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ERK1、ERK2及磷酸化的ERK1/2在结直肠癌中的表达及临床意义

更新时间:2009-03-28

结直肠癌是目前临床上多发的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率在国内也呈现上升趋势。虽然表面上结直肠癌的发生发展与遗传、饮食、炎症等因素密切相关,但调控细胞增殖分化的多种信号通路的表达失调在肿瘤的发生发展中发挥着极其重要的作用。细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)1/2信号通路是MAPK家族中的一条重要信号通路[1~3]。该通路可被与受体酪氨酸激酶、细胞因子受体或G蛋白偶联受体结合的几乎所有生长因子及细胞因子激活,活化的ERK蛋白从胞质转移到胞核,磷酸化一系列转录因子,包括C-myc、STAT、C-jun等等,从而引起细胞异常的增殖分化及转移[4~9]。本研究通过检测ERK1、ERK2及p-ERK1/2在结直肠癌和癌旁组织中的表达,结合临床资料分析其临床意义,为进一步研究ERK1、ERK2及p-ERK1/2调控结直肠癌发生发展的具体分子机制奠定基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2014-09~2016-09在内蒙古医科大学附属医院胃肠外科因结直肠腺癌行手术治疗并定期随访的120例病人的癌组织及对应的癌旁(距离癌组织5cm以上)结直肠黏膜组织。其中女性51例,男性69例,年龄26~83岁,平均年龄60.4±15.6岁。120例病人术前均未接受放、化疗治疗,且术前均未确诊合并其他恶性肿瘤疾病。所有组织样本均经术后病理切片检查确诊为腺癌。120例组织样本中包括高分化癌56例,中分化癌28例,低分化癌36例。其中伴有淋巴结转移者72例,无淋巴结转移者48例。临床分期参照中国结直肠癌诊疗规范、美国癌症联合委员会/国际抗癌联盟/结直肠癌TNM分期标准进行分期,其中I和II期58例,III和IV期62例。

1.2 材料

所有病人的组织标本在离体后立即放入液氮中保存,用于提取RNA和蛋白,另取组织经4%的多聚甲醛固定常规制成石蜡切片。RNA提取试剂Trizol、蛋白裂解液RIPA、BCA蛋白质定量试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司;逆转录试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司;UltraSYBR Mixture购自北京康为世纪公司;即用型SABC-POD(山羊IgG)试剂盒、浓缩型氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;Western Blot转印0.45μm PVDF膜购自Millipore公司;Anti-ERK1抗体(ab32537)、Anti-ERK2抗体(ab32081)均购自abcam公司;Anti-p-ERK1/2Rabbit mAb购自Cell Signaling Technology;内参抗体GAPDH及羊抗兔二抗购自proteintech公司。

此外,从绿色环保的角度来看,光伏发电与风力、水能发电一样,作为可再生能源,对保护资源、环境带来巨大的社会效益。

2 方法

2.1 总RNA提取和qRT-PCR检测

利用Trizol法分别提取癌组织及癌旁癌组织中的总RNA。取1μg总RNA按照First Strand cDNA Synthesis Kit操作说明书进行反转录得到cDNA。按UltraSYBR Mixture使用说明,将cDNA2μL+上游引物1μL+下游引物1μL+PCR Mix10μL混合,以总体积20μL在Bio-Rad CFX 96 Real-Time PCR Detection System中进行反应。以GAPDH作为内参,相对定量用2-△△ct法分析,所有反应重复3次。qRT-PCR引物序列(见表1)。

扭转冲击工具顺时针冲击结束状态如图3b所示。此时,工具液流分为3部分:第部分直接通过节流喷嘴到达钻头;第2部分通过分流器到达上冲击腔,此时冲击锤已和下冲击面接触,顺时针冲击完毕;第3部分是启动器内的压力通过卸荷槽联通得到平衡。此时,因为启动器周围的环境压力处于近似相等的状态,启动器借助着顺时针转动的惯性继续转动。

