恶性肿瘤是危害人类健康最严重的疾病之一，乳腺癌是女性最常见的肿瘤，近年来乳腺癌在我国的发病率和死亡率逐年上升[1]。目前常用的对抗肿瘤的方法有化疗、放疗，这些方法通过细胞毒作用杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞也产生严重的毒副作用，不仅选择性低还存在产生多药耐药性的问题，开发疗效好且毒性小的药物刻不容缓[2]。国医大师周仲瑛根据多年的临床实践经验，创制了消癌解毒方(XAJDF)，方由白花蛇舌草、半枝莲、山慈菇、莪术、太子参和麦冬组成，具有扶正祛邪，攻补兼施的功效[3]。临床应用消癌解毒方，对于乳腺癌、肝癌、食管癌等恶性肿瘤均有确切疗效，可以提高患者抗肿瘤的免疫功能[4-6]。现代药理学研究表明，消癌解毒方对肝癌、肺癌移植瘤动物模型均有抑制作用[7-8]，可以抑制人结肠癌细胞的糖酵解过程[9]。消癌解毒方针对乳腺癌的临床疗效确切，但缺乏相关实验性研究。本实验观察消癌解毒方提取物抑制MDA-MB-231增殖的作用并探讨其可能的机制，为进一步开发消癌解毒方的临床价值奠定坚实的基础。

1 材料

1.1 药物与试剂

白花蛇舌草、半枝莲、山慈菇、莪术、太子参和麦冬组成，各味药均购于亳州国苑中药材饮片有限公司，经南京中医药大学谷巍教授鉴定为正品；称取药材白花蛇舌草154 g、半枝莲39 g、莪术77 g、山慈菇77 g、太子参77 g和麦冬77 g，加入10倍量水煎煮2 h，收集滤液后再加8倍量水煎煮1.5 h，收集并合并滤液，浓缩为生药含量2 g/mL的药液，加入乙醇至含醇量70%，静置24 h后抽滤取滤液，浓缩，低温干燥得浸膏粉约94 g(浸膏得率约为19%)，取0.3 g浸膏粉溶于1 mL二甲基亚砜(DMSO)中，超声助溶，配制母液，再以培养基配成实验所需浓度工作液，过滤除菌，根据需求进行浓度梯度稀释。

胎牛血清(Capricorn scientifuc公司，批号：1705124)；DMEM高糖培养基，胰蛋白酶溶液，青霉素-链霉素溶液(上海源培生物技术有限公司，批号：F40403，K40410，E40401)；MTT，DMSO(Sigma公司，批号：SP1080，SHBH2446V)；细胞裂解液(Biosharp公司，批号：6503595)；细胞周期与凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司，批号：C1052)；Cyclin B1、CDK1、P53、P21抗体(Abcam公司，批号：GR53191-17，GR304868-3，GR233949-10，GR197547-19)；p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT抗体(CST公司，批号：4257，4228，9611，4691)；蛋白预染Marker，BCA蛋白定量试剂盒，ECL检测试剂盒(Thermo公司，批号：00461035，PB200138，QF218484)。

1.2 主要仪器

全自动细胞计数器(Countstar公司)；FA1104电子分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；SL16型低速离心机、HERAcell 150i型二氧化碳培养箱、Multiskan FC型酶标仪(Thermo公司)；Ti型倒置荧光显微镜(日本尼康公司)；Direct-Q超纯水系统(MilliPORE公司)；-80 ℃冰箱(日本SANYO公司)；SW-CJ-2FD型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；PowerPacTMBasic型电泳仪(Bio-Rad公司)；TS-317型3D脱色摇床(中国其林贝尔仪器制造有限公司)；BD FACSCalibur流式细胞仪(BD公司)；Tanon-5500型化学发光凝胶成像仪器(天能科技有限公司)。

1.3 细胞株

MDA-MB-231乳腺癌细胞，购于中国科学院上海生科院细胞资源中心。

（4）预计算。在新一代的PoS共识机制中，挖矿公式可简写为H(H(Bprev),A,t)≤balance(A)m。由于新块的挖矿只与时间、余额以及上一块的哈希值有关，因此控制当前块的生成可以帮助攻击者得到新块的挖矿权。在某一节点拥有一定数量代币以及算力足够的情况下，该节点可以通过随机试错方式控制第N块的哈希值使得攻击者有能力对N+1块进行挖矿。

2 方法

2.1 细胞培养

内源融资指企业依靠自有资金和留存收益进行融资，内源融资约束与企业自身现金流量有关。因此本文采用了现金占总资产比例 （Cash Ratio），即货币资金与交易性金融资产占总资产的比例，用于反映流动性程度。同时，本文还采用了现金流量比率 （Cash Coverage Ratio），即经营活动现金流量与流动负债的比值，用于反映公司短期偿债能力。

