浙贝母(Fritillariae thunbergi bulbus.) 和平贝母(Fritillariae ussuriensis bulbus.)均为传统常用中药，为百合科贝母属的干燥鳞茎，具有止咳化痰的作用，与川贝母同属贝母属。川贝母(Fritillariae cirrhosae bulbus.)同样具有止咳化痰功效，是润肺止咳的名贵中药材，但在药用上与其他贝母有一定差别，由于售价较高，故掺假现象时有发生，迫切需要建立科学、快速、准确、有效的检测方法，进行川贝母掺假的鉴别[1-4]。中药材川贝母的真伪性鉴定对于其临床用药的安全性、有效性非常重要，但基于微观或化学成分其识别方法缺乏特异性。常用的川贝母检测手段主要有高效液相色谱[5-6]和分子鉴定的方法[7-10]。高效液相色谱法具有高效、快速的特点，灵敏度高，但需要较贵的色谱仪，对操作人员要求较高。分子鉴定法中的指纹图谱技术是药材鉴别的新标准，可以全面反映中药材化学成分的种类与数量，从整体上反映中药材的特性。国家食品药品监督管理局检测标准虽然有分子鉴定方法，但并没有公布川贝母掺伪的定量检测方法。PCR-RFLP是以PCR技术为基础，扩增产物被识别特异性序列的限制性内切酶消化切割成不同大小片段，由于扩增目的序列的限制性酶切位点分布不同，以至于产生不同长度的DNA条带。在《中国药典》2010年版增补本中新增了川贝母PCR-RFLP鉴别，2015年进行了修订，其方法是利用限制性内切酶Sam I酶，切割聚合酶链式反应(PCR)扩增产物，由于伪品贝母PCR扩增产物没有Sam I酶切位点(CCC┆GGG)，不能被Sam I切割[11]。因此,可根据100～250 bp间是否存在2条酶切条带，来判断川贝母样品的真伪。本研究对PCR-RFLP鉴别川贝母的方法进行了改进，对酶切体系进行了优化，并按不同的真/伪比例进行样品混合，通过灵敏度测试，以期提高鉴别的精确度，为完善药典检测方法提供合理有效的技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料

国家标准物质川贝母(中国食品药品检定研究院，121000)；平贝母对照药材(中国食品药品检定研究院，120924)；浙贝母对照药材(中国食品药品检定研究院，120972)；伪品贝母，由生物污染与动植物分子识别研究室提供；新型植物基因组DNA提取试剂盒(DP-320)；天根生化科技(北京)有限公司；2×GoTaq Green Master Mix(Promega M7123)；DL 2000 DNA Marker(宝生物工程有限公司)；Super GelRed(14S1209)；琼脂糖(Biowest)；Sam I酶(TAKARA,1085AH和NEB，R0141S)。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取与RCP反应 取样品粉末100 mg，置于2 mL 离心管中，按基因组DNA提取试剂盒提取DNA。将提取的真、伪川贝母DNA分别按以下的扩增体系及程序进行PCR扩增并进行酶切。上游引物 F：5′-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA-3′；下游引物 R：5′-GCTACGTTCTTCATCG AT-3′，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

反应体系为：DNA模板(50 mg·L-1)2.0 μL，2×mix 12.5 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)1.5 μL，H2O补充至25 μL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性5 min，35个循环(95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，72 ℃延伸5 min，8 ℃保存。

1.2.2 Sam I酶种类的优化 选取了市售的2种常用品牌的Sam I酶(TAKARA,1085AH和NEB R0141S)并结合新版2015药典方法和酶的使用说明书，设计2种酶切效果比较试验。2种酶反应体系均使用1 000 ng的PCR产物，反应体系20 μL，10×酶切缓冲液2 μL，内切酶0.5 μL，补加ddH2O至20 μL。NEB Sam I反应条件为25 ℃反应15 min，TAKARA公司Sam I酶反应条件为30 ℃反应2 h。