2.2 免疫组化及结果判读

组织匀浆后RIPA法提取总蛋白,BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度,然后将蛋白样品与蛋白上样缓冲液以4∶1的体积比混合后95℃水浴15min。将变性后的样品以10%的SDS-PAGE胶行蛋白电泳,切取目的胶条,采用湿转法转移蛋白至PVDF膜上,置于5%脱脂牛奶中室温封闭2h。更换稀释好的一抗(Anti-ERK11∶1000,Anti-ERK21∶2000,p-ERK1/21∶1000)4℃孵育过夜,TBST冲洗3次后更换二抗(羊抗兔IgG1∶5000)室温孵育2h。TBST冲洗后采用增强型化学发光液(ECL)显影,暗室曝光。

 

表1 qRT-PCR相关引物序列

 

Tab.1 QRT-PCR primers

  

基因引物序列(5'-3')产物大小ERK上游引物:TCATCGGCATCCGAGACAT99bp下游引物:GCAACTTGTACAGGTCAGTCTCCATERK2上游引物:CGTGACCTCAAGCCTTCCA115bp下游引物:CTGTCAGGAACCCTGTGTGATCGAPDH上游引物:AGAAGGCTGGGGCTCATTTG140bp下游引物:GCAGGAGGCATTGCTGATGAT

图1 ERK1和ERK 2 mRNA在癌组织中高表达,且于癌组织的分化程度相关

Fig.1 ERK 1 and ERK 2 mRNA are both upregulated in human colorectal cancer tissues,and be related to the differentiation

注:A:qPCR检测120对癌与癌旁配对样本中mRNA水平;B:按照癌组织的病理分化程度分组比较ERK1和ERK 2 mRNA的表达水平。(*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001)

2.3 Western blot检测ERK1/2及p-ERK1/2的表达

免疫组织化学染色操作步骤严格按照试剂盒说明书进行:脱蜡水化、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、封闭工作液、加一抗(ERK11∶500,ERK21∶200)、二抗、DAB显色、封片等。采用已知阳性片作阳性对照,PBS代替一抗作空白对照,用非免疫血清代替一抗作阴性对照。由3名病理医师在未知晓临床结果的前提下独立阅片并给予评分,随机评价5个200倍视野,以染色程度和阳性细胞百分率进行综合评定。染色强度以阳性细胞呈现的染色特征为标准计分:细胞未着色为0分,染色呈淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。按照阳性细胞率计分:无阳性细胞为0分,阳性细胞数<25%为1分,25%~49%为2分,≥50%为3分。将每个组织点染色强度与阳性细胞百分率计分相加为最后得分:≤2分为(-),>2分为(+)。

计量资料数据用来表示,计数资料用频数表示。癌与癌旁组织中表达量的比较采用配对样本t检验,对于计数资料,则采用卡方检验或非参数检验。应用SPSS21.0对数据进行分析,以P<0.05作为有统计学差异的标准。

2.4 统计学分析

对于表面人工湿地结构进行研究时不难发现,接近水面部分为好氧层,底部部分为厌氧层。考虑到湿地植物对阳光有所遮挡,这样就不会存在藻类大量滋生的可能。可以种植芦苇、水葱、香蒲、灯芯草等挺水植物,凤眼莲、浮萍、睡莲等浮水植物,以及伊乐藻、茨藻、金鱼藻、黑藻等沉水植物。还可以种植慈姑、雨久花、玉蝉花、千屈菜、黄菖蒲、泽泻等水生花卉类的观赏植物,既可以处理污水,也可以美化环境。

免疫组化显示(见图2 A),ERK1和ERK2蛋白在癌组织中均显著高表达,在细胞的胞浆和胞核中均有表达,染色呈现棕黄色。而在癌旁组织中显著低表达,阳性细胞率低,细胞未着色或呈现淡黄色。在癌组织中,ERK1和ERK2的阳性细胞率分别为85.0%(102/120)和79.2%(95/120),而在癌旁组织中的阳性率仅为8.3%(10/120)和10.8%(13/120),差异显著(P<0.001)。Western Blot检测结果(见图2 B)进一步验证了ERK1和ERK2在癌组织中高表达,在癌旁组织中低表达。

