球虫病是鸡的重要疾病之一,对鸡球虫病的防控措施主要从饲养环境管理、疫苗免疫、药物预防或治疗等几个方面来进行。所用药物主要有聚醚类离子载体抗生素、人工合成抗球虫药、中草药等[1-4]。

氢溴酸常山酮(halofuginone hydrobromide)属于人工合成的一种广谱抗球虫药,是从植物中纯化出来的喹唑啉酮类生物碱——常山(dichroa fabrifuga)的卤代衍生物。常山酮分为两种,分别是氢溴酸盐和乳酸盐。氢溴酸常山酮按推荐剂量3 mg·kg-1添加在饲料中,用于预防和治疗鸡球虫病,主要机制是对球虫子孢子、第一代及第二代裂殖体具有明显的抑杀作用,防止破坏鸡肠上皮细胞,具有预防球虫病及提高饲料利用率作用。由于氢溴酸常山酮安全范围比较窄,饲料添加的有效浓度为3 mg·kg-1,而高于4.5 mg·kg-1则抑制生长,高于6 mg·kg-1则显著降低饲料转化率,如果拌料不均匀,不但疗效不佳,还导致鸡只出现中毒症状。因此必须加强对饲料中氢溴酸常山酮药物浓度的检测。目前,国内外报道的氢溴酸常山酮的检测方法有气-液相色谱法[5]、毛细血管电泳法(CE)[6]、高效液相色谱法(HPLC)[7-9]、放射性同位素标记法[10]和高效液相色谱-质谱联用检测法(HPLC-MS)[11]。我国尚未报道鸡饲料中氢溴酸常山酮的检测方法,因此,有必要建立一种高效、准确、简单的检测方法,以便监测饲料中药物的浓度。

1　材料与方法

1.1　试验材料

1.1.1　试验药品与试剂　氢溴酸常山酮标准品(质量分数99.28%),购于南京天海医药科技有限公司;冰乙酸、乙酸铵、乙酸乙酯等均为分析纯;乙腈、甲醇为色谱纯。

1.1.2　试验仪器与设备　Ultimate 3000高效液相色谱仪系统(Thermo公司);3K-15低温高速离心机(美国Sigma公司);FE-20K pH计(梅特勒-托利多仪器有限公司);DC-12 H型氮吹仪(上海安普科学仪器有限公司);Oasis® HLB 3CC(60 mg)固相萃取柱(Waters公司)。

1.2.4 饮食护理：手术清醒之后，给患者进食少量水，确认无腹胀情况可多次少量进水；确认胃肠道蠕动恢复后，给予流质饮食，遵循少量多餐的原则，避免增加肠道负担。排气之后，多食用高营养、高热量的食物；排便之后，恢复正常饮食，并多食用含有高维生素、高热量、高蛋白、高纤维的食物，防止患者出现便秘。

1.2　主要溶液的配制

1.2.1　乙酸铵缓冲液的配制　称取19.27 g乙酸铵于1 000 mL容量瓶中,用冰乙酸溶液调为pH4.3,并用纯净水定容用作流动相。取0.25 mol·L-1乙酸铵溶液稀释至0.125 mol·L-1,作为萃取液用。

大信号掩盖技术是一种利用强功率、显著参数特征掩盖信道中的有用信号，增加非合作方截获有用信号的难度，保障信号抗截获性的技术.但大信号消耗功率仅用来提升有用信号的抗截获性，导致功率浪费.本文提出基于数据分级的大信号掩盖技术，该技术可充分利用发射端功率.基于数据分级的大信号掩盖原理如图1所示.

本试验采用标准添加法考察方法的灵敏度。以信噪比(S/N)不小于3和不小于10为参考,确定方法的检测限(LOD),结合回收率及精密度测定结果,确定方法定量限(LOQ)。测得氢溴酸常山酮在鸡配合饲料中的LOD为0.05 μg·g-1,LOQ为0.2 μg·g-1。

1.3.1　样品的采集及保存　用抽样锥随机从10袋鸡配合饲料(由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供)的上、下两个部位分别取约2 kg饲料作为原始样品,然后将原始样品均匀混合,采用四分法缩减至约 1 kg,作为次级样品。将上述次级样品四分法缩减,取约200 g粉碎后过1 mm孔筛,混匀,装入磨口瓶中备用。