人乳腺癌细胞MDA-MB-231培养于含10%FBS，100 U/mL青链霉素的DMEM高糖培养基中，置于37 ℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内，倒置显微镜观察生长情况。细胞融合度约90%时用胰蛋白酶消化传代或种板，取对数生长期的细胞用于实验。

2.2 细胞形态观察

结果见图2。

2.3 MTT法检测细胞增殖抑制率

取对数生长期的细胞，PBS漂洗，胰蛋白酶消化后终止消化并离心，培养基重悬，细胞计数后以1×105mL-1接种于96孔板，每孔100 μL，设5复孔。24 h细胞贴壁后加入0.187 5、0.375、0.75、1.5 mg/mL的消癌解毒方提取物处理细胞48 h，设溶剂组作为对照。药物处理后，各孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL，孵育箱孵育4 h后弃上清，每孔加DMSO 150 μL，振荡15 min充分溶解，酶标仪570 nm处测定吸光度，计算细胞增殖抑制率(%)=[(OD对照组-OD给药组)/OD对照组]×100%。

取对数生长期的细胞，培养于细胞培养瓶内。0.375、0.75、1.5 mg/mL的消癌解毒方提取物处理48 h后收集细胞提取蛋白质，设溶剂组作为对照，BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，加上样缓冲液98 ℃ 10 min变性。蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，80 V 30 min，120 V至溴酚蓝跑出分离胶。300 mA 1 h湿转转膜，5%脱脂牛奶常温封闭1 h。按说明书比例稀释一抗结合膜上蛋白，4 ℃过夜。PBST洗膜后二抗1∶10 000室温孵育1 h，ECL试剂盒发光显色，image J进行条带分析。

2.4 细胞周期分析

取对数生长期的细胞，培养于12孔板内。0.375、0.75、1.5 mg/mL的消癌解毒方提取物处理细胞48 h后，设溶剂组作为对照，胰酶消化收集并洗涤细胞后加入70%乙醇500 μL固定，4 ℃过夜。PBS洗去乙醇后加入100 μL核糖核酸酶A，37 ℃水浴30 min。再加入400 μL Pi染液混匀，冰上避光染色30 min。流式细胞仪检测细胞周期，modfit进行分析。

2.5 Western blot检测蛋白表达

急性胃穿孔患者病情进展迅速,必须及时采取手术治疗手段缓解患者临床症状。急性胃穿孔患者常会出现呕吐、持续性腹痛或者恶心等临床症状,院方需要快速确诊并将病灶根除掉,避免疾病继续恶化危及到患者生命健康安全。虽然手术治疗是常用急性胃穿孔治疗手段,但如何选择手术方法依然没有统一论证。

2.6 统计学方法

试验数据均以表示，用SPSS17.0统计学软件进行统计。组间比较采用方差分析和t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 消癌解毒方对MDA-MB-231乳腺癌细胞形态的影响

与对照组相比，消癌解毒方浓度达到0.375 mg/mL和0.75 mg/mL时可以使MDA-MB-231细胞数量减少，排列疏松，细胞体积变小，形态变圆，出现细胞膜破损，细胞皱缩并脱落，消癌解毒方1.5 mg/mL组出现部分细胞碎片漂浮。见图1。

3.2 消癌解毒方对MDA-MB-231细胞增殖抑制率的影响

乳腺癌是中国30～59岁女性诊断出的最普遍的癌症，也是45岁以下中国女性导致死亡的主要疾病之一，近年来在中国的发病率与死亡率不断上升，严重威胁女性健康[1]。中医药治疗可以应用于乳腺癌发展的各个阶段，毒副作用小，可以提高病人生活质量，延长生存期[10]。消癌解毒方临床上干预乳腺癌取得了良好的治疗效果，是恶性肿瘤患者安全、有效的治疗用药[11]。本研究通过体外抑制乳腺癌细胞的增殖实验，探讨了其抗乳腺癌可能的机制。

  

图1 消癌解毒方处理48 h对MDA-MB-231乳腺癌细胞形态的影响(×200)

 

表1 XAJDF处理24、48 h对MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖抑制率的影响

  

时间/h浓度/(mg·mL-1)OD560nm抑制率/%对照组24-0．44±0．088-XAJDF0．18750．43±0．0421．570．3750．40±0．0558．370．750．35±0．056∗18．851．50．29±0．052∗34．02对照组48-0．43±0．064-XAJDF0．18750．36±0．07415．480．3750．35±0．048∗19．770．750．27±0．075∗37．991．50．21±0．062∗∗50．89

注：与对照组比较，*P<0.05,**P<0.01。

3.3 消癌解毒方对MDA-MB-231细胞周期的影响

取对数生长期细胞，PBS漂洗，胰蛋白酶消化后终止消化并离心，培养基重悬，以合适的密度接种于培养皿中。24 h细胞贴壁后加入终浓度分别为0.375、0.75、1.5 mg/mL的消癌解毒方提取物处理细胞48 h，设溶剂组作为对照，倒置显微镜观察细胞形态。

 

  