图2 ERK1和ERK2蛋白在癌和癌旁组织中的表达

Fig.2 ERK 1 and ERK 2 protein are both upregulated in human colorectal cancer tissues

注:A:免疫组化检测(200X);B:Western blot检测

  

图3 p-ERK1/2蛋白在癌和癌旁组织中的表达

 

Fig.3 P-ERK1/2protein is upregulated in human colorectal cancer tissues

注:A:免疫组化检测(200X);B:Western blot检测

3 结果

3.1 ERK1和ERK2的mRNA水平在癌中显著升高

免疫组化显示(见图3 A),与ERK1和ERK2类似,p-ERK1/2蛋白在绝大多数癌组织中显著高表达,染色呈现棕黄色;在多数癌旁组织中低表达,细胞未着色或呈现淡黄色。在癌组织中,p-ERK/2的阳性细胞率为81.7%(109/120),而在癌旁组织中的阳性率仅11.7%(14/120),具有显著的统计学差异(P<0.001)。Western Blot检测结果(见图3 B)进一步验证了p-ERK1/2在癌组织中高表达,而在癌旁组织中低表达。

ERK1、ERK2及p-ERK1/2在癌组织中的蛋白阳性率与病人的性别、年龄及肿瘤大小等因素无相关性(见表2)。但与分化程度、TNM分期、有无淋巴结转移密切相关。低分化癌的组织中,ERK1的阳性率达94.4%,显著高于中分化及高分化的癌组织(分别为82.1%、80.32%)。ERK2的阳性率与肿瘤分化的相关性与ERK1类似。由TNM分期可以看出,III、IV期病人的结肠癌组织中ERK1和ERK2的阳性率极高(分别为96.8%、91.9%),均显著高于I、II期的病人。同样,在淋巴结转移的病人中,ERK1和ERK2的蛋白阳性率达到了91.4%和88.6%,亦显著高于无淋巴结转移者(分别为76.0%、66.0%)。

3.2 ERK1和ERK2蛋白在癌和癌旁组织中的表达

进入70年代,我国开始从国外引进技术先进的大氮肥装置。这些大型装置的引进迅速提高了我国氮肥工业的技术水平和高浓度尿素的比例。80年代末至90年代中期,我国建设了一批大中型氮肥装置,并对中小氮肥进行了大规模的技术改造,使得我国氮肥自给率迅速提升。

3.3 p-ERK1/2蛋白在癌和癌旁组织中的表达

qRT-PCR结果显示(见图1 A),ERK1和ERK 2 mRNA在癌组织中的表达显著高于癌旁组织(P<0.001和P<0.01)。且将癌组织中的相对表达量按照病人的病理分化程度进行分组比较显示(见图1 B),ERK 1 mRNA的水平与分化程度呈负相关,即分化程度越高,表达量越低;ERK2在高分化和中分化的癌中相比并无统计学差异,但均显著低于低分化癌的表达水平,差异具有显著的统计学意义(P<0.001)。

3.4 ERK1、ERK2及p-ERK1/2蛋白与临床指标之间的关系

虽然我熟悉的几个孩子天性是很疯的,玩疯起来大喊大叫,但这个完全不矛盾。good manner不是天生的,是家长后天严格的家教和努力得来的。

 

表2 120例结直肠癌组织中ERK1、ERK2及pERK1/2蛋白表达与临床指标的关系

 

Tab.2 Relationships between ERK1,ERK 2 and p-ERK1/2expression and

 

clinicopathologic parameters of 120 colorectal cancer patients

  

临床指标NERK1阳性率%PERK2阳性率%Pp-ERK1/2阳性率%P性别男6984.10.73775.40.23292.80.396女5186.384.388.2年龄≥555780.70.21084.20.19689.50.623<556388.974.692.1肿瘤大小≥5cm7183.10.48077.60.58087.30.109<5cm4987.881.695.9分化程度低分化3694.488.994.4中分化2882.1<0.0571.4<0.0592.9<0.05高分化5680.376.887.5TNM分期I、II期5872.4<0.00165.5<0.00184.5<0.05III、IV期6296.891.996.8淋巴结转移无5076.0<0.0566.0<0.0182.0<0.01有7091.488.697.1

