西施舌Coelomactra antiquata为浅海埋栖性双壳珍奇贝类，隶属于软体动物门（Mollusca）双壳纲（bivalvia）蛤蜊科（Mactridae）腔蛤蜊属（Coelomactra）.在太平洋西部的日本、朝鲜、韩国及中国沿海和印度半岛均有分布.目前，在中国的福建、广东东部、江苏南部、山东沿海资源量较大.西施舌个体大，肉质细嫩，营养丰富〔1〕，在贝类中可与海参、鲍鱼媲美，是久负盛名的筵席珍品佳肴.近10多年来，由于需求量的不断增加，各种掠夺性的捕捞和环境污染已造成西施舌产量逐年锐减〔2〕.自20世纪60年代起，国内学者开始对西施舌的生物学〔3〕、人工育苗〔4〕及人工增养殖〔5〕等进行了研究，近年来，其群体遗传差异研究的报道日渐增多〔6-8〕，线粒体基因组学及比较线粒体基因组学的研究也有报道〔9，10〕，有关西施舌及其他双壳类幼虫附着变态影响因素的研究已有不少报道〔11〕，但关于发育相关蛋白质及其基因的研究未见报道.西施舌受精卵发育需经浮游幼虫的3个阶段（包括担轮幼虫、D型面盘幼虫、壳顶幼虫阶段）后，沉入海底变为匍匐幼虫，然后附着到细沙上变态发育为稚贝.变态是幼虫发育的关键阶段，变态前后幼虫体内基因表达谱的研究，是变态分子机制研究的基础.

通过遥感技术，能从动态的角度观察总结地质灾害体的产生变化过程，进而监测其影响程度，总结其变化规律，最终实现地质灾害发生的预测。

表达序列标签（expressed sequence tag，EST）是从随机选择的cDNA克隆进行单向测序获得的短的cDNA序列，代表一个完整基因的一部分.目前，EST测序分析技术广泛应用于基因识别、绘制基因表达图谱、寻找新基因等研究领域〔12-14〕.EST序列分析技术在水产动物的研究中也被广泛应用.Kang等〔15〕研究了原生动物感染后马尼拉蛤仔（Ruditapes philippinarum）血细胞EST表达谱，发现29个免疫相关ESTs.Yamano等〔16〕分析了龙虾（kuruma prawn）眼柄EST序列表达谱，对激素相关基因作了分析.Dong等〔17〕分析了Fenneropenaeus chinensis血细胞EST序列表达谱，研究了免疫防御相关基因.Tanguy等〔18〕构建了4种不同双壳贝（Crassostrea gigas，Mytilus edulis，Ruditapes decussatus和Bathymodiolus azoricus）不同生理条件及不同协迫因素下的cDNA文库，测序获得了1300～3000个单基因EST序列，获得的功能序列占16%～27%.本研究拟构建西施舌浮游幼虫cDNA文库，并对基因EST序列作初步分析，旨在揭示浮游幼虫期基因表达特点，对西施舌发育相关基因研究奠定基础，为西施舌附着变态机制研究积累资料.

1 材料和方法

1.1 实验材料 实验用西施舌浮游幼虫于2005年6月采自福建长乐海蚌场，为孵化7 d的幼虫.收集幼虫，蒸馏水迅速冲洗沥干后，置于液氮罐中速冻，－80℃冰箱保存备用.

1.2 试剂 DH10B大肠杆菌超级感受态细胞购自Promega公司.DEPC购自Sigma公司，Trizol试剂购自Invitrogen公司，PolyATtract mRNA Isolation Systems（试剂盒）购自Promega公司，SupersciptⅡ－RT逆转录酶购自Invitrogen公司，DNA聚合酶I和RNase H购自Promega公司，EcoRⅠ和XhoⅠ购自Stratagene公司.实验中的其他试剂均为进口或国产分析纯试剂.

2.2.3 重组cDNA鉴定：挑取白斑转化菌，碱裂解法提取质粒DNA后，使用载体两端的引物T3和T7进行PCR扩增，电泳检测DNA片段的大小.结果显示，插入cDNA片段多数在0.5～2.0 kb之间，平均插入片段长度1.0 kb左右（图2）.

