

  

基因IDGeneID差异倍数log2FC(C4/C0)P值P-value错误发现率FDR功能注释Descriptions表达量增加的基因Up-regulatedgenesAT3G5958010.9606001.12E-1413.63E-140转录因子NLP9TranscriptionfactorNLP9AT3G4576010.4939802.43E-642.63E-63核苷酸转移酶家族蛋白NucleotidyltransferasefamilyproteinAT1G3396010.1678203.17E-713.82E-70核苷三磷酸水解酶AIG1NucleosidetriphosphatehydrolasesAIG1AT5G583909.4079657.10E-1201.78E-118过氧化物酶67Peroxidase67AT3G136309.3507809.41E-711.12E-69未知蛋白UnknownproteinAT5G527309.2341081.08E-457.93E-45铜运输蛋白CoppertransportproteinAT1G741409.1213133.13E-512.61E-50膜内丝氨酸蛋白酶家族蛋白IntramembraneserineproteasefamilyproteinAT3G604209.0115201.33E-1374.06E-136磷酸甘油酸变位酶家族蛋白PhosphoglyceratemutasefamilyproteinAT5G242108.9972183.08E-401.99E-39α/β水解酶超家族蛋白Alpha/beta-HydrolasessuperfamilyproteinAT1G567108.9001461.11E-1042.23E-103果胶裂解酶类似物家族蛋白Pectinlyase-likefamilyproteinAT5G598108.8237841.69E-339.25E-33亚麻酶家族蛋白SBT5.4SubtilasefamilyproteinSBT5.4AT3G285108.7714412.28E-1245.98E-123含有P环的核苷三磷酸水解酶超家族蛋白P-loopcontainingnucleosidetriphosphatehydrolasessuperfamilyproteinAT2G264008.6527202.31E-1841.20E-182顺式还原酮加双氧酶3Acireductonedioxygenase3AT5G242008.6075021.95E-782.65E-77α/β水解酶超家族蛋白Alpha/beta-HydrolasessuperfamilyproteinAT5G568108.5899081.93E-309.63E-30含有F-box结构域的蛋白F-boxdomains-containingproteinAT4G318708.2311471.83E-268.11E-26谷胱甘肽过氧化物酶7Glutathioneperoxidase7AT4G210208.2008452.23E-582.18E-57晚期胚胎富集蛋白Lateembryogenesisabundantprotein(LEA)familypro-teinAT5G133208.1777421.62E-1576.25E-156生长素响应家族蛋白GH3.12Auxin-responsiveGH3familyproteinGH3.12AT2G195008.1262214.74E-231.88E-22细胞分裂素脱氢酶2Cytokinindehydrogenase2AT4G313808.0141052.28E-1681.00E-166FPF1类似蛋白FPF1-likeprotein1

 

续表2　Table 2 continued

  

基因IDGeneID差异倍数log2FC(C4/C0)P值P-value错误发现率FDR功能注释DescriptionsAT5G241607.9872021.41E-174.65E-17鲨烯环氧酶6Squaleneepoxidase6SQE6AT2G037407.9854891.71E-226.64E-22含有LEA结构域的蛋白LEAdomain-containingproteinAT2G038507.9844088.52E-2468.10E-244晚期胚胎富集蛋白LEAfamilyproteinAT2G231707.96661100生长素响应家族蛋白GH3.3Auxin-responsiveGH3familyproteinGH3.3AT5G593907.9162374.03E-815.69E-80含有XH/XS结构域的蛋白XH/XSdomain-containingproteinAT2G181407.8689489.43E-1132.14E-111过氧化物酶14Peroxidase14AT3G185507.8530491.16E-204.23E-20转录因子TCP18TranscriptionfactorTCP18AT5G099707.8337443.43E-694.01E-68细胞色素CYP78A7CytochromeCYP78A7AT5G593307.7795571.60E-216.03E-21脂质转移蛋白Lipid-transferproteinAT2G053807.7558037.09E-1552.66E-153富含甘氨酸蛋白S3Glycine-richproteinS3AT4G118907.7439401.46E-154.46E-15蛋白激酶超家族蛋白ARCK1ProteinkinasesuperfamilyproteinARCK1AT1G711507.6704461.42E-1213.63E-120未知蛋白UnknownproteinAT2G454107.6667728.77E-1553.28E-153转录因子LBD19TranscriptionfactorLBD19AT5G169807.6549118.60E-761.12E-74锌结合脱氢酶家族蛋白Zinc-bindingdehydrogenasefamilyproteinAT1G666007.6453282.87E-894.65E-88转录因子WRKY63TranscriptionfactorWRKY63AT1G220907.6430448.84E-203.14E-19蛋白质EMB2204ProteinEMB2204AT1G521307.6242073.62E-382.23E-37甘露糖结合凝集素超家族蛋白Mannose-bindinglectinsuperfamilyproteinAT3G572607.6088606.66E-192.29E-18葡聚糖酶BGL2GlucanaseBGL2AT5G527007.5886217.04E-162.18E-15铜转运蛋白CoppertransportproteinAT1G656807.5831083.95E-301.95E-29扩张蛋白B2Expansin-B2AT2G055407.5446227.93E-1422.57E-140富含甘氨酸蛋白Glycine-richproteinAT4G240007.4882206.86E-182.28E-17纤维素合酶类似蛋白G2Cellulosesynthase-likeproteinG2AT2G023207.4470183.97E-151.19E-14韧皮部蛋白PP2-B7PhloemproteinPP2-B7AT1G291007.4453272.33E-177.59E-17重金属转运蛋白HeavymetaltransportproteinAT5G229807.4429851.10E-133.12E-13丝氨酸羧肽酶类似物47Serinecarboxypeptidase-like47AT1G677707.4083161.16E-1453.93E-144末端EAR1类似物2TerminalEAR1-like2AT3G129007.4047232.10E-156.38E-15亚铁依赖型加氧酶超家族蛋白Fe(Ⅱ)-dependentoxygenasesuperfamilyproteinAT1G116007.4017199.83E-2931.40E-290细胞色素CYP77B1CytochromeCYP77B1AT2G418507.33956700聚半乳糖醛酸酶ADPG2PolygalacturonaseADPG2AT5G250407.3267592.99E-411.98E-40未知蛋白Unknownprotein表达量减少的基因Down-regulatedgenesAT3G19710-14.74168.85E-2015.31E-199蛋氨酸转氨酶BCAT4MethionineaminotransferaseBCAT4AT3G01190-13.90774.31E-3106.93E-308过氧化物酶27Peroxidase27AT4G22666-13.64051.35E-2241.05E-222脂质转移蛋白Lipid-transferproteinAT1G54970-13.42112.24E-1578.61E-156富含脯氨酸蛋白1(PRP1)Proline-richprotein1AT5G42180-13.291500过氧化物酶64Peroxidase64AT2G39510-12.92382.77E-592.75E-58WAT1相关蛋白WAT1-relatedproteinAT3G18200-12.89363.43E-2844.65E-282EamA转运类似物家族蛋白EamA-liketransporterfamilyproteinAT5G57625-12.71671.21E-982.26E-97CAP超家族蛋白CAPsuperfamilyproteinAT4G13770-12.61712.31E-2251.82E-223细胞色素P45083A1CytochromeP45083A1AT2G36100-12.584000凯式带膜蛋白1Casparianstripmembraneprotein1AT3G01260-12.52412.96E-1981.74E-196半乳糖变旋酶类似物超家族蛋白Galactosemutarotase-likesuperfamilyproteinAT1G31050-12.51322.41E-2422.25E-240bHLHDNA结合超家族蛋白bHLHDNA-bindingsuperfamilyproteinAT3G05920-12.50103.29E-2332.77E-231重金属转运蛋白HeavymetaltransportproteinAT1G14220-12.41618.55E-1723.90E-170核糖核酸酶T2家族蛋白RibonucleaseT2familyproteinAT1G19900-12.39603.35E-1279.10E-126乙二醛氧化酶相关蛋白Glyoxaloxidase-relatedproteinAT1G64780-12.393600铵基转运物1Ammoniumtransporter1AT1G12090-12.34781.57E-1485.45E-147伸展蛋白类似蛋白Extensin-likeproteinAT2G43880-12.24481.67E-1495.86E-148果胶裂解酶类似物超家族蛋白Pectinlyase-likesuperfamilyproteinAT3G06460-12.23302.78E-2212.08E-219GNS1/SUR4膜蛋白家族GNS1/SUR4membraneproteinfamilyAT5G36140-12.20632.14E-531.86E-52细胞色素CYP716A2CytochromeCYP716A2AT3G55230-12.021200抗病响应家族蛋白Diseaseresistance-responsivefamilyproteinAT1G73330-11.963000干旱抑制蛋白4(DR4)Drought-repressed4AT2G15370-11.87662.94E-1267.86E-125岩藻糖转移酶5Fucosyltransferase5AT1G14160-11.80584.32E-1651.80E-163CASP类似蛋白1A1CASP-likeprotein1A1AT5G46900-11.78543.66E-2142.60E-212脂质转移蛋白Lipid-transferprotein

