厌食症(Anorexia)的主要表现是少食和对正常饮食厌烦。本病的发生不分性别和年龄，但以儿童、青少年及年轻女性为多见，尤以城市人群为常见[1]。本病迁延日久，可因营养不良而累及代谢，进而影响全身，导致生长迟缓、免疫力下降、心动过缓、直立性低血压、情感与睡眠障碍等。

厌食症基本病机可归纳为脾运不健，胃纳不开。基于这种理论，我们研制了复方制剂运脾开胃方(前名为儿宝颗粒)。课题组前期研究结果表明，运脾开胃方可以调节胃肠激素水平、提高胃肠动力、促进消化腺分泌，减轻胃底黏膜及组织损害，从而达到治疗厌食症的目的[2-3]。此外，我们还发现经运脾开胃方含药血清处理后，胃窦平滑肌细胞内胃肠激素Ghrelin及其受体(Growth hormone secretagogue receptor,GHSR)的mRNA表达增加[4]，提示胃窦平滑肌细胞上的Ghrelin信号通路可能是运脾开胃方调节胃肠运动、改善胃肠功能，进而治疗厌食症的分子生物学机理之一。目前，Ghrelin和GHSR被视为很多疾病的潜在治疗靶点，如功能性消化不良、严重的营养不良及一些年龄相关性退化性疾病，同样也包括厌食症[5-8]。

2014-2016年，DDDs排序前10位的口服中成药年度DDDs分别占口服中成药总DDDs的99.95%、99.94%和99.83%，有9种中成药的年度DDDs均排序前9位，7种中成药的DDDs排序无变化。2014-2016年DDDs排序前10位的口服中成药见表3。

为了进一步探讨运脾开胃方治疗厌食症的机制，我们继续选用人胃窦平滑肌细胞(Human gastric smooth muscle cells，HGSMCs)，深入研究运脾开胃方对GHSR下游信号分子Ca2+、肌球蛋白轻链(Myosin light chain，MLC)及其磷酸化水平(p-MLC)的影响，以明确运脾开胃方与Ghrelin信号通路的关系。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠40只，鼠龄1月，雌雄各半。购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001。饲养于南京中医药大学实验动物中心清洁级动物实验室，饲以普通级颗粒饲料，自由饮水。

1.2 实验药物

分别用低、中、高浓度含药血清和空白血清刺激HGSMCs 5、10、15、20 min。根据实验需要，提前用(D-Lys3)-GHRP-6阻断GHSR；用D-HBSS(无Ca2+ HBSS液，pH7.2～7.4)液稀释运脾开胃方含药血清；用Thapsigargin消耗细胞基质网内的Ca2+。刺激完成后，用预冷的PBS清洗细胞3遍，加入含有1%PMSF和磷酸酶抑制剂的裂解液。随后离心吸取上清，经考马斯亮蓝法定量配平后变性。配制12%SDS-PAGE，采用半干法转膜；然后用3%BSA封闭2 h。用3%BSA稀释的一抗(p-MLC、MLC 1∶2 000、GAPDH 1∶1 000)4 ℃孵育过夜；TBS-T清洗3次后用3%BSA稀释的二抗(p-MLC、MLC 1∶10 000，GAPDH 1∶5 000)室温孵育2 h；曝光前p-MLC、MLC需要用TBS-T清洗7次，TBS清洗1次。最后将PVDF膜置入ECL发光液中曝光显影。

1.3 主要实验器材和试剂

由图2～3可知，和空白组相比，运脾开胃方含药血清各剂量组能在10 min时间段内显著上调HGSMCs内p-MLC水平(P<0.05～0.01)且具有量效依赖关系。在15 min时间段，p-MLC表达水平虽然也有明显的上升趋势和量效依赖关系，但只有高剂量组体现出显著性差异(P<0.01)。

2 方法

2.1 细胞培养

恩哥解答：没必要。孕期无论是主动还是被动吃很多，除了让你变胖，还会增加巨大儿的风险，最终导致难产。所以，孕期饮食要适量，保持营养均衡，补充适量的叶酸。

2.2 含药血清制备

40只SD大鼠适应性饲养2 d后随机等分成高、中、低剂量组和空白血清组，共4组。大鼠灌胃剂量按60 kg成人体质量换算给药，其中低剂量为临床等效剂量，中、高剂量组分别为低剂量组的5倍和10倍。低、中、高剂量组灌胃体积相等，空白组给予等体积的纯净水给药。连续灌胃3 d，每日2次，间隔12 h。实验前禁食12 h，次日灌胃1 h后，予以麻醉颈动脉采血。血液经室温静置后离心，取上层血清灭活30 min后分装保存。根据前期实验结果，将含药血清稀释10倍后用于细胞实验[4]。