2.2 cDNA文库的构建

1.4 EST测序 文库铺板培养，随机挑取菌落（cDNA克隆），细菌增殖，质粒DNA提取，电泳鉴定等.测序及序列初步分析.采用cDNA克隆5′端测序，测序引物为T3（5′-ATTAACCCTCACT AAAG-3′），在Mega-Base1000测序仪上测序.

1.5 数据处理 使用Cross－match软件去掉EST序列中的低质量序列、载体序列、重复序列等，使用SeqMan序列拼接软件将测序得到的ESTs拼接成重叠群，将拼接得到的重叠群和单拷贝EST序列与Gen-Bank非冗余蛋白库比对并使用GO（Gene Ontology）分类方法做功能注释.

2 结果

在所测的EST序列中，丰度最高的是组蛋白cDNA（H1和H2A），占总EST序列的39.5%.得分在200以上的ESTs占EST总数的7.5%，这些序列对应物种多数为原鸡（Gallus gallus），另一些为细菌蛋白.得分最高（858）的EST序列（FYY_96_D01）与细菌（YP_616877）的具有天冬氨酰谷氨酰丙氨酰天冬氨酸盒的解旋酶类似蛋白（DEAH box helicase-like protein）的同源性为80%;另一EST序列（得分798）（FYY_96_F09）与原鸡的一种内质网类凝集素1（XP_419295）的同源性为99%;第三种得分较高的EST（得分672）序列（FYY_96_A03）与原鸡的转录因子ELK3（此转录因子含有一个能辨识特定序列A/CGGAA/T的ETS-DNA binding domain）的同源性为98%，此转录因子在调控细胞的增生、分化及凋亡上扮演关键角色;另一个序列（FYY_jiyu_E08）与海洋玫瑰杆菌肽链释放因子（ZP_01749813）的同源性为85%;另有一个与原鸡核糖体蛋白L4（cDNA）同源性较高（得分551）（FYY_jiyu_H07）的EST序列（表1）.以上EST序列所代表的蛋白质多数与基因的表达调控有着直接或间接关系.

  

图1 A:浮游幼虫总RNA的甲醛变性凝胶电泳;B:浮游幼虫cDNA的1.0%琼脂糖凝胶电泳Figure 1 A:Formaldehyde-denatured gel electrophoresis of total RNA of planktonic larvae B:1.0%agarose gel electrophoresis of cDNA of planktonic larvae

 

注:泳道1为双链cDNA，泳道2为DL2000.

1.3 方法 取出－80℃冰箱保存的幼虫，采用Trizol一步法提取总RNA，并用甲醛变性凝胶电泳/EB染色检测所提总RNA的质量.用Oligo-dT从总RNA中分离纯化富含Poly（A）的mRNA，操作按试剂盒的说明书进行.以mRNA为模板，使用SuperscriptⅡ－RT逆转录酶和polyT引物合成cDNA的第一链，polyT引物5′端引入XhoⅠ酶切位点，使用DNA聚合酶Ⅰ和RNase H合成cDNA的第二条链;通过T4DNA聚合酶（Promega）补平cDNA末端，然后用T4DNA连接酶加EcoRⅠadaptor，用T4磷酸化酶将双链cDNA末端磷酸化后用XhoⅠ酶切双链cDNA;琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切下大约0.5～5.0 kb的cDNA片段，用QIAEXII Gel Extraction kit（QIAGEN）纯化cDNA片段;利用T4DNA连接酶把加工好的双链cDNA连接到PBK（E/X）载体上，转化到DH10B中.检测文库质量合格后，向转化细胞中加入50%的甘油，混匀后放入－70℃冰箱保存.

2.2.1 双链cDNA的合成：双链cDNA产物电泳呈现从小到大均匀分布的拖带，主要集中于0.5～2.0 kb范围内（图1B），表明浮游幼虫mRNA的成分多样复杂.在紫外灯下切取0.5 kb以上的含cDNA胶块，回收目标cDNA.用Naro－drop仪器检测双链cDNA 胶回收情况:OD260=0.321，OD280=0.161，D230=5.341，OD260/OD280=1.994，OD260/OD230=0.060，样品浓度约为15.9 ng/μL，纯度符合要求.