1.2.3 酶切底物浓度的优化 酶的底物浓度对酶促反应有一定的影响，过高的底物浓度导致川贝母DNA不能被全部酶切，恰恰伪品川贝母DNA不能被酶切，在电泳图中有所体现，从而影响真伪性的判断，故需探索最适底物浓度。但在2015版《药典》中并没有提及酶切时所需的最低底物量，又因为过低底物量直接影响酶切效果，故设计以下7个底物量梯度，分别为1 000 、800 、600 、400 、200 、100 、0 ng，以求得到最适于酶切的最低底物量。进而获得最好的酶切体系，也是为了寻找完全酶切反应最适底物浓度。

1.2.4 掺假情况实验 根据市面上中药材川贝母有掺假情况，用标准物质川贝母DNA跟市面上获得常见伪品DNA进行掺假实验：真/(伪+真)。前期设计100%、75%、50% 、25%、10%、0% 6个梯度进行以上优化的PCR-RFLP实验，从后期从25%到10%进行细化，进而设计25%、20%、15%、10%、0% 5个梯度。

1.2.5 检出限 根据1.2.4 得到实验结果，进行60组平行PCR-RFLP试验，得到检测灵敏度。

2 结果与分析

2.1 川贝母真伪的PCR检测

对真伪川贝母和平贝母、浙贝母进行了PCR扩增实验，PCR扩增结果显示(图1)，标准品川贝母和伪品川贝母DNA均可扩增出特异性条带，但无法从目的片段大小上对二者进行区分，故需要进行酶切反应。平贝母、浙贝母扩增产物片段较川贝母稍大。

严跃进认为，严格来说，房产税按套内面积征收引发民怨较小。从更长远的观点看，未来要建设开放式街区小区环境，公共通道部分该如何征税，会否增加公摊面积，如何缓解社会矛盾，都值得深思。

（3）教学课程形式的愿望。在希望开设课程的学生中，有498人（30.9%）最喜欢合作学习式，539人（33.5%）最喜欢案例教学式，356人（22.1%）最喜欢自学—辅导式，115人（7.1%）最喜欢传递—接受式，仅有103人（6.4%）最喜欢现象分析式，且不同年级、性别、任职的学生对教学形式愿望的差异有显著性（P=0.018，P=0.034，P=7.427×10-5）。

2.2 样品DNA的测序结果

参考文献：

  

M：DNA Marker；CK：空白；1,2：伪贝母； 3,4： 川贝母；5,6 ：平贝母；7,8：浙贝母。 M:DNA Marker; CK:Control；Lane 1,2：Pseudo Fritillaria； Lane 3,4：Fritillariae cirrhosae bulbus；Lane 5,6：Fritillariae ussuriensis bulbus；Lane 7,8：Fritillariae thunbergi bulbus.

 

图1 真伪川贝母PCR电泳图 Fig.1 PCR of different kinds of Fritillaria

2.3 2种品牌Sam I酶切效果的比较

为了减少不同品牌限制性内切酶对结果的影响，选取市售的2种酶切，进行酶切试验，前期使用的底物质量浓度为每20 μL体系中分别含底物1 000 ng 和800 ng。结果显示(图2)，在100 ～250 bp之间，2种不同品牌Sam I酶酶切图谱中均出现2条DNA条带，完全符合药典上对真品川贝母的描述，说明2种品牌Sam I酶均适用于鉴别川贝母。根据2种品牌Sam I酶的实际应用效果，发现NEB Sam I酶对川贝母DNA酶切反应效果较好，条带清晰，且耗时少，只需要15 min，故采用NEB公司的Sam I限制性内切酶。

  

A.NEB酶切图谱; B.TAKARA酶切图谱; 1,2 泳道为1000ng，3,4泳道为800ng。 A: NEB emzyme; B:TAKARA emzyme; Lane 1,2: 1000 ng，Lane 3,4: 800 ng.

 

图2 2种品牌Sam I酶切效果的比较Fig.2 Digest results of two kinds of Sam I

对真伪川贝母及平贝母、浙贝母进行了Sam I酶切试验。伪品样品与对照药材样品酶切后电泳，在凝胶成像仪上检视。酶切图谱结果显示，由于标准品川贝母在100～250 bp之间存在2条酶切条带，而伪品川贝母没有，平贝母、浙贝母PCR产物不能被切开(图3)。

