喹诺酮类抗菌药是人工合成的含喹诺酮基本结构的抗菌药，亦称为吡酮酸类或吡啶酮酸类抗菌药。此类抗菌剂作用于DNA专一位点上，当回转酶转移到药物结合位点时，形成一个三级复合物，阻碍回转酶的移动，从而产生较强的杀菌作用。近年的研究表明，喹诺酮结构的化合物具有良好的抗HIV活性[1]，而且通过对母核上不同位置的取代转换可以得到许多高活性的先导化合物，这些化合物还具有抗病毒、抗肿瘤、降血压等作用[2-5]。因此，以喹诺酮为核心结构单元的衍生物一直是药物学家关注的重点。

图1 48个化合物的结构示意图 Fig.1 Structure diagrams of 48 compounds

三维定量构效关系(3D-QSAR)使用数学模型来研究分子结构和分子生物活性之间的定量关系，是药物研究中的常用手段[6]，这种方法间接地反映了药物分子与大分子相互作用过程中两者之间的非键相互作用特征[7]，与传统的二维定量构效关系(2D-QSAR)相比具有更明确的物理意义和更丰富的信息量。应用最广泛的三维定量构效关系方法是CoMFA (Comparative molecular field analysis )和CoMSIA(Comparative molecular similarity index analysis )，即比较分子场方法和比较分子相似性方法[8-9]。本文使用Topomer CoMFA[10]，即第二代CoMFA对喹诺酮类化合物进行QSAR研究，克服了人工叠合小分子的过程，采用自动叠合规则的易位体技术，其模型创建快速简便，且建模结果可信，并基于Topomer search技术设计了具有高活性的12个喹诺酮类化合物，为新药合成提供了理论参考。

每个客户、每个区域都不一样。比如，在吉林三岔河库、蔡家库，农民更需要农资和农机服务；在辽宁，农民对贷款的需求呼声更高；在内蒙古，订单农业连片种植业务开展更快。根据不同地理环境、农民实际需求和市场趋势，“粮圈儿”可以把服务做到每户农民家里，不再“大水漫灌”。

1 实验部分

1.1 数据来源与分子结构构建

本研究的48个喹诺酮羧酸类抑制剂分子取自文献[11]，图1为48个喹诺酮羧酸类抑制剂的分子结构示意图，表1为化合物的化学结构与活性数据。IC50为达到50%抑制效果时抑制剂的浓度，将其转化为pIC50作为分子的活性标度。48个化合物的三维结构由SYBYL-X2.0软件包中的SKETCHMOLECULE画图模块构建，然后采用Powell能量梯度法、Tripos分子力场对所有小分子进行优化[12]，得到分子的最低能量构象，对分子荷载电荷为Gasteiger-Hückel电荷[13]，Maximum Iterations最大迭代次数设置为1 000，能量收敛梯度值设为0.005 kcal/mol，其余参数均采用SYBYL-X2.0默认值[14]。

表1 化合物的结构及活性值 Table 1 Structures and pIC50 values of inhibitors used for modeling

CompoundNo.R1R2R3/R7R4/R8R5/R6R9Pred.pIC50Exp.pIC50A1------7.307.15B2HHHH--5.796.103*HClHH--6.106.354ClHHH--6.396.205FHHH--6.306.376*MeHHH--5.976.187OMeHHH--5.936.048CF3HHH--6.146.329ClHHCl--6.436.1510*HClHCl--6.606.1711ClClHH--7.166.69C12HH--Me-5.646.2913ClCl--Me-7.086.8814ClCl--Et-7.517.4315*ClCl--Pr-7.267.26

(续表1)

CompoundNo.R1R2R3/R7R4/R8R5/R6R9Pred.pIC50Exp.pIC5016ClCl--iPr-7.597.3317ClCl--Bu-7.197.3618ClCl--CH2CO2H-7.507.5619*ClCl--CH2CH2CO2H-7.427.3520ClCl--CH2CONH2-7.467.6621ClCl--CH2CH2CONH2-6.947.2822ClCl--CH2CH2NH2-6.677.2423*ClCl--CH2CH2OH-7.687.4724ClCl--CH2CH2CH2OH-7.117.3525ClF--CH2CH2OH-7.367.2026FCl--CH2CH2OH-7.627.47D27*ClClFHH-7.087.2728ClClHHF-7.607.4729ClClHFH-7.477.2730ClClHHOMe-7.927.8131*ClClHHCl-7.377.2732ClClHHMe-7.397.2733ClClHHCF3-6.176.2734ClClHHCN-7.307.2735*FClHHOMe-8.057.47E36----H(S)-Me7.837.6337----H(R)-Me7.427.6438----H(S)-Et8.057.7439*----H(S)-Pr8.098.1240----H(S)-iPr8.098.1341----H(S)-tBu8.228.1642----H(S)-Cyclohexyl8.258.2743*----H(S)-ph8.018.2544----OMe(S)-Pr8.248.2445----OMe(S)-iPr8.148.1446----OMe(R)-iPr7.848.1347*----OMe(S)-tBu8.248.1648----OMe(S)-Cyclohexyl8.178.27