1.3.3　药物提取与净化　称取饲料样品1 g于50 mL离心管中,加入1 mL 100 g·L-1碳酸钠溶液和乙酸乙酯10 mL,涡旋3 min,8 000 r·min-1离心5 min。取上层液体转移至另一50 mL离心管中,剩余物再用 10 mL 乙酸乙酯重提1次,合并2次提取液,加入5 mL 0.125 mol·L-1乙酸铵溶液萃取,振摇1 min,8 000 r·min-1离心5 min。转移下层液体至另一50 mL离心管,重复提取1次。合并2次的下层溶液,用40 ℃氮气吹干残余的乙酸乙酯,作为备用液(含药物)。

1.2.4　标准液的配制　从冰箱中取出标准品储备液置于室温环境中,用移液管移取所需量,用流动相分别配制150、100、50、20、10、5和2 μg·mL-1的氢溴酸常山酮标准液,密封,在4 ℃下避光保存。

1.3　试验方法

前景理论自提出以来，被广泛用来解释各种类型的决策行为。但还未有人应用该理论来分析失地农民是否参与再就业培训的决策机制（以下简称“失地农民再就业培训决策机制”）。本研究认为，如果应用前景理论来解释失地农民再就业培训参与决策机制，那么可以推出以下三个假设：（1）失地农民进行再就业培训参与决策机制中包含有编辑和评价两个过程；（2）失地农民进行再就业培训参与决策机制中包含有主观价值判断和主观概率判断；（3）失地农民选择“参与”再就业培训，是因为该选项对应的前景价值大于“不参与”再就业培训这一选项对应的前景价值。

1.4.1　方法的特异性　取6个不同来源的空白鸡配合饲料,添加100 μL 2 μg·mL-1氢溴酸常山酮标准液,制成0.2 μg·g-1 6个配合饲料样品,按1.3.3节方法处理后进样分析,观察常山酮保留时间附近是否有杂峰干扰,判断检测方法的特异性。

社会服务是现代高校继续教育学院的主要功能之一，普通高校继续学院与地方的和谐发展、高校继续教育学院与社区成员的良性互动，要求高校继续教育学院开设社区学院，主动为社区成员提供教育培训服务。

1.2.3　标准储备液(200 μg·mL-1)的配制　准确称取10.0 mg氢溴酸常山酮标准品置入50 mL棕色容量瓶中,用0.25 mol·L-1乙酸铵溶解并定容,密封,在4 ℃下避光保存。

HLB柱依次用甲醇、水和0.125 mol·L-1乙酸铵溶液各3 mL活化。取备用液(含药物)10 mL过柱,加体积分数为1%甲醇溶液洗涤并抽干,3 mL甲醇洗脱,洗脱液在50 ℃下用氮气吹干。残渣物加1 mL流动相复溶,超声振荡2 min,涡动2 min。经过0.22 μm滤膜过滤,取25 μL进行HPLC测定。

1.4　方法学考察

1.3.2　试验色谱检测条件　C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。流动相:V(乙睛)∶V(0.25 mol·L-1乙酸铵溶液)∶V(纯净水)=5∶3∶12(pH4.3)[8,12]。流速1.0 mL·min-1,检测波长 243 nm,进样量 25 μL,柱温 25 ℃。

1.4.2　方法灵敏度的测定　添加适量氢溴酸常山酮标准液到1 g空白配合饲料样品中,按1.3.3节方法处理后检测,根据所测药物信噪比(S/N)不小于3和10分别为方法检测限(LOD)和定量限(LOQ)的原则,测得氢溴酸常山酮在鸡配合饲料中的检测限和定量限。

1.4.3　药物浓度标准曲线的绘制　用流动相稀释氢溴酸常山酮标准液分别制成0.2、0.5、1、2、5、10和15 μg·mL-1系列浓度的工作液直接进样测定,每个浓度5个重复,以标准溶液浓度(C)为横坐标,峰面积(S)为纵坐标,将峰面积与相应的药物质量浓度做线性回归,绘制标准曲线求出回归方程和相关系数。

1.4.4　基质加标工作曲线绘制　准确称取空白鸡配合饲料1 g样品若干份,加入氢溴酸常山酮标准液,使饲料中的药物水平分别为0.2、0.5、1、2、5、10和15 μg·g-1,按 1.3.3节方法进行操作,按照1.3.2节色谱条件进行测定,记录色谱图,得峰面积(S),每个水平5个重复,以S(峰面积)对C(浓度)回归,绘制标准曲线并得回归方程。