 

续表2　Table 2 continued

  

基因IDGeneID差异倍数log2FC(C4/C0)P值P-value错误发现率FDR功能注释DescriptionsAT4G25250-11.73181.32E-992.50E-98果胶甲酯酶抑制物家族蛋白PectinmethylesteraseinhibitorfamilyproteinAT1G65310-11.69511.59E-1898.52E-188木葡聚糖水解酶17Xyloglucanhydrolase17AT5G44130-11.68408.69E-385.29E-37类似FASCICLIN的阿拉伯半乳聚糖蛋白13前体FASCICLIN-likearabi-nogalactanprotein13precursorAT4G08410-11.62432.33E-1205.86E-119富含脯氨酸的伸展蛋白类似物家族蛋白Proline-richextensin-likefamilyproteinAT5G15150-11.61623.84E-1681.67E-166转录因子HB-3TranscriptionfactorHB-3AT5G06630-11.58537.84E-891.26E-87富含脯氨酸的伸展蛋白类似物家族蛋白Proline-richextensin-likefamilyproteinAT3G45680-11.55555.06E-1932.78E-191蛋白NRT1/PTR家族2.3ProteinNRT1/PTRFAMILY2.3AT5G61420-11.54161.63E-2411.50E-239转录因子MYB28TranscriptionfactorMYB28AT4G14060-11.49804.71E-897.58E-88多聚乙酰环化酶和脂质转运物超家族蛋白PolyketidecyclaseandlipidtransportsuperfamilyproteinAT3G21180-11.49281.47E-1133.38E-112钙离子运输ATP酶9Calcium-transportingATPase9AT2G28780-11.47231.60E-1264.29E-125未知蛋白UnknownproteinAT3G28290-11.44313.10E-905.10E-89跨膜蛋白AT14ATransmembraneproteinAT14AAT1G47600-11.420400芥子酶4Myrosinase4AT4G13390-11.41962.97E-1257.84E-124富含脯氨酸的伸展蛋白类似物家族蛋白Proline-richextensin-likefamilyproteinAT5G04960-11.41921.69E-1516.07E-150果胶酯酶抑制物PectinesteraseinhibitorAT4G22217-11.39478.19E-1442.72E-142防御素类似物蛋白100Defensin-likeprotein100AT4G15290-11.38772.43E-602.46E-59纤维素合酶类似物蛋白B5Cellulosesynthase-likeproteinB5AT4G30170-11.358900过氧化物酶45Peroxidase45AT2G34910-11.30385.65E-1612.26E-159未知蛋白UnknownproteinAT1G20190-11.29191.61E-2081.06E-206扩张蛋白A11Expansin-A11AT3G60280-11.26866.47E-901.06E-88蛋白质UCC3ProteinUCC3AT4G11320-11.216600半胱氨酸蛋白酶CysteineproteinaseAT2G37700-11.19291.34E-1323.90E-131蛋白CER1类似物2ProteinCER1-like2AT3G53980-11.17643.17E-1551.19E-153脂质转移蛋白Lipid-transferproteinAT5G14330-11.15753.52E-1491.23E-147跨膜蛋白Transmembraneprotein

Note:FDR:False discovery rate. The same as follows.

同时,我们也分析了愈伤组织形成阶段下调的基因,发现下调倍数最高的基因AT3G19710编码蛋氨酸转氨酶BCAT4。BCAT4转录物可由伤害诱导在韧皮部大量积累[18]。另几个明显下调的基因AT3G01190、AT5G42180和AT4G30170,它们都编码第三类过氧化物酶,这一类酶与生长素的分解代谢、创伤愈合、木质化等功能相关。编码凯氏带膜域蛋白1(casparian strip membrane domain protein 1,CASP1)的基因AT2G36100表达量也出现下降。CASPs在细胞壁的修饰方面具有重要的指导作用,它通过与分泌型过氧化物酶的相互作用来调节木质素的沉积和凯氏带的形成[19]。另外编码转录因子bHLH DNA结合家族蛋白(AT1G31050)、HD-ZIP homeobox 3(AT5G15150)、MYB28(AT5G61420)的基因明显表达下调。

第二，扶贫参与人员的执行能力水平对扶贫的成果有重要的影响。此外，除了扶贫项项目与资源的管理能力和贫困户的参与力度之外，加强对贫困信息的建设和发展自身的能力非常的重要。