*test set

1.2 Topomer CoMFA模型

Topomer CoMFA是基于Topomer与CoMFA的联合技术，改进了第一代CoMFA方法中需手动叠合分子[15-17]的做法，能够在短时间内快速、准确预测化合物的活性并构建3D-QSAR模型。采用Topomer技术将整个配体分子切割成两个或两个以上的小片段，所切割形成的小片段会自动生成三维构象的碎片，碎片根据一定的经验规则进行调整，生成Topomer模型。一般q2>0.5，r2>0.6，即表明统计结果所建模型是比较理想的Topomer CoMFA模型[18-19]。本研究中，将48个喹诺酮类化合物分成训练集和测试集，将整个数据集的分子生物活性从低到高依次排列，采用隔四挑一法将36个化合物定义为训练集，12个化合物定义为测试集。计算每个分子片段周围的立体场和静电场参数，作为自变量，以IC50的负对数(pIC50)为建模响应值，采用偏最小二乘法(Partial least squares method,PLS)实现模型拟合[20]，模型的内部预测能力由留一交互验证法检验，模型的外部预测能力由外部测试集验证[21]。本文所得q2、r2计算公式如式(1)、(2)所示。

(1)

式中，Ypred、Yobs、Ymean分别表示pIC50预测值、实验值和平均值。

(2)

由表2中模型3的q2、r2及值知模型3是比较理想的Topomer CoMFA模型。图2显示了化合物训练集和测试集实验值与预测值的相关图，从图中可以看出所有样本均匀地分布在45°直线附近，证明所建模型具有良好的拟合能力。

1.3 虚拟筛选

Topomer CoMFA能自动构建3D-QSAR模型，预测化合物活性，在本研究中，以活性最高的42号分子为模板，采用2种方式3种切割手段对化合物进行切割(表2)。其中N为主成分数,q2为交互验证系数，r2为非交叉相关系数,为模型外部验证的复相关系数，SEE为标准估计误差。模型1和模型2采用的切割方式为“Split in two”,模型3采用的切割方式为“2”。其中蓝色表示Ra基团，红色表示Rb基团，绿色表示公共骨架。从表2可以看出，3个模型的主成分数分别为4、1和2，标准估计误差(SEE)分别为0.412、0.213及0.351，非交叉相关系数(r2)均大于0.6，交互验证系数(q2)均大于0.5，说明此3个模型均具有较好的拟合与内部预测能力；模型外部验证的复相关系数分别为0.812、0.796及0.878，表明模型均具有良好的外部预测能力。综合分析，模型3不仅具有良好的外部预测能力，而且切割方式可以较好地保留喹诺酮类化合物的核心骨架，更有利于核心骨架与R基团的选择，因而后续研究均采用模型3作构效分析及分子设计。

1.4 分子对接

采用SYBYL-X2.0中的Surflex-Dock进行分子对接，对接所使用的蛋白酶晶体结构来源于RSCB PDB数据库(RCSB Protein Data Bank，https://www.rcsb.org/structure/5COK)[25]，晶体结构的PDB ID为：5COK，对接模式为Surflex-Dock(SFXC)，在对接前需对蛋白进行处理，从复合物中提取配体，删除不需要的配体及所有水分子，给蛋白加氢加Gasteiger-Hückel电荷，设定距离配体分子5 Å范围内的所有氨基酸残基为活性口袋进行叠合，然后将活性最高的42号化合物与蛋白晶体进行对接。通常用Total-Score、Crash和Polar打分来评价对接结果。Total-Score为总的打分函数，表示受体与配体的亲和能力，打分越高越好。Crash绝对值越接近零，表示配体与受体对接时的不适当程度越小。Polar为极性函数得分，当结合位点位于分子表面时，打分越高越好；当结合位点位于分子内部时，打分越低越好。

表2 Topomer CoMFA建模结果对比 Table 2 Topomer CoMFA modeling results

ModelCutting methodNq2r2r2predSEE140.7010.8270.8120.412210.6320.7180.7960.213320.7900.8900.8780.351

