温运合剂是首届全国名中医汪受传教授治疗小儿脾虚泻的临床验方，由麸炒苍术，益智仁，砂仁等组成，具有温振脾阳、运脾化湿之功效。方中君药为麸炒苍术，历来医家对苍术的运脾功效多有发挥，故其药效学值得深入研究。本实验采用番泻叶水煎液制备小鼠脾虚泄泻模型，比较温运合剂与麸炒苍术水提物对小鼠脾虚泄泻的治疗作用，阐述其可能的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级ICR小鼠，雄性，6～8周龄，体质量18～22 g，由南京青龙山实验动物中心提供，合格证号：SCXK(苏)2017-0001。

1.2 药物与试剂

麸炒苍术饮片(安徽万生中药饮片有限公司，批号:161001)；温运合剂所需中药、番泻叶均购置南京中医药大学附属医院；氢氧化钠(西陇科学股份有限公司，批号：160705)；1-丙醇(99.7%)、氯甲酸正丙酯(98%)，均购自北京百灵威有限公司；异丁酸(Isobutyric acid，含量>99.0%)、异戊酸(Isovaleric acid，含量>99.0%)、戊酸(Valeric acid，含量>98.0%)，均购自东京化成工业株式会社；庚酸(Heptanoic acid，含量>98.0%)、丁酸(Butyric acid，含量>99.0%)，均购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；丙酸(Propionic acid，含量>98.3%)购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；己酸(Hexanoic-6,6,6-D3 Acid含量>99.0 %)、吡啶(含量≥99.9%)、正己烷(含量≥97.0%)，均购自美国Sigma公司，小鼠D-木糖试剂盒(江苏菲亚生物科技有限公司，批号:201705)，小鼠血清淀粉酶试剂盒(江苏菲亚生物科技有限公司，批号:201705)。蒙脱石散(思密达)由先声药业有限公司提供(批号：H19990307，3 g/袋)，培菲康(双歧杆菌三联活菌胶囊)由上海信谊药厂有限公司提供(批号：S10950032，0.21 g/粒)。

1.3 仪器

酶标仪(Thermo MULTISKAN GO型)，离心机(Thermo CL21R型)，显微镜(Nikon ECLIPSE Ti型 )，真空干燥箱(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司BGZ-140型)，三重四极杆气质联用仪(ThermoTSQ 8000型)；离心机(Beckman Coulter Allegra 64R型)；Allegra 64R型涡旋振荡器(Scientific IndustriesAllegra 64R型)；离心机(Eppendorf 5810R型)。

2 方法

2.1 番泻叶水提物的制备

番泻叶100 g，加入10倍体积的水，浸泡2 h，煮沸10 min后，过滤，滤液于45 ℃减压浓缩至生药量2 g/mL的番泻叶水煎液，保存于4 ℃待用。

综上所述，可先采用PCR法对支原体感染进行早期筛查，并采用固体或液体培养法观察后期的病原菌感染情况。可采用四环素类药物进行预防性治疗，然后根据药敏结果选择用药。

直接翻译法在汉译英时经常用到，其特点是能够直接表达出汉语所要表达的意思。以“车到山前必有路”为例，在英文翻译中可以用最简单的词汇进行直接翻译，译文为“the car will find its way round the hill when it gets there”，直接翻译难度较低，只要有英语基础的人都能看懂。

2.2 麸炒苍术水提物及温运合剂的制备

分别取苍术75 g，温运合剂420 g(含苍术75 g，炮姜30 g，益智仁75 g，砂仁15 g，茯苓75 g，生麦芽150 g)，分别加入10倍体积的水提取3次，每次1 h，过滤，合并滤液，减压浓缩至0.375 g/mL，2.1 g/mL的苍术水提取物及温运合剂，保存于4 ℃待用。

2.3 动物分组、造模与给药

2.4.3.4 衍生化过程 向上述提取液加入500 μL丙醇吡啶溶液(3∶2，v/v)和100 μL氯甲酸正丙酯(PCF)。涡旋10 s，超声1 min。衍生化后，使用正己烷萃取衍生化物质，首先向反应体系加入300 μL正己烷，涡旋1 min后，3 000 r/min离心5 min。取200 μL上层正己烷萃取液于进样瓶中。再次向反应体系中加入200 μL正己烷，涡旋1 min后，3 000 r/min离心5 min。再次取200 μL上层正己烷萃取液于进样瓶中。两次萃取液混合并离心后，取上清60 μL用于GC-MS/MS分析。