一般认为，公司的盈余质量、信息披露质量、会计稳健性等越好，财务报告质量越好。目前，以审计委员会中独立董事的比例度量审计委员会独立性的研究，发现审计委员会独立性越高，内部控制质量越好（谢海娟等2016、陈文娟等2016），盈余质量越好（王振秀2017、李建红2016），会计稳健性越好（谢香兵2011），信息披露质量越好（蔡卫星等2009、柯明等2011、刘彬2014），审计意见越好（何卫红2016），财务报告质量越好（周国华2011、周国平等2013）。另外，潘珺等（2017）发现审计委员会独立董事和非执行董事比例之和越高，公司的财务报告质量越好。

2.2.2 cDNA与载体的重组及重组子转化：将100 ng的cDNA与质粒载体连接过夜，连接产物经PCR阳性检测后，再采用电转化法转化到感受态的DH10 B中，经稀释铺平板检测重组率和库容.重组率在95%左右，原始库容平均为2.3×105，基本达到文库的质量要求.

谢天谢地，呼伦冲进厨房的时候，水壶还在蹿着热气。做错事的丈母娘站在客厅，战战兢兢地给云梦讲述事情的经过。云梦一边安慰她，一边偷看着呼伦的脸色。呼伦说没事没事，虚惊一场……其实我和云梦也常犯这样的错误。既然女婿说没事，老人也就放心了，忙打开电视看连续剧，嘴里念叨着好在没晚好在没晚。一边的呼伦立刻傻了眼，电视剧竟然又他娘蹦出个三十集的续！心想指望客厅没有动静是不可能了，只能关紧书房的木门，再打开书房的窗户，然后把自己包得像一只过冬的蛹。

2.3 测序及EST序列特点 从西施舌浮游幼虫cDNA文库随机挑取克隆，从5′端测序，共获得304个ESTs，去除低质量的序列和载体序列后，共获得长度大于0.1 kb的EST序列294个，大部分序列长度为大于0.5～0.7 kb（图3），平均长度为0.5 kb.

  

图2 西施舌浮游幼虫cDNA文库部分克隆插入片段的PCR鉴定Figure 2 PCR identification of insert fragments（partial）of planktonic larva cDNA library of C.antiquata

 

注:泳道1～17为插入片段，M为DL2000 Marker

  

图3 西施舌浮游幼虫EST序列分布Figure 3 EST distribution of C.antiquata planktonic larva

2.3 两组新生儿血气分析及Apgar评分比较 两组新生儿PaCO2、PaO2、SpO2、pH等血气指标及1 min、5 min Apgar评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.4 EST blast分析与注释 对294个ESTs进行拼接，从155个ESTs（52.7%）中获得19个重叠群（contigs），仍有139个ESTs（47.3%）为单拷贝（singletons）（表1）.

 

表1 西施舌浮游幼虫ESTs序列blastx结果（blast比分大于200 bits）Table 1 Blast results of C.antiquata planktonic larva ESTs（blast score more than 200 bits）

  

EST序列名称FYY_01_B09注册号XP_001345160得分bits/score 147/372 E值3.00E-34 FYY_01_F05XP_798448105/2637.00E-22 FYY_02_G06AAU11444190/4826.00E-47 FYY_02_A09XP_418545110/2753.00E-23 FYY_02_E11ABV31711133/3347.00E-30 FYY_02_B02ZP_01985781149/3779.00E-35 FYY_2k_C12XP_414929162/4117.00E-39 FYY_2k_F02YP_444891同源动物斑马鱼Danio rerio紫球海胆Strongylocentrotus purpuratus海洋微藻Glossomastix chrysoplasta原鸡Gallus gallus大西洋鮭Salmo salar哈维氏弧菌Vibrio harveyiHY01原鸡Gallus gallus嗜盐细菌Salinibacter ruberDSM 13855100/2488.00E-20 FYY_2k_G12AAI3287899.0/2459.00E-20 FYY_jiyu_H07NP_001007480216/5517.00E-56 FYY_42k_H12ZP_01880556137/3462.00E-31 FYY_42k_D04XP_414260147/3722.00E-34 FYY_jiyu_B03XP_001638172100/2505.00E-20 FYY_jiyu_E08ZP_01749813197/5023.00E-49 FYY_96_F09XP_419295311/7981.00E-83 FYY_96_A03NP_001025920263/6725.00E-69 FYY_96_D01YP_616877335/8581.00E-90 FYY_2k_A03P19178162/4111.00E-38 FYY_2k_E05XP_001600014115/2882.00E-24 FYY_2k_F03AAP94647103/2561.00E-20 FYY_96_E04BAC2272083.6/2051.00E-19 FYY_01_G05XP_001345160预测功能假定蛋白hypothetical protein溶质载体家族2 solute carrier family 2脂肪酸脱饱和酶fatty acid desaturase二肽酰氨基肽酶dipeptidyl aminopeptidase like protein转位酶transposase保守假定蛋白conserved hypothetical protein细胞激酶信号-1抑制剂Suppressor of cytokine signaling 1外膜受体蛋白probable outer membrane receptor protein HHIP-like蛋白1 HHIPL1核糖体蛋白L4 ribosomal protein L4 ATP酶亚基ATPase subunit假定蛋白hypothetical protein假定蛋白predicted protein I类肽链释放因子Class I peptide chain release factor内质网凝集素endoplasmic reticulum lectin 1-like转录因子ELK3 ELK3 protein DNA/RNA解旋酶盒 helicase-like protein组蛋白H2A Histone H2A组蛋白H2A ENSANG P00000031917（H2A）组蛋白1 histone H1未命名蛋白unnamed protein product假定蛋白hypothetical protein现代人Homo sapiens原鸡Gallus gallus玫瑰变色菌Roseovarius sp.TM1035原鸡Gallus gallus星状海葵Nematostella vectensis海洋玫瑰杆菌Roseobacter sp.CCS2原鸡Gallus gallus原鸡Gallus gallus鞘氨醇单胞菌Sphingopyxis alaskensis RB2256沙蚕Platynereis dumerilii金小蜂Nasonia vitripennis紫贻贝Mytilus galloprovincialis沃尔巴克氏体Wolbachia endosymbiont斑马鱼Danio rerio 140/3544.00E-32

