冠心病是全球范围内导致人类死亡的主要疾病之一，每年有700余万人死于冠心病，其中近半数死于急性心肌梗死[1]。及时有效地实施血运重建治疗，恢复缺血损伤心肌的有效血流灌注，是当前应对急性心肌缺血事件的有效方法，但近年来的大量研究显示，再灌注治疗在一定程度上引起了进一步的心肌损伤，并影响治疗效果及患者的预后，提出了心肌缺血/再灌注损伤(Myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)的概念，并开展了MIRI发生机制的广泛研究，如何减轻或避免MIRI，一直是亟需解决的重要的临床问题。近年来研究表明，线粒体功能障碍及动力学失衡是MIRI的重要病理机制[2-3]。线粒体在心肌细胞能量代谢、信号转导、离子平衡、细胞凋亡等方面的调节中起着关键作用。心肌细胞发生缺氧/复氧时，线粒体Ca2+超载，产生大量活性氧，进而激活细胞坏死途径，诱导细胞凋亡，参与MIRI的形成。已有的实验与临床研究均已证实，大株红景天能一定程度上减轻MIRI的炎症反应、清除氧自由基、抑制细胞凋亡等，发挥心肌保护作用[4]。然而大株红景天对再灌注损伤心肌线粒体功能及线粒体动力学的作用，尚不明确。

本研究通过制备大鼠原代心肌细胞的H/R模型，模拟MIRI的病理过程，运用能量代谢、活性氧、线粒体膜电位及线粒体动力学相关蛋白OPA1、DRP1及p-DRP1的表达水平等指标，探讨大株红景天对再灌注损伤心肌线粒体功能及线粒体动力学的影响，为临床防治MIRI提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

健康SD大鼠(1～3 d龄)，购自南京军区南京总医院动物实验中心，实验动物合格证号:SCXK(军)2012-0014；大株红景天注射液(5 mL/支，通化玉圣药业有限公司，批号：Z20060361)；ATP检测试剂盒、JC-1荧光探针检测线粒体膜电位试剂盒、DCFH-DA检测ROS试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；MTT(Ameresc公司)；Dynamin-related protein 1一抗、Optic atrophy 1一抗(Abcam公司)；山羊抗兔IgG/辣根酶标记(北京中杉金桥生物技术公司)；GAPDH多克隆抗体(美国Santa Cruz公司；DMEM细胞培养基、胎牛血清(Gibco BRL公司)；MCO-15AC型二氧化碳培养箱(德国Heraeus公司)；多功能酶标仪(Molecular Devices)；PAC200转膜电泳仪(Bio-Rad)；Novex Mini-Cell转膜电泳槽(Invitrogen)；自动X光片机UVP凝胶成像系统(GelDoc-It/EC3)。

1.2 方法

1.2.1 原代心肌细胞的分离与培养 参照Maass[5]等方法,取1～3 d龄的SD大鼠6只，无菌条件下取心脏。用镊子撕开心包膜，除去心包、心房等组织，收集心室组织，剪碎；加入0.1%胰酶，放入37 ℃恒温磁力搅拌器上的水浴盒中消化10～15次(每次8～10 min)，收集上清液，转移至装有10%胎牛血清15 mL的离心管中混匀，终止胰酶消化；室温1 000 r/min离心5 min，弃上清，加适量DMEM培养基重悬；用200目滤网过滤后，移至10 cm培养皿中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养1 h，通过差速贴壁法除去杂细胞；收集培养皿中的上清液，补足DMEM培养基，均匀接种到六孔板中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养；24～30 h后心肌细胞多数贴壁并开始出现自发搏动，PBS洗细胞2次，更换DMEM培养基，继续培养12～24 h，待心肌细胞充分伸展连成一片，自发搏动明显时，用于后续实验。

娘在簸豆子的时候，抖着两个膀子，一忽闪，一忽闪，黄橙橙的豆子就飞上去，在漫天云里哗地绽开来。冬至正担心着呢，又见娘用簸箕轻轻一迎，豆子就乖乖地掉进去了。皮是皮，粒子是粒子。大的放一边，圆的放一边，瘪粒子和豆荚皮都归到一边。娘再簸，再迎，只见满天的豆子飞来飞去，真比天女散花还好看。冬至看呆了。笼子里的鸡鹅也看呆了。斜斜地朝天空望上去，又齐刷刷地随着女主人的动作看下来。如此往复，恰似舞蹈一般。[1]30