与空白对照组比较，模型组小鼠血清淀粉酶活性及血清D-木糖含量均明显降低(P<0.05),进一步佐证小鼠脾虚泄泻模型造模成功。见表2。

2.4 观察指标

2.4.3.3 供试品溶液配制 收集实验第15天的五组小鼠各50 mg粪便，分别加入1 000 μL 0.005 mol/L的NaOH水溶液(含5 μg内标己酸-d3)，涡旋10 min后，4 ℃离心(15 000 r/min×20 min)，取500 μL上清加入10 mL玻璃离心管中，再加入300 μL纯水，涡旋30 s，混匀。

2.4.4 小鼠肠道病变情况 取各组小鼠近端空肠组织，用生理盐水漂洗，洗去肠内容物，用滤纸吸去多余水分，置于10%甲醛溶液固定超过24 h。随后采用石蜡包埋、切片，HE染色后，在光学显微镜下检查空肠病变情况。

2.4.2 血清D-木糖含量、淀粉酶活性检测 给药14 d后，12 h禁食不禁水，于第15天，小鼠给予10% D-木糖试剂10 mL/kg，1h后小鼠自眼眶后静脉丛取血0.6 mL，自然凝固后5 000 r/min离心5 min，收集上层血清，分装于2个1.5 mL离心管中。置于-80 ℃冰箱冻存待测。按照试剂盒说明书方法测定上述血清中淀粉酶活性、D-木糖的含量[4]。

2.4.3 小鼠粪便短链脂肪酸测定

2.4.3.2 质谱条件 离子源：EI电子源；电子能量70 eV；传输线温度290 ℃；离子源温度：230 ℃；质量扫描范围m/z 30～600，采集时间2.2～28 min。

2.4.3.1 色谱条件 载气为氦气，流速为1.2 mL/min，采用分流模式，进样口温度为260 ℃，分流比为10∶1，升温程序：起始温度50 ℃，保持2 min后，以10 ℃/min速率升至70 ℃后，然后以3 ℃/min速率升至85 ℃，再以5 ℃/min速率升至110 ℃后，然后以30 ℃/min速率升至290 ℃后保持8 min；进样量为1 μL。

2.4.1 小鼠一般状态观察 上午给药前观察小鼠的一般状态，包括毛发光泽度，精神状态，进食量，活动情况，大便形态等情况，并记录小鼠体质量。小鼠腹泻程度按照以下等级评分：0分表示无腹泻，粪便正常，圆柱形；1分表示有腹泻发生，粪便稀软、有形；2分表示有腹泻发生，粪便黏稠、不成形、水份含量高；3分表示有腹泻发生，粪便液态、不成形、水样稀粪。

在彭氏看来，吴中前贤徐枋在明清易代之际的隐遁山林，在孤独中“继志述事”，默默地坚守着天地存亡续绝之使命，其所作所为，完全可以和顾炎武、张履祥、朱用纯、汪沨、李颙等儒学大师相颉颃，故而在这组传记中，徐枋自应有一席之地。徐枋之能入选，大概也就是徐枋的老友叶燮所说的：“先生于举世颓流之日，毅然以世道人心之责，只身肩之不敢辞，志以屈而伸，身以晦而荣，以视碌碌降且辱者，其相去何如矣！”［5］卷一六《孝廉徐俟斋先生墓志铭》，156

ICR小鼠，雄性，6～8周龄，适应性饲养3 d后随机分为空白对照组，模型组，阳性药组，麸炒苍术水提物低剂量组(CL)，麸炒苍术水提物高剂量组(CH)，温运合剂低剂量组(WL)和温运合剂高剂量组(WH)。每天给予空白组小鼠0.2 mL生理盐水，其余各组动物每10 g给予番泻叶水煎液0.15 mL造模，每日1次，连续14 d。阳性药组给予蒙脱石散和培菲康混悬液(剂量分别为10、7 g/kg)，麸炒苍术水提物低、高剂量组剂量分别为1.9 g/kg和3.75 g/kg，温运合剂低、高剂量组剂量分别为10 g/kg和20 g/kg。模型组与空白对照组给予等量生理盐水，每日1次，连续给药1周[1-3]。

(2) 崩塌发生机制。构成陡崖的岩体在片理面、结构面组合切割和差异风化的作用下，形成多处凹腔，造成坠落式、滑移式危岩多有掉落，落石块径最大可达4 m×5 m×3 m。尤其是工程施工期间，由于隧道开挖扰动，危岩掉落频率加剧，直接威胁下部隧道口的工程施工安全，若不采取措施，在降雨、地震等作用下，必然会对下部隧道和相连的克枯特大桥形成重大安全隐患。