1.4.5　准确度和精密度的测定　采用标准添加法,在空白配合饲料中分别添加定量限(0.2 μg·g-1)和低(1.0 μg·g-1)、中(5.0 μg·g-1)、高(15.0 μg·g-1)4个质量浓度水平的样品,按照1.3.3节方法处理样品,按照1.3.2节色谱条件进行测定,每批次、每个浓度5个重复,连续测3 d,每天测1个批次。将氢溴酸常山酮的峰面积代入1.4.4节的线性方程,求出回收浓度,然后回收浓度除以理论浓度,求得氢溴酸常山酮不同质量浓度下的相对回收率,并分别计算日内和日间精密度。

1.4.6　方法的稳定性测定　分别于0、14 d吸取适量贮存在4 ℃的200 μg·mL-1储备液,用流动相稀释到20 μg·mL-1进样分析,每次3个重复,记录峰面积,考察氢溴酸常山酮在第14天的稳定性。

  

图1　氢溴酸常山酮检测的色谱图Fig.1　Detection chromatogram of halofuginone hydrobromideA. 标液色谱图;B. 空白色谱图;C. 空白鸡配合饲料添加氢溴酸色谱图。A. Standard chromatogram;B. Chromatogram of blank;C. Chromatogram of halofuginone hydrobromide in poultry feeds.

2　结果与分析

2.1　方法的特异性检测结果

空白鸡饲料中的氢溴酸常山酮在出峰时间为10.6 min附近无干扰,峰形良好,偏差小于2.5%(图1),说明该方法能去除基质对氢溴酸常山酮的干扰,能够用于后期的定性和定量测定。

  

图2　氢溴酸常山酮标准曲线(A)和鸡配合饲料 添加药物标准曲线(B)Fig.2　Standard curve of halofuginone hydrobromide(A) and standard curve of halofuginone hydrobromide in poultry feeds(B)

2.2　方法灵敏度的测定结果

1.2.2　HPLC流动相的配制　分别量取250 mL乙腈、150 mL 0.25 mol·L-1乙酸铵溶液、600 mL纯净水,定容至1 000 mL容量瓶中,经0.22 μm滤膜过滤,制成V(乙睛)∶V(0.25 mol·L-1乙酸铵溶液)∶V(纯净水)=5∶3∶12的流动相(用冰乙酸调pH4.3)。

11月23日,北京市人大常委会以专题询问的形式,让北京市政府及有关部门负责人与人大代表面对面,第一时间回应公众关切,并同步网络直播。

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2.3　方法的校准曲线绘制

2.3.1　药物浓度标准曲线　将由1.2.4节标准液稀释的质量浓度为0.2、0.5、1、2、5、10和15 μg·mL-1的标准工作液,按其所得峰面积的平均值与对应的标准溶液质量浓度作标准曲线。由图2可知,在0.2～15 μg·mL-1范围内线性回归方程为 y=2.591 4x+0.097 7。

我有一个朋友，年富力强，精力充沛。他除了在我们当地有一份工作，在外地还有一份跨界领域的工作，年头到年尾，两地跑，两头忙。由于他年年出色完成“两下里”的工作任务，便理所当然地享受双份报酬，买车便买车，买房便买房，没有这“奴”那“奴”的困厄和压力。我深为他过人的才气和不俗的业绩所折服，可又“眼前有景道不得”，一直不知道该怎样来概括他的这种进击状态，每每用“你活成了两个人”由衷地称赞他。

2.3.2　基质加标曲线　饲料样品按含药物0.2、0.5、1、2、5、10和15 μg·g-1添加,由试验结果可知,在0.2～15 μg·g-1范围内线性方程为y=1.933 3x+0.021 8。

2.4　方法的准确度和精密度

向空白饲料中添加定量限和低、中、高4个水平点的标准工作液,结果见表1。4个添加浓度的平均回收率均大于85%,日内、日间精密度均小于20%。

 

表1　鸡配合饲料中氢溴酸常山酮药物准确度和精密度Table 1　Recovery and precision result of halofuginone hydrobromid in poultry feeds

  

添加水平/(μg·g-1)Spikedlevel回收率/%Recovery日内精密度/%Intra-dayRSD(n=3)日间精密度/%Inter-dayRSD(n=5)0.2107.67±10.027.0～10.112.01.093.67±7.524.6～7.010.75.084.87±3.351.6～2.47.115.097.33±6.431.1～14.88.9

2.5　方法的稳定性

将在4 ℃贮存0 d和14 d的200 μg·mL-1药物储备液分别稀释为20 μg·mL-1的3个重复的工作液,进样分析,经过峰面积值的计算,得出日间变异系数为0.25%。