对158个序列（19＋139）在GenBank数据库中搜索对应产物.使用blastx在GenBank的非冗余蛋白质库比对，把EST序列分为高同源性组（blast score≥100）和低同源性组（score:50～100）.有13个序列（8.2%）在高同源性组，68个序列（43.0%）在低同源性（score:50～100）组，2组合计占EST总数的71.4%（210/294），其余的77个序列（score below 50）（48.7%）（占总EST序列数的28.6%）为不确定序列，提示有许多未知基因.

  

图4 西施舌浮游幼虫组蛋白Can-H1、Can-H2A一级结构Figure 4 Primary structure of histone Can-H1 and Can-H2A onC.antiquataplanktonic larva

 

注:有阴影的氨基酸为碱性氨基酸.

2.1 浮游幼虫总RNA及mRNA的分离 取1 μL总RNA样品稀释50倍，分光光度法测光密度为OD260=1.244，OD230=1.051，OD280=0.641，OD260/OD280=1.941，样品浓度约为2.4 μg/μL.RNA总量为750 μg.浮游幼虫总RNA在1%的甲醛变性凝胶电泳图（图1A）上能观察到28S核糖体RNA与18S核糖体RNA以及5S核糖体RNA 3条带，无基因组DNA污染，28S和18S两条带清晰可见，5S区有两条带.

对294个ESTs进行拼接，其中86个ESTs拼接为长度为1224 nt的cDNA序列;30个ESTs拼接为1537 nt的cDNA序列，进行开放阅读框预测，分别获得1个561 bp（146～706/1224）（ORF1）和1个375 bp（310～684/1534）（ORF2）开放阅读框，2个ORFs起始、终止密码子均为ATG和TAA.ORF1编码186氨基酸（aa）的蛋白质，其赖氨酸（K）占30.6%，K＋R占31.7%（图4）.blastp分析显示，其22～99位的肽段与贻贝目紫贻贝Mytilus galloprovincialis H1（28～105 aa）（AAP94647）肽链同源性为72%，命名为Can-H1;ORF2编码124个氨基酸的肽段（图4），其中，赖氨酸（K）占10.5%（13/124），精氨酸（R）占8.9（11/124），K＋R占19.4%.此肽段前120个aa与长牡蛎Crassostrea gigas（EKC39821）H2A的同源性为99%，命名为Can-H2A.Can-H2A（和Can-H1）终止密码子后第42～58（68～83）位的核苷酸序列是16个核苷酸的茎－环结构，其序列为GGCCCTTTTAAGGG CC（Can-H2A）或GGTCCTTTTCAGGACC（Can-H1），加粗字母为保守核苷酸，此序列形成典型的茎环二级结构为组蛋白mRNA转录终止信号（图5）.