[(21.6-8.8)×0.65+(0.731-0.26)×317.5] ×270×12=51.15(万元)

1.2.2 实验分组与处理 将培养的原代心肌细胞随机分5组，每组6个复孔：①空白对照组；②H/R组：缺氧4 h，复氧12 h；③前干预组：于大株红景天终浓度为20 mL/L的DMEM培养基孵育12 h后，缺氧4 h，复氧12 h；④后干预组：缺氧4 h后，换为大株红景天终浓度为20 mL/L的DMEM培养基，复氧12 h；⑤前后干预组：先大株红景天预孵育12 h后，缺氧4 h后，换为大株红景天终浓度为20 mL/L的DMEM培养基，复氧12 h。

1.2.6 提取细胞蛋白 前期实验结束后先用预冷的PBS将细胞洗3遍，再在六孔板中每孔加入200 μL细胞裂解液，冰上孵育30 min；收集细胞裂解液于预冷的EP管中，12 000 r/min 4 ℃离心15 min，收集上清液1.5 mL于离心管中，按照BCA测定试剂盒说明书操作，测定各组样品中蛋白浓度。

1.2.4 活性氧簇(ROS)含量检测 收集细胞后，重悬于适量10 μmol/L DCFH-DA溶液中，37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。每隔3～5 min颠倒一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液将细胞洗3遍，最后用200 μL PBS重悬，用荧光酶标仪检测结果。选取激发波长488 nm、发射波长525 nm。

与空白对照组比较，H/R组红绿荧光比值明显下降，提示MMP水平下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与H/R组比较，S+H/R组、H/R+S组及S+H/R+S组，红绿荧光比值明显升高，提示MMP水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；S+H/R+S组与S+H/R组、H/R+S组比较，红绿荧光比值明显升高，提示MMP水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；S+H/R组与H/R+S组比较，MMP无明显变化。结果见表3。

1.2.3 心肌细胞三磷酸腺苷(ATP)水平检测 吸除培养液，按六孔板中每孔加入200 μL裂解液，裂解细胞。裂解后4 ℃ 12 000 g离心5 min取上清。于96孔板中加入100 μL ATP检测工作液，室温放置5 min。在检测孔内加50 μL样品或ATP标准品，迅速混匀。使用多功能酶标仪上的Luminometer功能测定RLU值。根据标准品的检测值绘制出标准曲线，根据标准曲线计算出样品中ATP浓度。

1.2.7 样本蛋白的制备 5×蛋白上样缓冲液：按1∶4的比例配制上样蛋白，在沸水中煮5 min使蛋白变性，冷却至室温后上样。

1.2.8 SDS-PAGE电泳 安装电泳装置，配制好10%分离胶和5%浓缩胶后进行上样，以浓缩胶90 V，约15 min，分离胶120 V，约60 min进行电泳，电泳结束后使用稳流200 mA进行转膜120 min，封闭2 h，孵育一抗过夜，TBST洗膜3次后，孵育二抗2 h，再用TBST洗膜5次，配制好的化学发光液于自动X光片机暗室中充分浸膜，进行曝光。

实验结果显示，各组间Drp1的表达量无明显差异，而p-Drp1的表达量变化明显。与空白对照组比较，H/R组p-Drp1的表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与H/R组比较，H/R+S、S+H/R组、S+H/R+S组p-Drp1的表达均下调，差异有统计学差异(P<0.05)；S+H/R+S组较前、后单一干预的两组p-Drp1的表达量下调更明显，差异有统计学意义(P<0.05)；H/R+S组与S+H/R组组间比较p-Drp1的表达量无差异，见图2。

1.3 统计方法

与空白对照组比较，H/R组心肌细胞内DCF荧光增强，提示ROS含量增多，差异有统计学意义(P<0.05)；与H/R组比较，S+H/R组、H/R+S组及S+H/R+S组细胞内DCF荧光强度减弱，提示ROS含量减少，差异有统计学意义(P<0.05)；S+H/R+S组与S+H/R组、H/R+S组比较，ROS生成减少，差异有统计学意义(P<0.05)；S+H/R组与H/R+S组ROS含量无明显差异。结果见表2。