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消费税改革是新一轮财税体制改革的内容之一。《中共中央关于全面深化改革若干重大问题的决定》提出：“调整消费税征收范围、环节、税率，把高耗能、高污染产品及部分高档消费品纳入征收范围。”《深化财税体制改革总体方案》也将消费税作为税制改革的六大税种之一。财政部将消费税法的起草工作列入2018年的立法工作安排。在此契机下，不少学者建议对消费税的收入分配机制进行重新调整。

3　讨论

根据相关报道[8,12],流动相为乙腈、0.25 mol·L-1乙酸铵缓冲液、水(体积比5∶3∶12),检测波长243 nm,进样量25 μL。柱温为30 ℃时,出峰时间较早,杂峰与目标峰不能分离,所以本试验将柱温改为25 ℃后分离度良好,最终符合要求。

贾宝玉这才猛然发现自己一直低看了这位衣着朴素的穷亲戚，也难怪《红楼梦》著名评论家陈其泰会把邢岫烟称为“书中第一流人物”了。

分别选取乙腈、甲醇、乙酸乙酯等溶剂对饲料中的药物进行提取并检测,乙腈和甲醇提取的样品在空白色谱图中有干扰,回收率低[10,13]。随后配制甲醇-乙腈溶液(体积比1∶1)提取药物,但并未对样品色谱图和回收率有改善。而用乙酸乙酯提取样品时在空白色谱图上无干扰,所以首选乙酸乙酯为提取溶剂。

[4]　　　潘百明,雷翠云. 鸡球虫对十二种常用抗球虫药的耐药性试验[J]. 畜牧与兽医,2013,45(8):122-123.

在对净化条件的摸索中,通过检测过HLB柱前后的备用液(含药物)、淋洗液、洗脱液中氢溴酸常山酮浓度,发现备用液(含药物)过HLB柱后药物浓度很高。因此,判断回收率低的原因主要是HLB柱没能有效保留药物。为了排除各种因素对HLB柱的影响,经过试验的测定比较,发现备用液中残留的乙酸乙酯是关键因素,所以在提取含药物备用液时要在50 ℃下用氮气吹干残余的乙酸乙酯。

加入备用液(含药物)后的HLB柱子,需要淋洗去除杂质,通过对比甲苯和体积分数分别为0.5%、1%、5%、10%甲醇淋洗液的除杂能力,发现甲苯无淋洗效果,且对柱子有损坏作用,0.5%甲醇除杂能力较弱,5%和10%甲醇淋洗后回收率较低,而 1%甲醇淋洗液除杂效果好并且回收率能达到要求。

本试验采用高效液相色谱法测定了饲料中氢溴酸常山酮的含量,相对于文献[7-9]所建立的方法,本试验建立的方法操作更快速、简便,这主要得益于对样品处理方法的改进。试验在0.2～15 μg·g-1范围内,线性方程相关系数不小于0.999,回收率大于85%,日内和日间变异系数小于20%,达到了相关规定要求,所以本方法适用于饲料中氢溴酸常山酮的含量检测。

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产量结构调查取样涉及6个镇，7个小麦品种，共计20对样本，其中西农979样本6个，郑麦9023样本6个，衡观35样本4个，襄麦35、良星99、金皖999、西农585各1个。

Luo J Y. Study on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of arprinocid solution in broiler chickens[D]. Nanjing:Nanjing Agricultural Univeristy,2014(in Chinese with English abstract).

据文献报道[14],碳酸钠能促进氢溴酸常山酮由离子状态转变为分子状态,更容易从有机相进入水相。对提取过程中加入不同量碳酸钠的提取效果进行比较,发现加入1 mL 100 g·L-1碳酸钠溶液最合适。

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加入了调整算子的粒子位置，能够保证算法初期较好目标区域的发现.而随着迭代次数的增加，算子的作用幅度逐渐减小，有利于在最优解附近局部开发.这样，有效保证了全局搜索和局部开发之间的合理平衡．

[10]　　　王丽娜,王姝,田晓玲,等. 同位素内标法测定饲料中氢溴酸常山酮——超高效液相色谱-串联质谱法[J]. 现代畜牧兽医,2015(5):12-18.

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“家里养几只兔，种几棵果树，不能把一家人都绑这儿吧？”郭书凤心里的小算盘又打起来，一天，她对李贵说，“你和大儿子出去找活儿干，我自己在家就可以了。”

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