2.3 激光共聚焦测定HGSMCs内钙释放

权力是指人们所拥有的能力。这种能力不仅表现为一种客观存在，且表现为人们的一种主观感受，亦即权力感，这种权力感可以增进人们的自我概念、自尊、尊严感、福祉感及重要感；无权是指人们缺乏能力或资源，亦指人们会通过内化过程，形成一种无权感，这种无权感使得人们指责贬低自己，进而陷入无权的恶性循环（陈树强，2003）。

2.4 Western blot法检测HGSMCs内p-MLC水平

运脾开胃方由炒苍术、陈皮、焦山楂、炙鸡内金按5∶4∶5∶4组成。炒苍术(内蒙古，批号：141202)、陈皮(浙江，批号：20140201)、焦山楂(河北，批号：20140601)、炙鸡内金(安徽，批号：140909)均购自南京中医药大学百草堂中医门诊部。以上药材加双蒸水1 000 mL煎煮2次，煎煮液经纱布过滤后合并，再经旋转蒸发仪分别定容至1、5、10 g/mL保存于4 ℃冰箱。

赣南灯彩文化具有浓厚的地域气息，在发展过程中，既存在独特的优势，同时又存在难以被认可的劣势。因此，应对赣南灯彩歌舞的市场需求进行分析，准确了解消费者的需求方向和需求量，基于此进行旅游项目开发定位，包括产品的开发、旅游门票的定价等。在发展中，赣南灯彩歌舞项目要与区域经济发展向吻合，实现产品的创新，寻找和开发具有明显特色的、市场化操作性强的旅游产品，实现灯彩歌舞与现代歌舞或其他形式艺术之间的结合，实现其现代化过程，促进其发展。

2.5 统计学方法

在运脾开胃方含药血清刺激下，5 s后HGSMCs F1/F0(%)开始出现上升(图1)。和空白组相比，中、高剂量组在10～40 s时间段内F1/F0(%)显著上升(P<0.01)，在40～45 s内也具有统计学差异(P<0.05)。和空白组相比，低剂量组F1/F0(%)在20 s后开始出现显著统计学差异(P<0.01)，持续20 s后开始逐渐无统计学差异。

HGSMCs培养于玻璃细胞爬片上，用Fluo-3(2.5 μmol/L)孵育30 min置于共聚焦显微镜的载物台上，用HBSS(CaCl2 140 mg/L，MgCl2·6H2O 100 mg/L，MgSO4·7H2O 100 mg/L，KCl 400 mg/L，KH2PO4 60 mg/L，NaHCO3 350 mg/L，NaCl 8 000 mg/L，Na2HPO4 48 mg/L，D-Glucose 1 000 mg/L，pH7.2～7.4)清洗细胞3次，清除细胞表面残留的荧光探针。共聚焦显微镜扫描采样速率为2 ms/线，每5 s扫描1次荧光强度。根据参考文献，记录时间从刺激细胞前20 s开始，直至荧光强度无变化[9]。瞬时钙离子浓度用相对荧光强度F1/F0(%)表示，其中F1表示瞬时荧光强度，F0表示0 s时的荧光强度[10-11]。

3 结果

3.1 运脾开胃方含药血清对HGSMCs中Ca2+水平的影响

所有实验数据均以表示；两组间对比采用配对t检验，多组间对比采用单因素方差分析；用SPSS19.0软件进行统计处理，以P<0.05为差异有统计学意义。

南通纺织企业除了要做好技术升级和产品质控，市场营销是其生存发展的生存命脉。南通鹏越纺织有限公司成立于2004年，是南通纺织企业的中小型企业代表。本文以南通鹏越纺织有限公司为研究对象，通过新时期新形势下该公司产品营销、价格影响等营销现状的客观研究，深入探究其营销策略方面存在的问题。并针对这些现实存在的问题，结合营销相关理论基础，从产品优化、定价优化、渠道优化和促销优化等四个方面，提出一系列建议措施，通过以小见大的方式，力求为新时期南通中小型纺织企业的营销和稳定健康发展，尽献绵薄之力。

HGSMCs(#2810，Sciencell，美国)根据说明书要求复苏后培养于用多聚赖氨酸包被过的细胞瓶内，用配套培养基培养，选择活性较佳的第3～10代细胞作为实验细胞。细胞用于实验前需先置于无血清培养液中饥饿6 h以上。

  

注：和空白组相比，

 