3 结果

3.1 体质量与腹泻情况

造模第2天，与对照组相比，模型组与各治疗组均出现明显腹泻。第14天，模型组与各治疗组均出现体质量增长缓慢，与对照组比较具有显著差异(P<0.05)。第14天，模型组小鼠精神萎靡不振，倦怠懒动，食欲减退，拱背，便溏，毛色污秽失泽，体毛脱落，呆纳、反应迟钝，畏寒蜷卧，喜扎堆，肛门粘有粪便，个别小鼠出现脱肛现象，参考国家中医药管理局制定的《中医病证诊断疗效标准》[5]，说明脾虚泄泻模型建立成功[5]。给药1周后，各治疗组小鼠精神尚佳，腹泻程度好转，与模型组相比，差异具有显著性(P<0.05)。空白对照组小鼠皮毛光亮，活泼好动，精力旺盛，进食及粪便形态正常。见表1。

 

表1 各组小鼠体质量变化

  

组别n第2天第7天第14天对照组1022．12±0．7225．59±0．90∗28．57±1．72∗模型组1022．15±0．7523．98±1．15#24．91±1．93#阳性药组1022．05±0．6523．08±1．05#24．81±1．83#CL组1022．07±1．2824．16±1．81#25．53±2．48#CH组1121．87±1．1923．96±1．82#24．58±2．36#WL组921．70±1．3224．37±1．5125．37±1．82#WH组921．79±1．2224．29±1．4125．28±1．79#

注：与模型组比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05。

3.2 血清D-木糖含量、淀粉酶活性水平

小麦播种效果会受播种数量、垄深和垄距以及气温等多方面影响。因此，一方面要注重播种期间的温度，如冬性型小麦要求气温在16～18摄氏度，5厘米地温17～19摄氏度；半冬性小麦要求气温在14～16摄氏度，5厘米地温15～17摄氏度；春性型小麦要求气温在12～14摄氏度，5厘米地温13～15摄氏度。另一方面垄深和垄间距要适度，一般垄深、垄间距分别为80厘米和70厘米。

3.3 小肠组织学变化

与空白对照组相比，模型组小鼠小肠主要病变为黏膜层绒毛间质水肿(P<0.05)。上述改变，模型组与正常组有统计学差异，提示模型复制成功。各组肠绒毛水肿程度相比，苍术高剂量和温运高剂量引起的水肿程度最轻，其次是温运低剂量。见图1。

 

表2 各组小鼠血清淀粉酶活性和血清D-木糖含量比较

  

组别剂量/(g·kg-1)血清淀粉酶/(U·mL-1)血清D 木糖/(pg·mL-1)对照组-64．14±4．1623．06±1．84模型组14．9457．82±5．51∗17．62±2．12∗

注：与对照组比较，*P<0.05。

  

对照组

  

模型组

 

麸炒苍术高剂量组

  

麸炒苍术低剂量组

  

温运合剂高剂量组

 

温运合剂低剂量组

图1 各组空肠HE染色情况(×200)

3.4 GC-MS检测小鼠粪便短链脂肪酸

通过提取短链脂肪酸及内标的峰面积检测各组中短链脂肪酸的水平，结果表明：与正常对照组相比，模型组小鼠粪便中的乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸水平明显降低；与模型组相比，麸炒苍术水提物低剂量组小鼠粪便中的丙酸水平明显升高，麸炒苍术水提物高剂量组小鼠粪便中的丙酸、异戊酸水平明显升高，温运合剂高低剂量组均能显著提高小鼠粪便中的乙酸、丙酸、异丁酸水平；另外，与模型组相比，温运合剂高剂量组还能提高小鼠粪便中的异戊酸水平，阳性药组能提高丙酸、异戊酸水平。具体结果见图2。

4 讨论

全国名老中医药专家汪受传教授基于40余载的临床实践，认为脾虚而致泄泻不仅在于脾气虚弱湿浊困遏，而且常常有脾阳亏虚，因脾阳不振失于温煦而使运化无力，以致泄泻迁延难愈，由此提出了温运脾阳法为主治疗小儿脾虚泻的学术观点，并用于临床，提高了健脾法治疗的疗效。温阳药味辛性温擅于振奋鼓动，温脾之品则如同釜底加薪，能帮助食物腐化，游溢精气，升发转輸；脾阳温煦，又能燥湿消阴，使水湿流转，不至与水谷合污下流。故温运脾阳为小儿脾虚泻的重要治法。温脾阳历来与补脾气同时应用，例如《伤寒论》理中丸，方由人参、干姜、白术、甘草组成，就体现了气、阳并补的学术思想。汪受传教授根据他长期从事中医儿科临床工作的经验，认为根据小儿脾虚泻的临床证候表现、病机分析，在治疗时应当益气、温阳并用，且侧重于温振脾阳、扶助运化，理中汤可以作为小儿脾虚泻的基本方，但还需要增加温运脾阳药物的使用，由此提出了他的经验方—温运颗粒及其加减应用。现代药理研究认为，利用番泻叶造成的动物模型较为符合中医脾虚泄泻证候范畴[6-8]，故本实验选用灌胃番泻叶浓缩液建立小鼠腹泻模型。本实验结果显示，麸炒苍术水提物及温运合剂均能改善小鼠腹泻。

