鉴别种质并保护育种者的知识产权是市场经济发展的需要。随着分子生物学的迅猛发展，利用DNA指纹技术构建作物品种的DNA指纹库，正越来越多地应用于品种纯度及真伪鉴定、种质资源遗传多样性分析、新品种DUS测试、区试品种监控和侵权案司法鉴定等相关工作[1-6]。

ISSR是英文Inter Simple Sequence Repeat的缩写，意为重复简单序列标记，是一种多态性较丰富、稳定性较高、试验成本低、操作简单的分子标记技术，在植物遗传多样性、遗传作图、基因定位、品种鉴定及分子生态学研究中被广泛地应用[7-10]。

本研究通过Excel 2003进行试验数据汇总处理，采用DPS 7.05进行显著性差异分析（p＜0.05）及origin 8.0软件对实验数据进行作图分析。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本试验供试材料为呼和浩特市合创农业科技研究中心提供的马铃薯新品系HC-R。

1.2 DNA提取与检测

剪取马铃薯新品系HC-R的脱毒组培苗1.5 g，用购自北京天根生化科技有限公司的植物基因组试剂盒提取其DNA，琼脂糖凝胶（1%）电泳检测纯度，紫外可见分光光度计（日立U－2800）测定供试DNA的浓度后，将DNA浓度稀释至50 ng/μL，保存于－20℃冰箱中备用。

1.3 ISSR反应体系

扩增反应的总体积为25 μL，扩增反应总体积为25 μL：10×Buffer（不含Mg2+）1.5 μL（50 μmol/L），dNTP 2.5 μL（2.5 mmol/μL），Mg2+2.5 μl（25 mmol/μL），TaqDNA聚合酶0.5μL（5U/μL），引物2.0μl（50μmol/L），模板 DNA 1.0 μL（50 ng/μL），ddH2O 15 μL[11-12]。

94℃预变性 4 min；94℃变性 30 s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，循环45次；72℃延伸10 min[11-12]。反应结束后，将扩增产物迅速取出置于冰上，放于－20℃冰箱中保存备用。

1.4 PCR扩增程序

班会结束的当天晚上，小李在QQ里给我留言：“尊敬的丁老师，今天您的检讨让我看到了一个男人的担当，是您的这种担当精神鼓舞了我，勇敢地走出了这一步。请您相信，接下来的日子里，我会以一个男人的担当来要求自己，请您给我机会……”

对于土地的开发管理等工作涉及多个部门的多项工作内容，因此包括财政部门、林业部门以及农业部门等均应当严格秉持各自职能，积极参与土地的管理开发中，集中政府资源与力量，利用法律、经济以及行政等手段，为当地谋取更多福利，提高当地社会综合效益。

［4］段艳凤，刘杰，卞春松，等.中国88个马铃薯审定品种SSR指纹图谱构建与遗传多样性分析［J］.作物学报，2009，35（8）：1451-1457.

1.5 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测

取7 μL扩增产物，进行琼脂糖凝胶（1.5%）电泳检测，电压设置50 V，电泳时间2 h。核酸染料染色显影，照相。

1.6 引物及序列

本试验使用的引物为已开发公布的12个AW系列和2个AF系列引物[11-12]，委托上海生物工程公司合成（表1）。

表1 分析用引物及其碱基序列

注：引物和接头由上海生工生物有限公司合成。

引物AW62413 AW62416 AW62404 AW67770 AW67771 AW67772 AW67774 AW67775 AW67776 AW67763 AW81396 AW81407 AF18546 AF18548序列5'-GAGAGAGAGAGAGAGAAC-3'5'-TCTCTCTCTCTCTCTCA-3'5'-GAGAGAGAGAGAGAGAT-3'5'-ACACACACACACACACC-3'5'-AGAGAGAGAGAGAGAGCTA-3'5'-GAGAGAGAGAGAGAGACTT-3'5'-CTCTCTCTCTCTCTCTAGC-3'5'-CTCTCTCTCTCTCTCTAGG-3'5'-ACACACACACACACACCTT-3'5'-CTCTCTCTCTCTCTCTT-3'5'-GACGACGACGACGAC-3'5'-BDBCACACACACACA-3'5'-CACACACACACACACAG-3'5'-GAGAGAGAGAGAGAGAC-3'

2 结果与分析

2.1 DNA的质量检测

［1］张彦，郭士伟，何冰，等.利用SSR标记建立杂交水稻分子指纹图谱数据库［J］.江苏农业学报，2006，22（2）：181-183.

图1 马铃薯新品系HC-R基因组DNA的电泳检测结果

2.2 马铃薯新品系HC-R的ISSR多态性及指纹特征

利用14个ISSR适宜引物对马铃薯新品系HC-R的基因组DNA进行PCR扩增结果见表2和图2。14个引物在200～2 000 bp共扩增出80个多态性条带，平均每个引物扩增出5.7个。其中，引物AW62413和AW81407对马铃薯新品系HC-R的扩增产物最多，均扩增出10条多态性条带；引物AW67763在马铃薯新品系HC-R中的扩增产物最少，仅扩增出1条多态性条带。14个ISSR适宜引物对马铃薯新品系HC-R的PCR扩增多态性条带百分率为100%，表明这14个引物在新品系HC-R中扩增的ISSR多态性很丰富。