  

图2　拟南芥愈伤组织形成阶段前20个显著富集的转录物GO功能Fig.2　TOP 20 highly enriched GO(Gene Ontology)terms during the callus formation of A.thaliana　　A.显著上调的富集转录物功能条目。The upregulated gene subsets with annotated GO terms. 1.转录调节Regulation of transcription;2.有机物质反应Response to organic substance;3.激素刺激响应Response to hormone stimulus;4.内源刺激响应Response to endogenous stimulus;5.转录Transcription;6.依赖DNA的转录调节Regulation of transcription,DNA-dependent;7.RNA代谢调节Regulation of RNA metabolic process;8.激素刺激细胞反应Cellular response to hormone stimulus;9.激素信号Hormone-mediated signaling;10.生长素刺激响应Response to auxin stimulus;11.乙烯刺激响应Response to ethylene stimulus;12.子叶发育Cotyledon development;13.生长素信号调节通路Auxin mediated signaling pathway;14.激素水平调节Regulation of hormone levels;15.乙烯调节的信号通路Ethylene mediated signaling pathway;16.转录因子活性Transcription factor activity;17.转录调节活性Transcription regulator activity;18.DNA结合DNA binding;19.固有膜Intrinsic to membrane;20.膜完整性Integral to membrane.B.显著下调的富集转录物功能。The downregulated gene subsets with annotated GO terms. 21.氧化还原Oxidation reduction;22.次级代谢过程Secondary metabolic process;23.外部封装结构External encapsulating structure organization;24.细胞壁Cell wall organization;25.过氧化氢分解代谢Hydrogen peroxide catabolic process;26.过氧化氢细胞响应Cellular response to hydrogen peroxide;27.四吡咯结合Tetrapyrrole binding;28.亚铁血红素结合Heme binding;29.铁离子结合Iron ion binding;30.电子载体活性Electron carrier activity;31.氧化还原酶活性Oxidoreductase activity;32.过氧化物酶活性Peroxidase activity;33.离子结合Ion binding;34.阳离子结合Cation binding;35.氧气结合Oxygen binding;36.内膜系统Endomembrane system;37.膜外区Extracellular region;38.质外体Apoplast;39.固有膜Intrinsic to membrane;40.固定于膜Anchored to membrane.

2.3　拟南芥不定芽再生阶段差异表达的基因及转录物功能注释与分类

将S3时间点的基因表达量和C4时间点的进行了比对(FDR≤0.05且|log2FC(S3/C4)|≥1)。发现在不定芽再生阶段有2 910个差异表达的基因,其中上调的基因有2 231个,下调的基因有679个。表3列出了本阶段前50个差异表达的基因。其中有多个基因在愈伤组织形成阶段表达量降低,而在不定芽再生阶段却显著增加,如编码CAP家族蛋白的AT5G57625和编码CASP1的AT2G36100,编码过氧化物酶64的AT5G42180和编码过氧化物酶27的AT3G01190也在不定芽再生阶段出现明显上调。在生长素信号下游起作用并影响侧根形成的转录因子PUCHI以及其共同作用元件LBD16在本阶段出现了明显的下调。

 

表3　拟南芥不定芽再生阶段前50个差异表达的基因Table 3　Top 50 differentially expressed genes during shoot regeneration of A.thaliana

  

基因IDGeneID差异倍数log2FC(S3/C4)P值P-value错误发现率FDR功能注释Descriptions表达量增加的基因UP-regulatedgenesAT5G5762513.561877.84E-1163.62E-114CAP超家族蛋白CAPsuperfamilyproteinAT3G4568013.3502000未知蛋白UnknownproteinAT1G5497012.790292.00E-1371.20E-135富含脯氨酸蛋白PRP1Proline-richprotein1AT4G0841012.592971.85E-1421.20E-140富含脯氨酸的伸展蛋白类似物家族蛋白Proline-richextensin-likefamilyproteinAT3G1927012.496034.11E-2206.57E-218脱落酸羟化酶Abscisicacid8'-hydroxylase4AT5G4218012.139103.45E-2568.21E-254过氧化物酶64Peroxidase64AT1G6254012.117134.16E-1091.75E-107含有黄素的单氧酶FMOGS-OX2Flavin-containingmonooxygenaseGS-OX2AT5G0663011.927273.26E-941.07E-92富含脯氨酸的伸展蛋白类似物家族蛋白Proline-richextensin-likefamilyproteinAT4G1339011.906707.43E-1364.42E-134富含脯氨酸的伸展蛋白类似物家族蛋白Proline-richextensin-likefamilyproteinAT1G2966011.739988.44E-1616.95E-159GDSL脂肪酶GDSLlipaseAT3G6028011.670823.76E-1011.37E-99蛋白质UCC3ProteinUCC3AT3G6268011.647081.50E-1247.83E-123富含脯氨酸蛋白PRP3Proline-richprotein3AT3G0119011.611297.95E-1586.30E-156过氧化物酶27Peroxidase27

 

续表3　Table 3 continued

  