图1 运脾开胃方含药血清对HGSMC内Ca2+水平的影响

3.2 运脾开胃方含药血清对HGSMCs中p-MLC水平的干预作用

Zeiss LSM 710倒置共聚焦显微镜(卡尔蔡司，德国)；钙离子(Fluo-3 AM)荧光探针(同仁，日本)；毒胡萝卜素Thapsigargin(Sigma-Aldrich，美国)；GHSR拮抗剂(D-Lys3)-GHRP-6(巴亨，瑞士)；p-MLC抗体、MLC抗体、细胞裂解液RIPA(×10)、蛋白酶抑制剂(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)(Cell Signaling Technology，美国)；磷酸酶抑制剂(罗氏，瑞士)；多聚赖氨酸(Poly-L-lysine，PLL)(Sciencell，美国)。

  

注：a.空白组；b.低剂量组；c.中剂量组；d.高剂量组

 

图2 运脾开胃方含药血清对HGSMC内MLC、p-MLC水平的影响

  

注：A.5 min；B.10 min；C.15 min；D.20 min。与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。

 

图3 p-MLC灰度值相对强度统计结果

3.3 运脾开胃方含药血清对HGSMCs中p-MLC水平的干预机制

如图4所示，和运脾开胃方含药血清组相比，(D-Lys3)-GHRP-6能显著抑制运脾开胃方含药血清对p-MLC的上调作用(P<0.01)。同时，Thapsigargin和用D-HBSS培养液稀释的运脾开胃方含药血清也能显著抑制运脾开胃方含药血清对p-MLC的上调作用(P<0.01)。提示运脾开胃方含药血清是通过GHSR和细胞内外Ca2+来上调p-MLC水平的。

4 讨论

Ghrelin由28个氨基酸残基组成，其受体GHSR则广泛表达于全消化道平滑肌和下丘脑中[12-13]，具有促进胃Ⅲ相运动、促进食物摄入的作用[14-15]。MLC是调节胃肠道、血管、子宫平滑肌收缩的重要蛋白，MLC在Ser19位点的磷酸化是引起平滑肌收缩的关键环节[16-17]，并且受游离Ca2+浓度的调控[18]。有研究表明，Ghrelin及GHSR激动剂可以显著上调某些表面有GHSR分布的细胞内Ca2+水平[5,10]，因此我们在之前的研究基础之上进一步研究运脾开胃方含药血清和Ghrelin、GHSR以及HGSMCs内Ca2+、p-MLC的关系。

  

注：A.MLC、p-MLC蛋白表达水平；B.p-MLC灰度值相对强度。与其他各组比较，

 

图4 GHSR、Ca2+在运脾开胃方含药血清对p-MLC调节机制中的作用

本次研究不仅发现运脾开胃方含药血清可以显著上调HGSMCs内Ca2+和p-MLC水平，并且在一定时间内体现出较为明显的量效依赖关系，同时我们还发现抑制GHSR、干扰细胞内外Ca2+均能够显著影响运脾开胃方含药血清上调p-MLC的能力。由此可见，GHSR和细胞内外Ca2+水平在运脾开胃方含药血清调节p-MLC的机制中具有重要意义。在本次研究中，我们没有针对GHSR和Ca2+的关系进行详细研究，不过一些文献报道显示，GHSR拮抗剂(包括(D-Lys3)-GHRP-6)可以显著抑制GHSR激活所引起的Ca2+内流[5,10,19]。综上所述，运脾开胃方含药血清很可能主要是通过激活GHSR引起细胞内Ca2+水平升高来上调p-MLC水平的。由于含药血清成分复杂，我们仍然不能排除运脾开胃方含药血清通过其他信号通路影响p-MLC水平的可能，所以在图2、3A、3D中p-MLC水平出现了一些不符合量效和时效依赖关系的变化。

江育仁教授指出：“欲使脾健，则不在补而贵在运也”。运脾开胃方由炒苍术、陈皮、焦山楂、炙鸡内金组成。其中苍术和陈皮功能理气健脾、醒脾助运，化痰消积除胀；鸡内金和山楂功能消食化积助运，开胃促进食欲。诸药合用，调和脾胃，扶助运化，开胃进食。厌食症的发生与胃肠肽功能紊乱有关，紊乱的胃肠肽会引起胃肠运动障碍和食欲中枢异常[20-21]，因此调节胃肠肽的分泌可以作为治疗厌食症的关键靶点。在已知的众多胃肠肽中，Ghrelin是唯一一个既能促进胃肠运动，又能调节食欲中枢刺激进食功能的胃肠肽[22]，这与我们通过“运脾开胃”来治疗厌食症的思路不谋而合。在之前的研究中，我们发现运脾开胃方含药血清可以上调胃窦平滑肌细胞内Ghrelin及GHSR的mRNA水平，而本次研究显示运脾开胃方含药血清可以经由GHSR上调胃窦平滑肌细胞内的p-MLC水平，所以Ghrelin及GHSR很有可能是运脾开胃方治疗厌食症的核心靶点。

我们目前仍然存在一些问题需要进行深入的研究。首先，我们的研究只是证明了运脾开胃方含药血清可以通过GHSR上调p-MLC水平，无法明确运脾开胃方含药血清究竟是通过上调Ghrelin水平还是激动GHSR来影响Ghrelin信号通路的。其次，目前的研究只涉及到运脾开胃方在调节胃肠运动方面作用，只是初步揭示了“运脾”的内涵，对于运脾开胃方在调节食欲中枢方面的作用的研究尚未涉及，对于“开胃”内涵的研究也尚未展开。因此，在下一阶段的实验研究中，我们需要针对以上问题进行更加深入的研究。

参考文献:

[1] 汪春运.神经性厌食的内科并发症[J].中国民政医学杂志,2001,13(2):103-105.