阀室低功耗安防系统由阀室部分和站场部分构成。物理构架为基于IP的2层网络构架。逻辑构架为基于物联网技术的3层网络构架，分为：感知层、网络层、应用层[1-2]。

2 结果

2.1 大株红景天对H/R心肌细胞内ATP水平的影响

与空白对照组比较，H/R组心肌细胞内ATP含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与H/R组比较，S+H/R组、H/R+S组及S+H/R+S组，ATP含量均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；S+H/R+S组较S+H/R组、H/R+S组ATP含量更高，差异有统计学意义(P<0.05)；S+H/R组与H/R+S组比较，ATP含量无明显差异。结果见表1。

 

表1 大株红景天对H/R心肌细胞内ATP水平的影响

  

组别nATP浓度/(μmol·L-1)空白对照组60．177±0．016H/R组60．102±0．027∗H/R+S组60．156±0．030#▲S+H/R组60．149±0．026#▲S+H/R+S组60．188±0．033#

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与H/R组比较，#P<0.05；与S+H/R+S组比较，▲P<0.05。

2.2 大株红景天对H/R心肌细胞内ROS含量的影响

实验数据用SPSS19.0软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间两两比较方差相齐时采用LSD法，方差不齐时采用Dunnett's T3，结果以P<0.05为差异有统计学意义。

 

表2 大株红景天对H/R心肌细胞内ROS含量的影响

  

组别nOD(488/525)空白对照组647．58±2．82H/R组675．98±4．84∗H/R+S组662．85±7．23#▲S+H/R组666．51±6．87#▲S+H/R+S组655．27±5．98#

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与H/R组比较，#P<0.05；与S+H/R+S组比较，▲P<0.05。

2.3 大株红景天对H/R心肌细胞MMP的影响

1.2.5 线粒体膜电位(MMP)检测 收集细胞后，六孔板每个孔的细胞重悬于0.5 mL细胞培养液中，加入0.5 mL JC-1染色工作液，颠倒混匀，置于细胞培养箱中37 ℃孵育20 min。结束后600 g 4 ℃离心3 min沉淀细胞，弃上清。用JC-1染色缓冲液(1×)洗涤2次后，再用500 μL JC-1染色缓冲液(1×)重悬，加入96孔板，立即上机检测。检测JC-1单体时激发光设置为490 nm，发射光设置为530 nm；检测JC-1聚合物时，激发光设置为525 nm，发射光设置为590 nm。

2.4 大株红景天对H/R心肌细胞OPA1蛋白表达的影响

实验结果显示，与空白对照组比较，H/R组OPA1的表达减少，差异有统计学意义(P<0.05)；与H/R组比较，H/R+S、S+H/R组、S+H/R+S组OPA1的表达均上调，差异有统计学意义(P<0.05)；H/R+S、S+H/R组与S+H/R+S组组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

采用SPSS 17.0软件对数据进行分析处理，计量资料以（均数±标准差）表示，采用t检验；计数资料以（n，%）表示，采用χ2检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2011年中央1号文件提出必须大力加强水利建设，加快推进西南等工程性缺水地区重点水源工程建设，加大公共财政对水利的投入，加强对水利建设的金融支持，广泛吸引社会资金投资水利。当年召开的中央水利工作会议明确提出今后10年全社会对水利的年平均投入比2010年高出一倍。

 

表3 大株红景天对H/R心肌细胞MMP的影响

  

组别nA(红/绿)空白对照组61．415±0．222H/R组60．604±0．136∗H/R+S组60．932±0．215#▲S+H/R组60．847±0．134#▲S+H/R+S组61．185±0．201#

注：与空白对照组比，*P<0.05；与H/R组比较，#P<0.05；与S+H/R+S组比较，▲P<0.05。

 

  

注：与空白对照组比，*P<0.05；与缺氧/复氧组比较，#P<0.05。

 

图1 大株红景天对H/R原代心肌细胞中OPA1蛋白表达的影响

2.5 大株红景天对H/R心肌细胞Drp1、p-Drp1蛋白表达的影响

1.2.9 半定量分析 扫描胶片条带，使用Image J软件进行分析，得出各条带灰度值，将各目的蛋白的灰度值除以相应内参GAPDH的灰度值，从而得到标化后的目的蛋白表达量。

 

  

注：与空白对照组比，*P<0.05；与缺氧/复氧组比较，#P<0.05；与前后干预组比较，▲P<0.05。

 