基因IDGeneID差异倍数log2FC(S3/C4)P值P-value错误发现率FDR功能注释DescriptionsAT2G3610011.6068200凯氏带膜蛋白1Casparianstripmembraneprotein1AT5G0664011.578061.23E-1135.52E-112富含脯氨酸的伸展蛋白类似物家族蛋白Proline-richextensin-likefamilyproteinAT3G5523011.457041.78E-3137.80E-311抗病响应家族蛋白Diseaseresistance-responsivefamilyproteinAT2G1600511.441892.44E-745.65E-73含有MD-2相关脂质识别域蛋白MD-2-relatedlipidrecognitiondomain-containingproteinAT4G2266611.377193.03E-1201.49E-118脂质转移蛋白Lipid-transferproteinAT2G2052011.347541.20E-572.02E-56类似成束蛋白的阿拉伯半乳聚糖蛋白6Fasciclin-likearabinogalactanpro-tein6AT5G0496011.276252.73E-1471.87E-145果胶酯酶抑制物46Pectinesteraseinhibitor46AT2G2498011.273308.62E-1224.32E-120富含脯氨酸的伸展蛋白类似物家族蛋白Proline-richextensin-likefamilyproteinAT1G1422011.252011.94E-1189.28E-117核糖核酸酶T2家族蛋白RibonucleaseT2familyproteinAT1G2774011.246737.54E-1726.97E-170转录因子bHLH54TranscriptionfactorbHLH54AT1G3087011.205711.65E-2724.59E-270过氧化物酶7Peroxidase7AT2G3491011.157992.19E-1511.60E-149未知蛋白UnknownproteinAT1G4760011.038637.12E-3153.28E-312芥子酶4Myrosinase4AT3G5458011.014354.36E-2318.02E-229富含脯氨酸的伸展蛋白类似物家族蛋白Proline-richextensin-likefamilyproteinAT3G5459010.996141.79E-1651.59E-163富含羟脯氨酸糖蛋白Hydroxyproline-richglycoproteinAT5G1433010.762641.65E-1381.02E-136未知蛋白UnknownproteinAT1G1371010.561703.02E-635.70E-62细胞色素P45078A5CytochromeP45078A5AT5G6135010.559365.34E-821.43E-80受体类似物蛋白激酶Receptor-likeproteinkinaseAT5G1434010.553264.60E-811.21E-79转录因子MYB40TranscriptionfactorMYB40AT2G4518010.526651.76E-663.52E-65脂质转移蛋白Lipid-transferproteinAT5G3519010.516678.25E-1012.99E-99富含脯氨酸的伸展蛋白类似物家族蛋白Proline-richextensin-likefamilyproteinAT5G2241010.445954.47E-1302.51E-128过氧化物酶60Peroxidase60AT4G1568010.441704.56E-951.51E-93单巯基谷氧还蛋白S4Monothiolglutaredoxin-S4AT5G0396010.407199.01E-912.79E-89IQ结构域12IQ-domain12AT2G3449010.380472.46E-1862.74E-184细胞色素450710A2CytochromeP450710A2AT1G6298010.372332.19E-1561.69E-154扩张蛋白A18Expansin-A18AT3G0592010.361897.02E-992.47E-97重金属运输蛋白HeavymetaltransportproteinAT4G1121010.2883100抗病响应家族蛋白Diseaseresistance-responsivefamilyproteinAT3G0646010.261963.97E-961.34E-94GNS1/SUR4膜蛋白家族GNS1/SUR4membraneproteinfamilyAT3G0577010.2475900未知蛋白UnknownproteinAT2G2114010.228641.75E-1188.42E-117富含脯氨酸蛋白2(PRP2)Proline-richprotein2AT1G2372010.2256800富含脯氨酸的伸展蛋白类似物家族蛋白Proline-richextensin-likefamilyproteinAT2G4411010.216316.29E-711.37E-69MLO类似蛋白15MLO-likeprotein15AT3G1820010.207224.16E-951.38E-93EamA转运类似物家族蛋白EamA-liketransporterfamilyproteinAT3G2855010.1435100富含脯氨酸的伸展蛋白类似物家族蛋白Proline-richextensin-likefamilyproteinAT2G0510010.112774.84E-711.06E-69光合系统Ⅱ集光复合体PhotosystemⅡlightharvestingcomplexAT2G2075010.090032.34E-1391.47E-137扩张蛋白B1Expansin-B1表达量减少的基因Down-regulatedgenesAT2G41850-13.3412000聚半乳糖醛酸酶ADPG2PolygalacturonaseADPG2AT5G22430-8.722501.16E-311.02E-30伸展蛋白家族蛋白ExtensinfamilyproteinAT2G15590-8.675761.29E-401.49E-39未知功能蛋白ProteinofunknownfunctionAT1G18100-8.299305.41E-589.22E-57PEBP家族蛋白PEBPfamilyproteinAT2G03740-8.000381.12E-227.10E-22含有LEA结构域蛋白LEAdomain-containingproteinAT4G12500-7.957781.74E-085.24E-08pEARLI1相似脂质转运蛋白3pEARLI1-likelipidtransferprotein3AT4G30140-7.865813.42E-2517.87E-249GDSL脂肪酶GDSLlipaseAT5G58390-7.762652.88E-1171.36E-115过氧化物酶67Peroxidase67AT1G76610-7.747304.32E-192.35E-18未知功能蛋白ProteinofunknownfunctionAT1G03790-7.351611.96E-281.53E-27转录因子C3H家族蛋白C3HfamilyproteinAT2G18130-7.324101.24E-114.58E-11酸性磷酸酶11(PAP11)Purpleacidphosphatase11AT1G67770-7.191101.40E-1469.50E-145末端EAR1类似物2TerminalEAR1-like2AT5G10500-7.119561.53E-136.30E-13未知蛋白UnknownproteinAT3G48300-7.113787.79E-122.90E-11细胞色素P45071A23CytochromeP45071A23

 

续表3　Table 3 continued

  

基因IDGeneID差异倍数log2FC(S3/C4)P值P-value错误发现率FDR功能注释DescriptionsAT1G21970-7.031635.41E-142.28E-13转录因子NF-YB家族蛋白NF-YBfamilyproteinAT4G12480-6.962851.32E-217.99E-21脂质转运蛋白EARLI1LipidtransferproteinEARLI1AT1G25310-6.942291.17E-114.33E-11转录因子MEE8TranscriptionfactorMEE8AT1G04150-6.918413.29E-941.08E-92磷酸核糖基转移酶家族蛋白PhosphoribosyltransferasefamilyproteinAT2G46990-6.639951.50E-2072.03E-205生长素响应蛋白IAA20Auxin-responsiveproteinIAA20AT1G62421-6.629931.52E-105.26E-10未知蛋白UnknownproteinAT3G02670-6.623976.72E-397.37E-38富含甘氨酸蛋白Glycine-richproteinAT2G45410-6.604741.54E-1431.01E-141转录因子LBD19TranscriptionfactorLBD19AT1G21990-6.588184.51E-841.26E-82F-box蛋白F-boxproteinAT1G56360-6.564521.48E-291.20E-28酸性磷酸酶6(PAP6)Purpleacidphosphatase6AT1G68320-6.553622.47E-1141.12E-112转录因子MYB62TranscriptionfactorMYB62AT2G41225-6.552371.02E-093.35E-09未知蛋白UnknownproteinAT1G29600-6.545063.84E-181.99E-17转录因子C3H家族蛋白C3HfamilyproteinAT4G18190-6.508337.18E-102.38E-09嘌呤透性酶6Purinepermease6AT3G03670-6.466892.92E-099.32E-09过氧化物酶28Peroxidase28AT4G37850-6.449271.96E-573.29E-56转录因子bHLH25TranscriptionfactorbHLH25AT2G03850-6.320601.95E-2313.61E-229晚期胚胎富集蛋白LEAfamilyproteinAT5G47440-6.264575.60E-2451.22E-242未知功能植物蛋白PlantproteinofunknownfunctionAT5G18560-6.2616600转录因子PUCHITranscriptionfactorPUCHIAT4G03950-6.210388.56E-050.0001953磷酸盐转运物类似蛋白1Phosphate-translocator-likeprotein1AT1G48325-6.197166.03E-223.71E-21未知蛋白UnknownproteinAT4G09940-6.171982.11E-2655.57E-263含有P环的核苷三磷酸水解酶超家族蛋白P-loopcontainingnucleosidetriphosphatehydrolasessuperfamilyproteinAT5G13670-6.079335.66E-061.43E-05WAT1相关蛋白WAT1-relatedproteinAT3G27590-6.069532.34E-076.53E-07未知蛋白UnknownproteinAT3G15534-6.016101.40E-063.71E-06未知蛋白UnknownproteinAT3G60650-6.006111.12E-2081.56E-206未知蛋白UnknownproteinAT5G56960-5.944238.95E-732.02E-71转录因子bHLH041TranscriptionfactorbHLH041AT5G42223-5.906751.04E-195.83E-19防御素类似蛋白114Defensin-likeprotein114AT1G44542-5.902202.22E-462.95E-45环化酶家族蛋白CyclasefamilyproteinAT2G42430-5.901552.27E-3161.06E-313转录因子LBD16TranscriptionfactorLBD16AT1G61750-5.891572.42E-066.29E-06分泌蛋白SecretoryproteinAT2G14960-5.8766900生长素响应家族蛋白GH3.1Auxin-responsiveGH3familyproteinGH3.1AT4G12490-5.874921.09E-144.79E-14pEARLI1相似脂质转运蛋白2pEARLI1-likelipidtransferprotein2AT3G62610-5.850463.27E-1843.55E-182转录因子MYB11TranscriptionfactorMYB11AT5G02900-5.846077.03E-315.98E-30细胞色素P45096A13CytochromeP45096A13AT4G08300-5.832713.63E-101.23E-09WAT1相关蛋白WAT1-relatedprotein