目前，川贝母真伪鉴别更多的是采用性状鉴别和色谱鉴别，川贝母与伪品川贝母虽外形相似，但伪品川贝母的药材性状均呈整块状，这是鉴别川贝母真伪的重要特征。由于市场上川贝母药材品种较多，同品种间也会因为药材植物来源、生长环境、年份、气候、产地和加工等因素存在相当的混杂度，市售样品掺假现象严重，因此常用的鉴别方法都存在一定的局限性，无法对市售川贝母复杂掺伪现状进行准确定量鉴别。此外，也有川贝母DNA检测试剂盒[12]以及川贝母基因组ITS2区域寻找差异[13]等方法，但仅能对是否有川贝母伪品做出定性判别，不能对掺假的比例做出定量分析。

  

M：DNA Marker; CK：空白；1,2：伪贝母； 3,4 ：川贝母；5,6： 平贝母；7,8：浙贝母。 M: DNA Marker; CK:Control；Lane 1,2：Pseudo Fritillaria； Lane 3,4：Fritillariae cirrhosae bulbus；Lane 5,6：Fritillariae ussuriensis bulbus；Lane 7,8：Fritillariae thunbergi bulbus.

 

图3 真伪川贝母酶切电泳图谱 Fig.3 Restriction enzyme analysis of different types of Fritillariae cirrhosae bulbus

2.4 酶切底物量的优化

[2] 刘薇,张文娟,林丽君,等.我国川贝母的质量分析[J].中国药学杂志,2015,50(4):305-309.

[5] 王聪,王曙,马静,等.川贝母的HPLC指纹图谱研究[J].华西药学杂志,2010,25(1):61-63.

  

图4 酶切底物量的优化 Fig.4 Optimization of emzyme substrate amount

2.5 真伪川贝母鉴别结果

本研究通过使用标准物质川贝母DNA与市面上获得常见伪品DNA进行掺假实验。设计不同含量的真品川贝母进行PCR-RFLP大区间验证(图5)，后期将含量区间缩小到25%～10%比例细化，进行小区间灵敏度分析。试验结果显示(图6)，在标准品川贝母含有10 %左右时，依旧可检出。当市面上中药材被掺假后，可通过优化后的方法能相对定量的检出掺假含量。但单纯的灵敏度试验并不一定可靠，故为了验证其可靠性，继而进行了检出限实验。

“彼童子之师，授之书而习其句读者。”韩愈在《师说》中提到“习其句读”是学习古诗文的基本功，以前的国文考试，也会考断句这类题型。现在的古诗文教学，呈现给学生的是校注非常规范的文本，通常情况下教师都会忽略掉断句。笔者认为，至少应将没有断句的文本和教材中的文本进行比较，让学生思考断句的依据，如此才能为辨明章句做好准备。

2.6 检测方法的检出限

检出限LOD一般是指不低于95%的检出情况下，严格的测试是在60次平行试验中至少检出59次阳性。本试验检出限结果显示(图7)，60个孔全部在100 bp到250 bp间出现2条清晰可辨的条带，符合药典关于鉴别真伪的相关描述。

众所周知，我国的文字属于象形文字，而对“酒”字的演变进行考察后不难发现，酒字的甲骨文中就包含了陶罐的表现形式，也就是说，在酒出现的初期，就是被保存在陶罐之中的。

  

图5 大区间灵敏度图谱 Fig.5 Large interval sensitivity analysis

  

图6 小区间灵敏度分析 Fig.6 Small interval sensitivity analysis

  

图7 含量10%真品川贝母DNA酶切电泳图谱 Fig.7 Restriction enzyme analysis of 10% Fritillariae cirrhosae bulbus

3 结论与讨论

王积薪挥袖擦掉脸上的泪水，当即将三个少年带到棋室里，信誓旦旦，一定要将浑身棋艺倾囊相授，还要东方宇轩除了管理谷中事物之外，也应抽空过来弈棋，毕竟，这个谷中，只有他们两人才是唯二的弈棋高手。

本研究对已有的聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性方法鉴别川贝母的方法进一步改进，对酶切体系进行了优化，并按不同的(真/伪)比例进行样品混合，通过灵敏度测试，提高了鉴别的精确度。酶切反应体系为20 μL，当底物量在200 ng及以上时，使用NEB公司的Sam I快切限制性内切酶可在15 min内完成反应。结果表明，真品川贝母酶切图谱中100～250 bp间有2条清洗可见的条带，而伪品贝母则不能被切开，真品含量10%以上即可被检测出来，可以通过条带的亮度来确定真品川贝母的相对的量。本方法既可检测川贝母是否掺假，又能相对定量检测出掺假川贝母的含量，结果稳定可靠。