图2 大株红景天对H/R损伤的原代心肌细胞中Drp1、p-Drp1蛋白表达的影响

3 讨论

线粒体组成约占总细胞体积的1/3，是真核生物细胞重要的细胞器，不仅能通过氧化磷酸化为细胞生命活动提供能量，维持心肌正常的电生理和收缩功能，还参与调节胞内Ca2+稳态、ROS的生成及细胞凋亡等的调控，同时，线粒体是ROS的主要产生场所，因此，线粒体良好的功能状态对于维护细胞的正常生理功能至关重要[6]。

MIRI的机制目前尚不完全明确，但已证实与线粒体功能障碍导致的ATP生成减少、ROS生成增多、MMP降低、Ca2+超载等有密切关系。心肌缺血缺氧时，线粒体中的能量代谢转为以无氧酵解为主，ATP生成骤减，同时生成大量乳酸，导致细胞内酸中毒，继而损伤线粒体。心肌再灌注时，线粒体功能尚未恢复，ATP生成仍然不足，但是，由于局部血氧浓度的瞬间增高，使线粒体内ROS爆发性生成，ROS进一步破坏氧化-还原的动态平衡，导致线粒体膜通透性转换孔(mPTP)开放，使膜内外的带电离子分布发生异常，造成电化学梯度耗散，MMP降低。MMP降低可诱发线粒体释放细胞色素C等凋亡因子到胞浆，进而级联激活Caspase系列蛋白，启动细胞凋亡程序。由此可见，H/R导致线粒体功能障碍，ATP、ROS、MMP相互关联影响，进而造成进一步心肌损伤[7-8]。

回头看看孔子为什么说孟之反不自夸。孔子举了一个典型事例：有一次，在抵御齐国的战役中，鲁国右翼的军队溃败了，孟之反走在最后，掩护全军，将进城门，便鞭打着马匹，一面说道：“不是我敢于殿后，是马匹不肯快走的缘故。”

线粒体是通过持续不断地融合-分裂循环，维持线粒体网络结构的稳态。线粒体融合和分裂的动态过程即线粒体动力学，由一系列相关蛋白所调控，目前作为治疗心脏疾病的新靶点而被逐步深入研究[9]。MIRI是一个复杂的病理过程，与线粒体动力学密切相关。生理状态下，线粒体融合有助于线粒体的稳定，并促进代谢产物、蛋白及线粒体DNA的分配；线粒体分裂则促进细胞增殖、ROS的产生及线粒体自噬。线粒体的融合-分裂受动力蛋白相关的GTP蛋白酶的精细调控，包括线粒体融合相关蛋白(Mfn)、线粒体分裂相关蛋白Drp1和线粒体分裂蛋白1，其中Drp1已被证实在细胞新陈代谢、凋亡和线粒体自噬中均发挥重要作用，参与MIRI的病理过程[6]。在心肌I/R过程中，Drp1在丝氨酸616、637(Ser616、Ser637)位点磷酸化，其中Ser616上的磷酸化由细胞周期蛋白依赖性激酶1(Cdk1)/细胞周期蛋白B(cyclinB)调控，该位点的磷酸化可诱导Drp1易位到线粒体外膜，造成线粒体大量片段化，使心肌细胞氧化磷酸化水平下降，细胞能量代谢发生障碍，线粒体膜电位下降，进而导致心肌细胞凋亡[10]。

1. 钢琴演奏中的心理因素（Psychological Factors）。人的大多行为都会受到心理活动的影响，心理活动即心理意识，它通过技巧把音乐的各要素如节奏、旋律、和声等融合为音响，其音响的振动、泛音等充分体现出演奏者的心理感觉、听觉、直觉和意志。演奏中会产生一系列心理活动，包括欲望、动机、情感、记忆、想象、应变心理、临场状态等心理因素，随之可能会产生各种演奏心理问题。例如，心理学研究常发现一种“特殊社交恐惧症”，表现在与人的一般交往并无异常，但演奏时就感到恐惧而出现脸红、口干、结巴、颤抖、演奏“抛锚”等现象，实为心理因素作祟，往往因过于紧张、焦虑导致压力丛生，然心理作用是也。