此外,转录因子RSL4(AT1G27740)和MYB40(AT5G14340)的基因表达量增加,编码转录因子TZF4(AT1G03790),NF-YB家族蛋白(AT1G21970),bHLH家族蛋白(AT1G25310、AT4G37850、AT5G56960),LBD19(AT2G45410),MYB62(AT1G68320),C3H家族蛋白(AT1G29600)的基因表达量降低。

在不定芽再生阶段,比较S3与C4表达量所得2 910个差异基因中有2 804条转录物具有具体功能定义,共得到403个功能注释,分别包含234个生物学过程亚类、42个细胞组分亚类,127个分子功能亚类。图3为不定芽再生阶段前20个显著富集(P<0.05)的功能条目。其中激素刺激响应、生长素刺激响应、乙烯刺激响应、生长素内稳态和转录因子活性等是显著下调的富集功能条目。

  

图3　拟南芥不定芽再生阶段培养前20个显著富集的转录物GO功能条目Fig.3　TOP 20 highly enriched GO terms during shoot regeneration of A.thaliana　　A.显著上调的富集转录物功能条目。The upregulated gene subsets with annotated GO terms. 1.氧化还原 Oxidation reduction;2.次级代谢 Secondary metabolic process;3.过氧化氢分解Hydrogen peroxide catabolic process;4.过氧化氢细胞响应 Cellular response to hydrogen peroxide;5.光合作用 Photosynthesis;6.过氧化氢代谢过程 Hydrogen peroxide metabolic process;7.糖苷代谢过程Glycoside metabolic process;8.四吡咯结合 Tetrapyrrole binding;9.电子载体结合 Electron carrier activity;10.亚铁血红素结合 Heme binding;11.过氧化物酶活性Peroxidase activity;12.氧化还原酶活性 Oxidoreductase activity;13.抗氧化活性 Antioxidant activity;14.铁离子结合 Iron ion binding;15.胞外区 Extracellular region;16.内膜系统 Endomembrane system;17.质外体 apoplast;18.叶绿体类囊体膜 Chloroplast thylakoid membrane;19.质体类囊体膜 Plastid thylakoid membrane;20.类囊体膜 Thylakoid membrane.B.显著下调的富集转录物功能条目。The downregulated gene subsets with annotated GO terms. 21.有机物质响应 Response to organic substance;22.激素刺激响应 Response to hormone stimulus;23.转录调节 Regulation of transcription;24.内源刺激响应 Response to endogenous stimulus;25.转录 Rranscription;26.生长素刺激响应 Response to auxin stimulus;27.乙烯刺激响应 Response to ethylene stimulus;28.依赖DNA的转录调节 Regulation of transcription, DNA-dependent;29.生长素内稳态 Auxin homeostasis;30.RNA代谢调节 Regulation of RNA metabolic process;31.脂质定位 Lipid localization;32.生长素调节信号 Hrmone-mediated signaling;33.激素刺激的细胞响应 Cellular response to hormone stimulus;34.脂质运输 Lipid transport;35.生长素信号调节通路 Auxin mediated signaling pathway;36.转录因子活性 Transcription factor activity;37.转录调节子活性 Transcription regulator activity;38.DNA结合 DNA binding;39.脂质结合 Lipid binding;40.胞外区 Extracellular region.

2.4　生长素和细胞分裂素相关基因的表达量分析

通过对比生长素、细胞分裂素相关基因在2个阶段的表达量变化(图4)。可知在愈伤组织形成阶段4个生长素合成相关家族基因YUC(YUCCA)表达量显著降低,其中YUC5下调最明显,但在不定芽再生阶段它们的变化并不明显;5个生长素相关家族基因GH3(GH3.2、GH3.3、GH3.5、GH3.6和GH3.12)表达量增加,其中GH3.3增加了约250倍,GH3.12增加了288倍,但在不定芽再生阶段它们的表达量减少;7个生长素响应基因表达量在愈伤组织形成阶段增加,其中IAA19增加了21倍,IAA20增加了25倍,IAA30增加了64倍。另外,SAUR(SMALL AUXIN-UP RNAs)基因的表达量在愈伤组织形成阶段都明显减少,但在不定芽再生阶段表达量都明显增加。

  

图4　拟南芥愈伤组织形成阶段及不定芽再生阶段与生长素(A)和细胞分裂素(B)相关基因的表达量Fig.4　Transcript levels of genes related to auxin(A)and cytokinin(B)during callus formation and shoot regeneration of A.thaliana

异戊烯基转移酶(isopentenyltransferase,IPT)是细胞分裂素合成的关键酶,在愈伤组织形成阶段IPT基因的表达量发生明显下降。另一个细胞分裂素合成的重要酶类细胞色素单氧酶P450(CYP735A1和CYP735A2)以及催化细胞分裂素从无活性向活性形式转化的LOG家族基因均出现了一定程度的下调。与此同时CKX2、CKX3、CKX5和CKX6等4个细胞分裂素氧化酶基因的表达量在愈伤组织形成阶段都出现了一定程度的上调,其中CKX2、CKX3上调倍数最多:CKX2上调了约278倍,CKX3上调约40倍。当外植体移至SIM培养基后IPT1、IPT3、CYP735A1、CYP735A2、LOG1、LOG2的表达量出现明显增加,特别是CYP735A1和CYP735A2,分别上调了879和440倍。另外,CKX2、CKX3和CKX6表达量减少。A型ARR基因能被细胞分裂素快速诱导,从图4也可以看出A型ARR基因表达量在不定芽再生阶段均有所增加,且ARR15和ARR16最为显著。