注：与对照组比较，图2 XAJDF处理48 h对MDA-MB-231细胞周期分布的影响

与对照组相比，MDA-MB-231细胞经0.375、0.75、1.5 mg/mL消癌解毒方给药48 h后，Cyclin B1、CDK1表达水平降低，P53、P21蛋白表达水平升高，p-PI3K、p-AKT相对PI3K、AKT表达降低，具有浓度依赖性，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)，见图3。

3.4 消癌解毒方对MDA-MB-231细胞PI3K/AKT信号通路相关蛋白的影响

与对照组相比，消癌解毒方0.375、0.75、1.5 mg/mL给药48 h可以导致MDA-MB-231细胞周期异常，G0/G1期细胞比例减少，G2/M期细胞比例增加，呈浓度依赖性。在消癌解毒方浓度达到0.75 mg/mL和1.5 mg/mL时，能明显将细胞周期阻滞于G2/S期，具有显著性差异(P<0.05～0.01)。

 

 

 

 

 

 

注：与对照组比较，图3 XAJDF处理48 h对MDA-MB-231 PI3K/AKT信号通路的影响

4 讨论

与对照组相比，消癌解毒可提高MDA-MB-231细胞的增殖抑制率，呈浓度和时间依赖性，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)，见表1。

研究结果发现，随着给药浓度的增加，消癌解毒方干预MDA-MB-231细胞后显著增加了细胞的增殖抑制率，这可能与其调控细胞周期有关。在肿瘤发生发展中，细胞周期的调控意义重大。真核细胞的细胞周期包括G1、S、G2以及有丝分裂M期，G2/M周期检查点可以阻止DNA损伤的细胞进入分裂期。细胞周期蛋白(Cyclins)是调控细胞周期的主要成分，周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)与细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)形成复合物共同影响G2/M期周期检查点调控细胞的增殖。Cyclin B1作为G2/M期的周期蛋白，在肿瘤细胞中常发现其异常表达，Cyclin B1在癌细胞中过表达，可能与激酶CDC2形成复合物，启动有丝分裂，越过细胞周期检查点，导致失控性的细胞增殖有关[12]。本研究中，流式细胞术与Western blot实验结果显示消癌解毒方可以显著下调Cyclin B1、CDK1的表达，同时具有浓度依赖性，细胞周期阻滞在G2/M期，无法进入分裂期因而使增殖减缓。

在六大中心的资源支持下，结合机械系机械工程和测试计量技术及仪器两个专业的特点和需求，如图1所示促进校企合作的煤矿机械虚拟仿真实验平台共设置了五个功能模块：机械认知类实验模块、机械拆装类试验模块、矿山设备故障诊断实验模块、仪器仪表设计实验模块和监测监控实验模块，可以覆盖本科生一年级至四年级共二十多门主修课程的实验。

ELópez-Knowles等人研究发现PI3K/AKT信号通路在乳腺癌中活化存在高表达[13]，是调节乳腺癌存活、生长与增殖的最主要的通路之一，该信号通路对p53、p21的表达都有着关键的调控作用[14]。p53在肿瘤形成发展中的作用是肿瘤研究的热点，是目前细胞内重要的的抑癌基因[15]。p53可以介导下游靶分子Cyclin B1，从细胞周期上影响肿瘤发生发展[16]。p53另一个下游基因p21的表达产物是一个具有激酶抑制活性的细胞周期抑制蛋白，参与G2/M期的调控[17]，研究表明p21的激活可以抑制细胞周期调控蛋白家族的表达而诱导其细胞周期阻滞[18]。Western blot实验显示消癌解毒方可以降低PI3K/AKT的磷酸化水平，上调p53和p21的表达，可能通过此途径调控Cyclin B1、CDK1蛋白的表达，阻滞肿瘤细胞周期，影响癌细胞生长增殖。

一是在缔结合同时认为权利受到侵害的救济方式。在缔结合同时利害关系人认为行政机关未按规定通过招标、拍卖等公平竞争的方式作出许可决定或者违反法定程序损害其合法权益的，利害关系人可以申请行政复议或提起行政诉讼。

消癌解毒方体外的抗肿瘤活性显著，机制明确，而整方对于整体的效应机制是否与体外细胞实验一致，仍需继续关注。只有全方位、多角度地挖掘名老中医药方的疗效及机制，才可以更好的开发中医药抗肿瘤的前景。

现阶段，高等教育改革过于侧重需求方面，很多高等院校盲目扩大招生规模，不断细化学科门类，这种一味拓展教学单位、增加专业学科的现象，造成高等教育的改革与发展始终停滞在表面，而相对忽略内部系统建设。近些年来，我国高等教育的评价体系始终以科研为核心，很多高等院校通过各种专业论著、专业课题等多种方式不断获得各种教育资源和社会名誉，但高等院校的教育教学活动的根本目的也就是高等教育的基本核心却是人才培养的质量，这导致高等院校的人才培养核心发生巨大偏移。

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