[2] 杜永平,张月萍,汪受传,等.儿宝颗粒对小儿厌食症动物模型下丘脑CCK-8和-EP的调节作用[J].安徽中医药大学学报,2000,19(1):39-41.

[3] 赵智强,项小人,汪受传,等.儿宝颗粒对厌食症大鼠模型血中5-HT、NO及空肠段SP、VIP、SS表达的影响[J].中国中西医结合消化杂志,2006,14(2):96-98.

[4] 汪元平.运脾开胃法对VIP、MTL、Ghrelin信号通路的影响[D].南京：南京中医药大学,2011.

[5] FUJITSUKA N, ASAKAWA A, UEZONO Y, et al. Potentiation of ghrelin signaling attenuates cancer anorexia-cachexia and prolongs survival[J].Transl Psychiatry. 2011,1:e23.

[6] SAEGUSA Y, HATTORI T, NAHATA M, et al. A New Strategy Using Rikkunshito to Treat Anorexia and Gastrointestinal Dysfunction[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2015,2015: 364260.

[7] FUJITSUKA N, ASAKAWA A, MORINAGA A, et al. Increased ghrelin signaling prolongs survival in mouse models of human aging through activation of sirtuin1[J]. Mol Psychiatry,2016,21(11):1613-1623.

[8] SU J, GENG J, BAO J, et al. Two ghrelin receptor agonists for adults with malnutrition: a systematic review and meta-analysis[J]. Nutr J,2016,15(1):97.

[9] 王伟, 李莎, 张梦丹,等. liguzinediol基于肌浆网钙泵促进钙释放发挥正性肌力作用[J]. 中国药理学与毒理学杂志, 2016, 30(3):197-202.

[10] JANG Y, KIM S, OH J, et al. Ghrelin receptor is activated by naringin and naringenin, constituents of a prokinetic agent Poncirus fructus[J]. J Ethnopharmacol,2013,148(2):459-465.

[11] PARK JY, SHIN HK, CHOI YW, et al. Gomisin A induces Ca2+-dependent activation of eNOS in human coronary artery endothelial cells[J]. J Ethnopharmacol,2009,125(2):291-296.

[12] KOJIMA M, HOSODA H, DATE Y, et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach[J]. Nature,1999,402(6762):656-660.

[13] ZHENG J, ARIGA H, TANIGUCHI H, et al. Ghrelin regulates gastric phase III-like contractions in freely moving conscious mice[J]. Neurogastroenterol Motil,2009,21(1):78-84.

[14] WREN AM, SEAL LJ, COHEN MA, et al. Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans[J]. J Clin Endocrinol Metab,2001,86(12):5992.

[15] NAKAZATO M, MURAKAMI N, DATE Y, et al. A role for ghrelin in the central regulation of feeding[J]. Nature,2001,409(6817):194-198.

[16] GORECKA A, AKSOY MO, HARTSHORNE DJ. The effect of phosphorylation of gizzard myosin on actin activation[J]. Biochem Biophys Res Commun,1976,71(1):325-331.

[17] ARNER A, PFITZER G. Regulation of cross-bridge cycling by Ca2+ in smooth muscle[J]. Rev Physiol Biochem Pharmacol,1999,134:63-146.

[18] KAMM KE, STULL JT. The function of myosin and myosin light chain kinase phosphorylation in smooth muscle[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol,1985,25:593-620.

[19] DIXIT VD, SCHAFFER EM, PYLE RS, et al. Ghrelin inhibits leptin- and activation-induced proinflammatory cytokine expression by human monocytes and T cells[J]. J Clin Invest,2004,114(1):57-66.

[20] 陈珏, 陈兴时, 楼翡璎,等. 神经性厌食患者事件相关电位CNV的研究[J]. 临床精神医学杂志, 2011, 21(6):378-380.

[21] INUI A. Cancer anorexia-cachexia syndrome: current issues in research and management[J]. CA Cancer J Clin,2002,52(2):72-91.

[22] CHAUDHRI O, SMALL C, BLOOM S. Gastrointestinal hormones regulating appetite[J]. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2006,361(1471): 1187-1209.