表2 14个ISSR引物在马铃薯新品系HC-R中的扩增结果

引物AW62413 AW62416 AW67770 AW67771 AW67772 AW67774 AW67775 AW67776 AW62404 AW67763 AW81396 AW81407 AF18546 AF18548合计扩增条带数10多态性条带数10 4 6 9 4 7 2 4 3 1 9 1 0 8 3 8 0 0 8 3 8 0 4 6 9 4 7 2 4 3 1 9 1多态性条带百分率/%100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

参考文献：

由于ISSR引物在马铃薯新品系HC-R中扩增检测到的每个位点代表一个等位基因，将每个ISSR引物扩增检测的位点转化为数字代号，可以得到14个数字代号（表2），将这些数字代号从左至右依次排列起来，就得到一条14位字符串A4694724319A83（为减少歧义，双位数以英文字母计数，即10个等位位点计作A，11计作B，以此类推），这条字符串可以唯一识别马铃薯新品系HC-R，因此，可以将这条字符串形象地称作马铃薯新品系HC-R的14位ISSR分子身份证[13]。马铃薯新品系HC-R的分子身份证号码为A4694724319A83，这可为马铃薯新品系HC-R的鉴定和知识产权保护提供重要的DNA分子依据。

图2 马铃薯新品系HC-R的DNA指纹图

注：1～14为14个引物的扩增结果，M为Marker。

3 讨论与结论

随着分子生物学的快速发展和分子标记在作物育种中的广泛应用，作物育种走进了新的时代，新品种（系）如雨后春笋般大量涌现，这就对鉴别种质和保护育种者的知识产权提出了新的更高要求。利用分子标记构建的DNA指纹图谱能快捷、简便、准确地区分种质资源，显著缩短种质鉴别的时间。但是，由于DNA指纹图是由条带数量和条带片段大小传递遗传信息，其直观表述存在一定的局限。将DNA指纹图谱中反映的遗传信息合理数字化，可以简化DNA指纹图谱的识别，为准确辨别种质资源提供了更为简化的视觉。

本试验利用筛选的14个ISSR适宜引物对马铃薯新品系HC-R进行了PCR扩增，在200～2 000 bp共扩增出了80个多态性条带，平均每个引物扩增出了5.7个，多态性条带比率为100%，基于14个ISSR适宜引物扩增结果，构建出了马铃薯新品系HC-R的ISSR指纹图，进而获得新品系的14位分子身份证号码（A4694724319A83），为下一步新品种育成登记和知识产权保护利用提供了分子依据。

本试验以马铃薯新品系HC-R基因组DNA为材料，用试验筛选得到的14个ISSR适宜引物进行PCR扩增，以建立马铃薯新品系HC-R的DNA指纹图，为新品种的育成登记和知识产权的保护利用提供依据。

Research on land transportation network space-time pattern in Anhui Province

另外，用14个引物扩增新品系HC-R指纹图均存在明显差异（图2），这是该马铃薯新品系在DNA水平上识别的重要特征。

由图1可见，用植物基因组试剂盒提取的马铃薯新品系HC-R基因组DNA电泳检测图条带清晰、均匀、无拖尾现象，说明试验提取的DNA纯度较高，完全能够满足ISSR-PCR扩增试验的要求。

［2］李晓宇，于卓，马艳红，等.高丹草新品系的SSR分析［J］.中国草地学报，2011，33（2）：62-66.

在学生毕业离校前夕，面向我院所有2014届毕业生进行问卷调查。共发放问卷1 594份，回收有效问卷1 296份，有效回收率为81.30%。其中护理专业毕业生问卷829份，非护理专业（药学、康复治疗技术、医学影像技术、卫生信息管理、医学营养等）毕业生467份。

我们探索一种基础理论，不光是为了解释一此现象，更重要是运用基础理论去指导开创有益的事业。当我发现了“植物体内同化物具有向库性，这种特性与库信号相关联，库信号的强弱决定同化物移动到库的量的大小”这个原理后，就用这个理论为指导创作了“笔下沙漠见春”的盆景，如图，

［3］石景，宋波涛，金开建，等.SSR标记的彩色马铃薯遗传多样性分析及指纹图谱构建［J］.农业生物技术学报，2012，20（4）：362-371.

全部都是特色，就是没有特色。乌村处于这样一个江南水乡，以及在乌镇这一品牌打响之后，还是守着江南水乡的传统特色，无法跳出这个圈子，无法从中脱颖而出。其实乌村住宿的组团定位就很不错，可以选取一些元素针对某一人群设计出新的旅游纪念品。

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［6］殷丽琴，彭云强，付绍红，等.基于ISSR标记的彩色马铃薯遗传多样性分析及指纹图谱构建［J］.西南农业学报，2016，29（1）：20-25.

近几年，在以创业带动就业的国家战略指导下，上海市促进大学生创业的进程越发加快，其中不乏促进少数民族大学生创业的呼声。然而目前大学生就业形势十分严峻，尤其少数民族大学生就业问题成为重点关注对象之一，拓宽少数民族大学生自主创业渠道是改善大学生就业困难现状的重要解决途径。因此，深入研究了解当代少数民族大学生创业教育现状和问题，分析少数民族大学生创业的影响因素，进一步改进少数民族大学生创业教育发展路径，对于提高少数民族大学生创业综合素质以及实现以创业带动就业的发展战略意义重大。

［7］朴红梅，李万良，穆楠，等.ISSR标记的研究与应用［J］.吉林农业科学，2007，32（5）：28-30.

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