2.5　拟南芥芽顶端分生组织相关基因的表达

芽顶端分生组织(shoot apical meristem,SAM)在植物的生长发育过程中具有重要的功能。在离体芽的再生过程中一些与SAM相关基因的表达也发生了改变(表4)。其中:WUS(AT2G17950)的表达在不定芽再生阶段最为明显,在愈伤组织形成阶段未检测到其表达。其次是RAP2.6,它在不定芽再生阶段显著表达,同时在愈伤组织形成过程中表达量显著降低。另外,CUC1、CUC2和CUC3在不定芽再生阶段均有表达,但CUC2在2个阶段均出现表达上调,且在愈伤组织形成阶段表达显著。ESR1(ENHANCER OF SHOOT REGENERATION 1)和PUCHI在愈伤组织形成阶段均显著表达。

 

表4　拟南芥芽顶端分生组织相关基因的表达Table 4　The expression levels of shoot apical meristem related genes of A.thaliana

  

基因名称Geneshortname基因IDGeneID愈伤组织形成阶段Callusformation差异倍数log2FC(C4/C0)错误出现率FDR不定芽再生阶段Shootregeneration差异倍数log2FC(S3/C4)错误出现率FDRWUSAT2G17950——7.1886931.84E-13CUC1AT3G15170——2.6877774.84E-22CUC2AT5G539506.0033341.75E-1281.1198774.46E-27CUC3AT1G76420——1.2317150.07495461ESR1AT1G129805.0198770.0005423411.9566360.0000308RAP2.6AT1G43160-7.5082082.79E-675.1873987.63E-31RAP2.6LAT5G133302.0281719.51E-1052.0456833.66E-159BBMAT5G174303.8069106.08E-251-3.6878393.87E-238PUCHIAT5G185605.3725010-6.2616600CLE2AT4G18510-2.2712011.19E-692.4280831.83E-78AGL24AT4G24540——5.2383522.49E-11CLE41AT3G24770——2.3063913.42E-64WOX4AT1G46480——2.4315377.21E-96NAC2AT3G155102.8087938.01E-101-3.9507054.85E-146WOX5AT3G112605.9760160-4.6303326.53E-253AGL20AT2G45660-7.2866073.48E-27——

注:“—”未测出。“—”indicates no detection.

3　讨论

[17]　　　Cary A J,Che P,Howell S H. Development events and shoot meristem gene expression patterns during shoot development in Arabidopsis thaliana[J]. The Plant Journal,2002,32(6):867-877.

在愈伤组织形成阶段细胞分裂素分解代谢途径显著富集,CKX家族部分基因显著表达。与此同时,我们发现细胞分裂素合成相关家族基因IPT,CYP735A1、CYP735A2以及LOG家族基因均出现了一定程度的表达下调。Takei等[21]通过RT-PCR发现用生长素处理拟南芥1 h CYP735A的表达量即明显下调。Werner等[22]发现生长素不仅影响细胞分裂素的生物合成,而且还通过调节CKX家族基因来影响细胞分裂素的降解。因此,我们认为这一现象与CIM中高浓度的生长素有关。在愈伤组织形成阶段,Che等[12]发现生长素响应基因AUX/IAA表达量增加,我们对AUX/IAA家族基因进行了全面分析也发现多个IAA家族基因表达量增加。我们还发现与生长素合成相关的YUC家族基因表达量出现了一定程度的下调,同时GH3家族部分基因表达量出现了显著增加。GH3家族基因编码吲哚乙酸氨基酸合成酶催化IAA与氨基酸的结合,从而改变IAA的活性[23]。这些基因表达量的改变可能也与CIM培养基中高浓度生长素有关。这些变化可能是CIM培养基上高浓度生长素负反馈调节的结果,从而维持愈伤组织形成阶段细胞分裂素和生长素的动态平衡。

Che等[11]研究发现,ARR15、ARR16在不定芽再生途径中表达量增加。我们在不定芽再生阶段也检测到它们表达量增加。王兴春等[20]检测到在不定芽再生阶段IPT5的表达量下降,但并未发现其他IPT基因的变化。我们除检测到IPT5、IPT7的表达量减少,还发现与细胞分裂素合成及活性有关的CYP735A1、CYP735A2和LOG家族基因在该阶段出现了明显的表达量增加,与细胞分裂素代谢相关的CKX家族部分基因表达量减少。虽然有研究表明细胞分裂素在4 h内即可抑制IPT1、IPT3、IPT5和IPT7基因的表达[24],但随着在SIM上培养时间的增加,外源细胞分裂素的含量可能逐渐减少。为了维持促进不定芽形成的细胞分裂素水平,其他一些与细胞分裂素合成相关的基因表达量开始增加。

SAM的发育与不定芽的再生关系密切,我们发现有多个基因在愈伤组织形成阶段表达量增加,可见在第4天虽然外植体还只是处于愈伤组织阶段,但与芽顶端分生组织相关的多个基因已经开始表达,外植体已经获得形成芽的能力。CUC2作为根外植体获得芽再生形成能力的标志基因[14],在愈伤组织形成阶段表达量显著上调。在不定芽再生阶段有10个与SAM相关的基因表达上调,4个基因表达下调。其中WUS、RAP2.6、AGL24上调幅度较大,可以看出WUS在芽分生组织形成的基因调控过程中具有重要地位[25]。

此外,我们还利用Gene Ontology(GO)功能注释分类体系分别对2个阶段差异基因进行功能注释和分析。在GO功能分类体系中,我们发现愈伤组织形成阶段差异表达的4 332个基因中有4 137条转录物具有具体功能定义。它们分别富集在3个功能范畴,这3个功能可被划分为更详细的446个类别,其中生物学过程有282个功能亚类,细胞组分有29个功能亚类,分子功能有135个。图2为愈伤组织形成阶段前20个显著富集的差异基因功能条目,从图2可以看出:核转录因子活性、激素刺激响应、生长素刺激响应、生长素信号调节通路、激素水平调节等是显著富集的功能条目。

Wang X C,Yang Z R,Zhang S W,et al. Digital gene expression profiling analysis of the early adventitious shoot formation in Arabidopsis thaliana[J]. Chinese Journal of Biotechnology,2013,29(2):189-202(in Chinese with English abstract).