  

图5 西施舌浮游幼虫组蛋白Can-H1（左）、Can-H2A（右）cDNA3′端16个核苷酸茎-环结构Figure 5 Structure of 16 nucleotides at the 3'end of histone Can-H1（left）and Can-H2A（right）on C.antiquata planktonic larva

 

注:影印部分是保守核苷酸.

将Can-H2A和Can-H1编码的氨基酸序列由Thyre2在线进行蛋白质三级结构预测（图6），Can-H1的α-螺旋结构占21%，β-折叠结构占3%，其余部分为无规则圈曲;Can-H2A的三维结构有一段长的α-螺旋和几段短α-螺旋区，α-螺旋占56%，β-折叠占3%，其余序列形成无规关卷曲.

  

图6 西施舌浮游幼虫组蛋白Can-H1（左）、Can-H2A（右）三维结构预测Figure 6 The three-dimensional structure of histone Can-H1（left）and Can-H2A（right）on C.antiquata planktonic larva

3讨论

组蛋白是染色质中的碱性蛋白，为组成性表达，是核小体的重要组成成分.核小体由核心组蛋白和H1组成，前者是由组蛋白H2A、H2B、H3和H4各2个亚基组成的8聚体.组蛋白是核小体的结构成份，也是DNA转录与复制的调控成分〔19〕，在每一个细胞周期，真核细胞不仅要合成DNA，而且要合成足够量的组蛋白，将DNA包装成染色质.后生动物有一套独特的基因，即复制依赖的组蛋白基因，编码后生动物大部分组蛋白mRNA.组蛋白mRNA也是真核生物仅有的一套非多腺苷酸化mRNA〔20〕.组蛋白功能存在多样性，这种多样性一是来自于细胞发育的不同时期，可表达不同的组蛋白变体;二是来自于组蛋白的共价修饰，每种组蛋白执行不同生物学功能〔20-21〕.如海胆有两套组蛋白基因，一套在胚胎发育早期表达，另一套在生命周期的全程表达〔22〕.组蛋白的变体与机体的免疫有关，如组蛋白H2A合成后，一部分参与核小体的形成，大部分可能参与机体防御作用〔23〕.

本研究对西施舌浮游幼虫cDNA文库初步测序结果显示，有28.3%的EST序列拼接为一段含有类H2A基因全序列的DNA，有9.9%的ESTs拼接为一段含有类H1基因全序列的DNA，两者合计占所测EST的38.2%.组蛋白mRNA的代谢与细胞周期及DNA合成速度紧密偶联，当细胞进入S期和有丝分裂期之间，组蛋白mRNA增加35倍〔21〕，后生动物的mRNA不终止于多聚腺苷酸，而是在转录本的3′端有进化上高度保守的茎-环（Stem-loop，SL）结构，此结构与茎-环结合蛋白（SLBP）结合，行施许多组蛋白mRNA调控作用〔24〕.在西施舌H1-L和H3-L的mRNA 3′非编码区中均发现了典型的SL结构.当细胞增生时，在细胞周期的S期，发生大量的组蛋白合成〔21〕.在西施舌个体发育的浮游幼虫阶段，大量细胞分裂增殖，需要染色体复制，因此，组蛋白基因大量表达，以包装成新的染色质，适应生长发育对染色体的需要.本研究在西施舌浮游幼虫cDNA文库5′端测序得到的EST序列中，编码组蛋白的cDNA丰度高是必然.对H3-L、H1-L三维结构的预测显示，α-螺旋、自由回旋二级结构所占比例高，而β-折叠结构比例很小.组蛋白空间构象的研究也可为组蛋白功能的研究提供资料.

那天晚上，伟翔小孩子一样跟我讲了很多话。他说：“那段日子，我简直绝望极了，不能给自己心爱的女人幸福的生活，让她那么受委屈，我觉得自己是个最窝囊最没有用的男人。我总感觉我欠你的，所以，回到家里看到你的脸色不好，我就连大气都不敢喘……”

近年来，随着农村城镇化和整岛城市化进程加快，土地流转明显递增，规模经营快速推进，以种养大户、家庭农场、农民合作社、农业龙头企业为代表的各类新型农业经营主体迅猛发展，为推进现代农业发展和农业适度规模经营发挥了重要作用。通过调查，全市的土地流转和农业规模经营主要呈现以下特点：

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