4 讨论

结直肠癌的发生发展与多种因素有关,表观遗传学尤其是细胞增殖分化转移等相关信号通路的异常发生在恶性肿瘤发生发展中的作用机制成为近几年研究的重点及热点。MAPK/ERK信号通路是将细胞外信号传导入胞内的重要信号转导途径,在多种肿瘤的发生发展尤其是在细胞增殖和分化中起重要作用。

越来越多的研究发现,在多种人类肿瘤组织及肿瘤细胞中MAPK/ERK信号传导通路存在异常表达及活化,提示此通路调控异常与肿瘤密切相关。在乳腺癌、肾癌、非小细胞性肺癌、卵巢癌及头颈部肿瘤等多种恶性肿瘤中均可检测到ERK1/2的高表达及ERK1/2磷酸化水平的升高。另外,用 ERK1/2的特异性抑制剂抑制肺腺癌细胞中ERK1/2的活化后,其生长因子介导的细胞迁移出现明显抑制[10]。本研究显示,结直肠癌中ERK1和ERK2的mRNA水平显著升高,且与癌组织的分化程度密切相关,即分化程度越低,癌组织中ERK1和ERK 2 mRNA的水平越高。在蛋白水平检测中也发现了ERK1和ERK2在癌组织中的高表达,且与肿瘤的分期、分化及淋巴结转移密切相关。同时活化的p-ERK1/2与肿瘤分期、分化及转移方面的研究也表现出与ERK1和ERK2相同的一致性。以上研究均提示,在结直肠癌中存在ERK1和ERK2的持续高表达和活化,且这种表达与活化与结直肠癌的发生发展及转移密切相关。

既往研究显示,ERK1和ERK2在正常细胞中主要存在于胞质中,而在肿瘤细胞中,受体酪氨酸激酶(RTKs)诱导受体发生自身磷酸化和二聚化,识别并结合接头蛋白Grb2,进而结合并活化调控分子SOS,SOS可促使Ras激活结合GTP,活化的Ras可活化下游分子C-Raf,活化的Raf可磷酸化MEK,而磷酸化的MEK1/2又可特异性的双磷酸化ERK1/2使之激活,活化的ERK蛋白从细胞质移位到细胞核,磷酸化包括C-myc,STAT,SAP-1,ER等在内的一系列转录因子,从而引起细胞增殖分化,调节细胞周期和细胞生存。在肿瘤细胞内,作为信号转导通路的关键分子及药物治疗的重要靶点,ERK1和ERK2的表达、活化及对下游分子的调控具有多样性。而在胰腺癌中,曲格列酮可通过抑制ERK1/2的活化,抑制Cyclin/Cdk而起到抑制癌细胞增生的作用[11]。一些药物可通过cAMP活化ERK1/2促进p 90 RSK蛋白表达,进而调控CREB与CRE反应元件结合,从而增强BIRC3的启动子转录,使BIRC3蛋白表达增高,抑制肿瘤细胞凋亡[12]。基质金属蛋白酶家族(MMPs)是肿瘤细胞侵袭及转移的关键蛋白分子家族,其中MMP2和MMP9的研究较为广泛[13]。有研究显示ERK1/2的表达与MMP2、MMP9均有相关性,具有正相关关系[14,15]。使用ERK通路阻断剂阻断后,MMP9的蛋白表达也相应下降,而且多个与侵袭转移相关基因可通过ERK1/2通路调控MMP2、MMP9蛋白的表达而发挥作用。

综上所述,ERK1/2信号通路的表达及活化在结直肠癌中异常活跃,ERK1/2及活化的p-ERK1/2与结直肠癌的细胞分化、病理分期、淋巴结转移等密切相关。ERK1/2信号通路可能作为结直肠癌靶向治疗的关键靶点。

参考文献

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仝伟兵,苏秀兰,贾永峰,张兵
《内蒙古医科大学学报》2018年第01期文献

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