除了与不定芽再生有关的转录因子编码基因ESR1、PUCHI、RAP2.6、LBD16外,我们还发现多个转录因子基因表达量发生改变,它们属于不同转录因子家族,如Nin-like家族、LBD家族、bHLH家族、MYB家族和C3H家族等。拟南芥编码1 500个转录因子[15]且芽的再生是一个非常复杂的过程。因此,在愈伤组织形成阶段和不定芽再生阶段必然还蕴含大量的转录因子调度调节以及各生理信号的交互作用有待我们进一步去发掘,以期解释其内部的分子生物学机制。

参考文献References:

拟南芥参考基因序列来自Illumina iGenomes网站(http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.html;Arabidopsis_thaliana_Ensembl_TAIR10.tar.gz),使用TopHat 2.0.6(http://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml)将得到的有效读段(clean reads)分别比对到拟南芥参考基因序列(TAIR10)。利用Bowtie 2(http://bowtie bio.sourceforge.net/index.shtml)将所得的clean reads对应到拼接好的转录物上,比较不同样品间基因的表达差异,使用FPKM法来计算基因表达量。通过比较不同时间点的转录水平(FPKM)来计算差异倍数(fold change,FC)。将错误发现率(false discovery rate,FDR)≤0.05,且差异倍数不低于2倍(即的绝对值≥1)的基因确定为差异表达基因,并比较了与细胞分裂素、生长素以及芽顶端分生组织相关基因的差异表达情况。通过DAVID(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)工具对转录物序列进行GO(Gene Ontology)功能注释和GO功能分类统计。在GO功能注释及分类统计时,将P≤0.05的GO定义为显著富集。

式中:Mi=(αi1,αi2,αi3,…,αi25),Mi+1=(αi+11,αi+12,αi+13,…,αi+125)。

[1]　Deklerk G J,Amholdt-Schmitt B,Lieberei R,et al. Regeneration of roots,shoots and embryos:physiological,biochemical and molecular aspects[J]. Biologia Plantarum,1997,39(1):53-66.

[19]　　　Naseer S,Lee Y,Lapierre C,et al. Casparian strip diffusion barrier in Arabidopsis is made of a lignin polymer without suberin[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2012,109(25):10101-10106.

[3]　　　Dhaliwal H S,Ramesar-Fortner N S,Yeung E C,et al. Competence,determination,and meristemoid plasticity in tobacco organogenesis in vitro[J]. Canadian Journal of Botany,2003,81(6):611-621.

[4]　　　Feldmann K A,Marks M D. Rapid and efficient regeneration of plants from explants of Arabidopsis thaliana[J]. Plant Science,1986,47(1):63-69.

根据3.1所描述的定位方法,利用时延估计算法得到4个麦克风之间的延时后经计算即可得到音源位置的估计值,表1给出了s1、s2、s3、s4、s5 5个音源位置的测试结果,各音源空间位置由表中的实际位置和实际方位角给出,表中的实测位置和实测方位角为本文算法的估计结果,位置信息(x,y,z)和方位角的定义见3.1节。由表1可知,本文设计算法能提供良好的音源定位效果,对于方位的估计误差在100 mm范围内,方位角的估计误差在±5度范围。

[5]　　　Sangwan R S,Bourgeois Y,Brown S,et al. Characterization of competent cells and early events of Agrobacterium-mediated genetic transformation in Arabidopsis thaliana[J]. Planta,1992,188(3):439-456.

[6]　　　Valvekens D,Montagu M V,Lijsebettens M V,et al. Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of Arabidopsis thaliana root explants using kanamycin selection[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1988,85(15):5536-5540.

[7]　　　Sangwan R S,Sangwan-Norreel B S,Harada H,et al. In vitro techniques and plant morphogenesis:fundamental aspects and practical applications[J]. Plant Biotechnology,1997,14(2):93-100.

[8]　　　Catterou M,Dubois F,Smets R,et al. hoc:an Arabidopsis mutant overproducing cytokinins and expressing high in vitro organogenic capacity[J]. The Plant Journal,2002,30(3):273-287.

[9]　　　Ren B,Liang Y,Deng Y,et al. Genome-wide comparative analysis of type-A Arabidopsis response regulator genes by overexpression studies reveals their diverse roles and regulatory mechanisms in cytokinin signaling[J]. Cell Research,2009,19(10):1178-1190.

语文教师信息化能力是语文信息化教学能否顺利推进的关键。信息化教学能力概念的2002年被祝智庭、胡小勇首次提出[1]，十六年后的今天，“互联网+”的概念已经深入到社会的各个角落，数字化校园，信息化教学的概念深入到教学的每一个所在。学生创新精神、时代意识的培养与教师信息化能力水平的高低密不可分。

[10]　　　Gordon S P,Heisler M G,Reddy G V,et al. Pattern formation during de novo assembly of the Arabidopsis shoot meristem[J]. Development,2007,134(19):3539-3548.

[11]　　　Che P,Lall S,Nettleton D,et al. Gene expression programs during shoot,root,and callus development in Arabidopsis tissue culture[J]. Plant Physiology,2006,141(2):620-637.

[12]　　　Che P,Gingerich D J,Lall S,et al. Global and hormone-induced gene expression changes during shoot development in Arabidopsis[J]. Plant Cell,2002,14(11):2771-2785.

[13]　　　Su Y H,Chen Z J,Su Y X,et al. Pattern analysis of stem cell differentiation during in vitro Arabidopsis organogenesis[J]. Frontiers of Biology,2010,5(5):464-470.

[14]　　　Motte H,Verstraeten I,Werbrouck S,et al. CUC2 as an early marker for regeneration competence in Arabidopsis root explants[J]. Journal of Plant Physiology,2011,168(13):1598-1601.

All chromatographic separations were conducted on an Agilent 1100 series HPLC instrument (Palo Alto, CA, USA) equipped with a photodiode array detector (PDA), and the data were recorded and analyzed by Hewlett Packard ChemStation software (Palo Alto, CA, USA).

[15]　　　Riechmann J L,Heard J,Martin G,et al. Arabidopsis transcription factors:genome-wide comparative analysis among eukaryotes[J]. Science,2000,290(5499):2105-2110.

[16]　　　Xu K,Liu J,Fan M,et al. A genome-wide transcriptome profiling reveals the early molecular events during callus initiation in Arabidopsis multiple organs[J]. Genomics,2012,100(2):116-124.