红景天生长于高寒缺氧地区，主要活性成分为红景天苷。药理研究显示，红景天苷具有抗缺氧、抗疲劳和增强免疫功能等多重功效。已有的研究证实，大株红景天可通过降低心肌氧耗、清除活性氧自由基、抑制炎性因子表达、调节一氧化氮合酶活性和阻滞心肌细胞内钙超载等机制，抑制心肌细胞凋亡，产生心脏保护作用[10-13]。本实验结果显示，与空白对照组比较，H/R的心肌细胞内ATP水平显著下降，ROS含量显著增加，MMP降低，提示H/R的心肌细胞因线粒体功能障碍而受损；OPA1的表达明显减少，提示H/R可以减少OPA1的表达，从而使线粒体片段化增加；p-Drp1表达显著增加，提示H/R导致Drp1在Ser616位点的磷酸化增加，线粒体分裂增加。应用大株红景天干预，无论前干预组、后干预组及前后干预组，均较H/R组ATP水平增加，ROS含量减少，MMP提高，OPA1表达上调，p-Drp1表达下调，显示大株红景天能改善H/R受损引起的心肌细胞线粒体的功能障碍及动力学失衡，无论预防性给药还是损伤后治疗性给药，对再灌注损伤的心肌细胞都有一定的保护作用。

研究结果还显示，前后干预组较单一前干预组、后干预组的保护作用更加显著，因此，血运重建前、后均给药的方式，能加强这一保护作用。

本研究结果证实，大株红景天对H/R导致的心肌细胞损伤具有一定的保护作用，改善损伤后线粒体的功能障碍，促使线粒体动力学恢复平衡，是实现其保护作用的重要机制，值得进一步深入研究。

参考文献:

[1] FROHLICH GM, MEIER P, WHITE SK, et al. Myocardial reperfusion injury: looking beyond primary PCI[J]. Eur Heart J, 2013, 34(23): 1714-1722.

[2] PAILLARD M, TUBBS E, THIEBAUT PA, et al. Depressing mitochondria-reticulum interactions protects cardiomyocytes from lethal hypoxia-reoxygenation injury[J]. Circulation, 2013, 128(14): 1555-1565.

[3] HE X, BI XY, LU XZ, et al. Reduction of Mitochondria-Endoplasmic reticulum interactions by acetylcholine protects human umbilical vein endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2015, 35(7): 1623-1634.

[4] 刘馨骏，宫剑滨，潘涛．红景天苷对大鼠缺血/再灌注损伤心肌Akt/GSK-3作用的研究[J]．医学研究生学报，2015,28(2)：146-148．

[5] MAASS AH, BUVOLO M. Cardiomyocyte preparation, culture, and gene transfer[J]. Method Mol Biol, 2007,366 (2): 321-330.

[6] ZOROV DB, JUHASZOVA M, SOLLOTT SJ. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS Release[J]. Physiol Rev, 2014, 94(3): 909-950.

[7] 陈伟.线粒体通透性转换孔道与心肌缺血再灌注损伤[J]. 心血管病学进展, 2013, 34(7):571-574.

[8] ALAMEDDINE A, FAJLOUN Z, BOURREAU J, et al. The cardiovascular effects of salidroside in the Goto-Kakizaki diabetic rat model[J]. J Physiol Pharmacol, 2015, 66(2): 249-257.

[9] ONG SB, HAUSENLOY DJ. Mitochondrial dynamics as a therapeutic target for treating cardiac diseases[J]. Handb Exp Pharmacol, 2017, 240: 251-279.

[10] 庞勇军,孙莉,谢文娟,等.红景天苷促进培养乳鼠心肌细胞肌质网钙离子的释放[J]. 中国病理生理杂志, 2011, 27(10): 2021-2023, 2026.

[11] ZHU L, WEI T, CHANG X, et al. Effects of salidroside on myocardial injury in vivo in vitro via regulation of Nox/NF-κB/AP1 pathway[J]. Inflammation, 2015, 38(4): 1589-1598.

[12] 张龙飞,崔玉娟,平政,等.红景天苷对心力衰竭大鼠心肌线粒体呼吸功能的影响[J].解放军医药杂志,2014,26(11): 1-5, 10.

[13] 朱凌鹏,常厦云,何贺,等.红景天苷对脂多糖诱导的小鼠心肌损伤保护作用的研究[J]. 药学与临床研究, 2015, 23(1): 13-15.