 

 

 

  

注：C.正常对照组；M.模型组；CL.麸炒苍术水提物低剂量组；CH.麸炒苍术水提物高剂量组；WL.温运合剂低剂量组；WH.温运合剂高剂量组；P.阳性药组。与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与对照组比较，#P<0.05，##P<0.01。

 

图2 GC-MS检测小鼠粪便短链脂肪酸

粪便被认为是肠道菌群和宿主共代谢的产物，它不仅可以反应肠道菌群的状态，而且在共栖菌与宿主之间起着桥梁作用，能够全面反映宿主代谢轮廓。肠道菌群代谢通路的变化可能影响短链脂肪酸等共生因子的产生，从而影响宿主的健康状况[9]。短链脂肪酸(SCFAs)作为肠道内细菌发酵未消化碳水化合物的主要产物，可调节肠道微生物菌群，促进结肠细胞的增殖，成为结肠黏膜的重要营养素[10]，主要包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸等，其中乙酸、丙酸和丁酸的含量最高。

蒲琳后来给了自己一个合理的解释：张盈盈对她用了计谋，那就是欲擒故纵，化百炼钢为绕指柔。故此她的青春期闹腾不起来，张盈盈不知省了多少心。

SCFAs的检测结果表明：与正常对照组相比，模型组小鼠粪便中的乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸水平明显降低；与模型组相比，麸炒苍术水提物低剂量组小鼠粪便中的丙酸水平明显升高，麸炒苍术水提物高剂量组小鼠粪便中的丙酸、异戊酸水平明显升高，温运合剂高低剂量组均能显著提高小鼠粪便中的乙酸、丙酸、异丁酸水平；另外，与模型组相比，温运合剂高剂量组还能提高小鼠粪便中的异戊酸水平，阳性药组能提高丙酸、异戊酸水平。实验结果提示：提高短链脂肪酸水平可能是温运合剂及其君药麸炒苍术水提物改善番泻叶灌胃致脾虚泻模型小鼠腹泻情况的作用机制之一。

参考文献:

[1] 赵艳玲,山丽梅,王伽伯.桃花止泻颗粒对慢性腹泻作用的实验性研究[J].中成药，2010，32(1)：131-132.

[2] 王丹凤，刘玉强，才谦.苍术麸炒前后健脾作用研究[J].时珍国医国药，2013，24(1)：155-156.

[3] 徐珊，郭晓明，康安，等.温脾化湿助运方对急性腹泻小鼠模型的药效研究[J].中医儿科杂志，2014，10(1)：15-18.

[4] 徐敬儒，刘玉强，才谦.平胃散中麸炒苍术用生苍术替代前后药效学比较研究[J].上海中医药大学学报，2013，27(6)：78-81.

[5] 国家中医药管理局.中医病证诊断疗效标准[M].南京：南京大学出版社,1994:289-290.

[6] 李传英，马永华，王宝玉，等.脾虚泄泻证动物模型的研究[J].浙江中医药杂志，1982，17(8)：355.

[7] 刘汶，张敦义.番泻叶致脾虚证动物模型的造模方法[J].中国中西医结合脾胃杂志，1998，6(4)：231-232.

[8] 曲长江，林庶如，夏淑杰.苦寒泻下两种脾虚模型的免疫学比较研究[J].辽宁中医杂志，1999，26(3)：133-134.

[9] SMITH PM, HOWITT MR, PANIKOV N, et al.The microbial metabolites, short-chain fatty acids, regulate colonic treg cell homeostasis[J].Science， 2013,341(6145) :569-573.

[10] ICHIKAWA H, SHINEHA R, SATOMI S, et al. Gastric or rectal instillation of short-chain fatty acids stimulates epithelialcell proliferation of small and large intestine in rats[J]. Dig Dis Sci,2002,47(5):1141-1146.