愈伤组织形成和不定芽再生阶段是不定芽形成的2个关键阶段,许多基因的表达情况在这2个阶段发生显著改变并决定了细胞去分化和再分化的命运,因此我们对这2个阶段基因的差异表达情况进行了分析。王兴春等[20]曾利用RNA-Seq技术研究了以下胚轴为外植体的不定芽再生早期的基因表达情况,选用的是CIM培养7 d和SIM培养2 d的材料。CIM培养4 d时外植体即可见愈伤组织的膨大,我们利用CIM培养4 d和SIM培养3 d的根外植体材料可以更好地研究愈伤组织形成和不定芽再生阶段的基因表达情况。Che等[11]利用22 810个基因探针对拟南芥根外植体不同再生途径中的基因进行分析,检测到不定芽形成途径中478个上调表达基因和397个下调表达基因。Xu等[16]利用22 746个基因探针对地上部外植体和根外植体在愈伤组织形成阶段的基因表达情况进行了分析,检测到1 342个差异表达基因。由于基因芯片的局限性,检测到的基因数目有限。我们利用RNA-Seq技术检测到愈伤组织形成阶段的 4 332个差异表达基因与不定芽再生阶段的2 910个差异表达基因,为研究不定芽再生过程的基因表达情况提供更有效的数据依据。我们还利用GO功能注释分类体系分别对2个阶段差异表达基因进行功能分析,发现生长素和细胞分裂素的合成、代谢相关途径的差异表达基因最为丰富。

[18]　　　Schuster J,Knill T,Reichelt M,et al. BRANCHED-CHAIN AMINOTRANSFERASE4 is part of the chain elongation pathway in the biosynthesis of methionine-derived glucosinolates in Arabidopsis[J]. The Plant Cell,2006,18(10):2664-2679.

[2]　　　Sangwan R S,Harada H. Chemical regulation of callus growth,organogenesis,plant regeneration,and somatic embryogenesis in Antirrhinum majus tissue and cell cultures[J]. Journal of Experimental Botany,1975,26(6):868-881.

[20]　　　王兴春,杨致荣,张树伟,等. 拟南芥不定芽发生早期的数字基因表达谱分析[J]. 生物工程学报,2013,29(2):189-202.

转录因子AP2/EREBP家族基因参与多个生长发育过程,该家族有144个成员[26],研究表明多个AP2家族成员参与了不定芽再生过程,如ESR1[27]。Banno等[27]认为在外植体获得器官形成能力后ESR1可以促进芽的形成,我们在愈伤组织形成和不定芽再生阶段均检测到ESR1的表达,且ESR1的表达在愈伤组织形成阶段更显著。Che等[11]研究发现转录因子RAP2.6L在不定芽形成过程出现了上调。我们也检测到RAP2.6L的上调表达,但不同的是我们在愈伤组织形成阶段和不定芽再生早期阶段均检测到RAP2.6L上调表达。同时,还发现另一个AP2转录因子家族成员RAP2.6在愈伤组织形成阶段表达量显著减少,而在不定芽再生阶段表达量显著增加。我们推测可能RAP2.6更特异性地参与芽再生的调控过程。在不定芽再生阶段另一个AP2转录因子PUCHI及其共同作用元件LBD16表达量明显减少。PUCHI会限制早期侧根原基的细胞增殖,并与LBD16、LBD18共同作用来调控侧根原基的发育及侧根的形成[28]。Yadav等[29]认为器官形成早期的主要调控过程和愈伤组织形成过程是一个和侧根形成类似的过程。因此PUCHI的表达量减少可能解除了对侧根原基增殖的限制,从一方面促进了不定芽的再生。

[21]　　　Takei K,Yamaya T,Sakakibara H. Arabidopsis CYP735A1 and CYP735A2 encode cytokinin hydroxylases that catalyze the biosynthesis of trans-zeatin[J]. Journal of Biological Chemistry,2004,279(40):41866-41872.

通过以上梳理看到，近20年来我国学界对清代碑帖学的研究取得了长足进展，成果喜人。但是透过可喜的成绩，依然可见其中的不足。

[22]　　　Werner T,Köllmer I,Bartrina I,et al. New insights into the biology of cytokinin degradation[J]. Plant Biology,2006,8:371-381.

[23]　　　Hagen G,Kleinschmidt A,Guilfoyle T. Auxin-regulated gene expression in intact soybean hypocotyl and excised hypocotyl sections[J]. Planta,1984,162(2):147-153.

Stein等人指出教学任务要能充分发挥其教育价值，还需要教师使用恰当的教学策略．他们提出若干保持和降低教学任务高认知要求的教学策略[55]，这些策略对于创造型教学任务的实施同样具有指导意义．

[24]　　　Miyawaki K,Matsumoto-Kitano M,Kakimoto T. Expression of cytokinin biosynthetic isopentenyltransferase genes in Arabidopsis:tissue specificity and regulation by auxin,cytokinin,and nitrate[J]. The Plant Journal,2004,37(1):128-138.

[25]　　　Traas J,Monéger F. Systems biology of organ initiation at the shoot apex[J]. Plant Physiology,2010,152(2):420-427.

[26]　　　Riechmann J L,Meyerowitz E M. The AP2/EREBP family of plant transcription factors[J]. Biological Chemistry,1998,379(6):633-646.

经过对施工图审核管理工作现状进行梳理，可以看出，咨询单位所做的最为基础的工作是：接收同行完成的设计图文（以纸质版为主，也接收电子图文），向对方分批次地反馈审核意见，设计方对审核意见应予以回复。对于未达成一致的意见，双方可能会往返回复多次，确实无法达成一致，则可申请仲裁。所有往来的审核意见、回复意见均是电子版。

[27]　　　Banno,H,Ikeda Y,Niu Q W,et al. Overexpression of Arabidopsis ESR1 induces initiation of shoot regeneration[J]. The Plant Cell,2001,13(12):2609-2618.

该项目充分体现了多方协同，贯穿项目生命周期的一体化规划、设计、施工和运维的BIM应用理念，其交付过程广泛使用了各领域内最新的BIM解决方案。项目组在项目初期即制定了详细的BIM执行计划，明确了项目组成员的各自建模与模型管理任务以及成员间的数据/信息交换标准和协议，清晰地建立了协同合作的技术与交流平台，并有效地结合了其他建筑行业内的高新技术创新，包括装配式建筑、施工机器人、移动计算、云计算以及虚拟现实等（见图3）。

[28]　　　Kang N Y,Lee H W,Kim J. The AP2/EREBP gene PUCHI co-acts with LBD16/ASL18 and LBD18/ASL20 downstream of ARF7 and ARF19 to regulate lateral root development in Arabidopsis[J]. Plant and Cell Physiology,2013,54(8):1326-1334.

企业并购分为兼并、收购和合并三种，企业并购是指两个或者两个以上的企业为了提高自身竞争力，双方自愿平等的发生交易，一方企业付出一定的经济代价从而取得另一方的股权和资产，从而对其进行控制和管理的行为。

[29]　　　Yadav S R,Bishopp A,Helariutta Y,et al. Plant development:early events in lateral root initiation[J]. Current Biology,2010,20(19):R843-R845.