对标准品川贝母和伪品川贝母的PCR扩增产物进行了测序，并通过NCBI-BLAST进行了序列比对。从NCBI比对结果显示标准品川贝母是真品川贝母(Fritillaria cirrhosa)，伪品川贝母为伊贝母(Fritillaria pallidiflora)。伪品川贝母的PCR扩增的序列不存在(CCC┆GGG)酶切位点，这也从另一方面验证了此样品为川贝母伪品。因此，由生物污染与动植物分子识别研究室提供的伪品川贝母可用于下面的实验。

[1] 张文娟,刘薇,魏锋,等.聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法用于检定川贝母掺伪情况的研究[J].药物分析杂志,2014,34(10):1830-1835.

本试验设计了不同底物量梯度，酶切体系仍为20 μL，以求得到适于酶切的最低底物量。由图4可知，当底物质量在200 ng及以上时，即底物质量浓度为10 ng·μL-1时， 100～250 bp之间有2条清晰可辨的DNA条带，而当底物量低于200 ng时，酶切条带不清晰，不足以支持药典相关描述。在最适底物质量浓度下产物可以完全被酶切完，这是掺假试验的前提。

[3] 潘莉,徐道华.川贝母的真伪鉴别[J].中国药业,2008,17 (20):56-57.

[4] 刘薇,张文娟,程显隆,等.中药川贝母质量控制方法研究 [J].亚太传统医药,2015,11(2):41-46.

空气质量指数(Air Quality Index，简称AQI)是定量描述空气质量状况的无量纲指数。针对单项污染物的还规定了空气质量分指数(Individual Air Quality Index，简称IAQI)。参与空气质量评价的主要污染物为细颗粒物(PM10)、可吸入颗粒物(PM2.5)、二氧化硫(SO2)、二氧化氮(NO2)、臭氧(O3)、一氧化碳(CO)等6项。

[7] 谭莹,张丽华,李明成,等.中药材川贝母DNA指纹鉴定研究[J].中国药学杂志,2011,46(1):14-16.

[6] 雷艳辉,李会军,李萍.川贝母药材生物碱成分HPLC-ELSD特征图谱的研究[J].中成药,2014,36(7):1477-1481.

[8] 徐传林,李会军,李萍,等. 川贝母药材分子鉴定方法研究[J].中国药科大学学报,2010,41(3):226-230.

本次实验选择的100例患者的资料来源于一项皮肤疣随机对照临床试验入选冷冻治疗组的患者。本次实验方案得到医院委员会批准，对患者的资料的收集也得到患者的许可。年龄＞18周岁，学历在初中以上。其中，男56例，女44例，平均年纪（31±8）岁，平均患病时长（2.2±1.5）年。实验中选择的患者均排除其他病理影响。

[9] XIN G Z,LAM Y C,MAIWULANJIANG M,et al.Authentication of Fritillariae cirrhosae bulbus by RAPD-derived DNA markers[J].Molecules,2014,19(3):3450-3459.

[10] 朱永宏,李学敏,韩宝玲.RAPD技术在中药材鉴定中的应用进展[J].中草药,2007,38(9):1443-1444.

[11] WANG C Z,LI P,DING J Y,et al.Simultaneous identification of Fritillariae cirrhosae bulbus using PCR-RFLP analysiss[J].Phytomedicine,2007,14 (9): 628-632.

[12] 李萧涵,李明成,周亭亭,等.中药材川贝母标准品特异DNA指纹片段的克隆及鉴定[J].中国药学杂志,2016,51(8):616-619.

“视频资源”栏目向读者提供丰富的网上公开课资源，包括文学、历史、文化、社会科学、名人访谈、礼仪与技巧、休闲娱乐、哲学心理等类型，而且随着平台的建设，视频资源日益丰富。

[13] 罗焜,马培,姚辉,等.基于ITS2序列鉴定川贝母及其混伪品基原植物[J].世界科学技术(中医药现代化),2012,14(1):1153-1158.