2 结果与讨论

2.1 Topomer CoMFA模型结果分析

Topomer search[22]是基于3D配体的虚拟筛选工具，它可以命中训练集中未出现过的化学结构类型，可靠地进行基于配体的虚拟筛选。其原理为：首先指定活性最高的化合物作为模板结构进行分子切割，得到分子片段，然后在数据库中基于R基团搜索技术寻找形状相似的化合物，通过比较其Topomer相似性和阈值进一步打分，用模型预测其对活性的贡献。采用Topomer search技术在ZINC数据库中对切割的R基团进行虚拟筛选[23]，Topomer最大距离设置为185.0，其余参数均采用SYBYL-X2.0默认值[24]。

图2 实验值与预测值的线性回归图 Fig.2 Linear regression diagram between the predicted activities and experimental activities

式中，Yobs为样本观测到的生物活性值，Ypred为活性的模型估算值，Ytraining为训练集样本生物活性的平均值。

图3 Topomer CoMFA立体静电场三维等势图 Fig.3 Contuor map of Topomer CoMFA steric and electrostatic fields A:steric contour map of Ra(Ra立体等势图)；B:electrostaticcontour map of Ra(Ra静电等势图)；C:steric contour map of Rb (Rb立体等势图)；D:electrostaticcontour map of Rb (Rb静电等势图)

2.2 3D-QSAR分析

以42号分子为模板，其Topomer CoMFA模型的三维等势图如图3所示，其中图3A和3C分别为Ra，Rb的立体场三维等势图，图3B和3D分别为Ra和Rb的静电场三维等势图。在图3A和3C中，绿色的区域表示引入体积较大的取代基有利于化合物活性的提高，黄色的区域表示引入体积较小的取代基有利于化合物活性的提高；在图3B和3D中，红色区域表示引入带负电性取代基有利于化合物活性的提高，蓝色区域表示引入带正电性取代基有利于化合物活性的提高。

基于模型3，采用Topomer search技术在ZINC数据库中的drug-like分子库中(其中有130 000个化合物)，以Ra和Rb为提问结构，通过筛选，从数据库中得到1 320个Ra结构片段，1 000个Rb结构片段。在这些分子结构片段中挑选出R基团活性贡献值高于42号模板分子的Ra和Rb结构片段，选择Ra_Score最大的6个基团和Rb_Score最大的3个基团，根据排列组合原理，分别交替取代Ra和Rb基团，进行分子设计，共设计了18个新的喹诺酮羧酸类化合物。按照以上化合物的构建方法，在SYBYL-X2.0中构建新分子的三维结构，然后优化、命名，用模型3预测其活性，18个新设计的化合物结构和预测活性值(pIC50)见表3。

从以上分析可以看出，在Ra附近的苯环C-1位引入小基团负电荷、在苯环C-2位引入大基团负电荷及在Rb位进入大体积正电荷均有利于化合物活性增加，即在绿色区域引入大基团或在黄色区域引进小基团，在红色区域引入负电荷基团或在蓝色区域引入正电荷基团，均有利于化合物活性增加。

还有就是《杂文月刊》编者和作者的关系，较其他报刊密切得多。有个最突出的客观事实，就是作者给编者投稿之后，电话联系，一接就通。且能得到编辑老师亲自回复。如“稿件已收到，感谢赐稿”“初拟×月发”，即使不能用，也会告知“此稿发不了”，有时还能告知发不了的原因。这就一下子拉近了编者和作者的文友关系，即使这次没发，也心甘情愿地继续为贵刊撰稿。这与某些报刊的编辑，稿件发送后就石沉大海，电话十回九不通，甚至还常有丢失作者稿件、不尊重作者劳动的现象，有天壤之别。

在加快融媒体融合改革的过程中，一些地市媒体大胆创新，实行采编与经营分开、事业产业分开，打破僵化的用人和分配制度，激发全体员工的积极性，内部活力显著增强。浙江省余杭晨报社规范新媒体管理体制，并建立绩效评估机制，在原有的机制及体制上进行创新，与时俱进，提出了新的思路，同时从制度上给予保障。福建省闽南日报社对报纸记者与网站记者实行统一招聘、统一培训、统一发证，定期轮岗交。用人制度的创新，既推动了采编人员观念上的融合，也提高了报网采编人员的业务能力，有力地推进了“全媒体人才”的培养。

由图3A可以看出，在R1取代基的位置上有大片黄色区域，说明在此处引入小基团的取代基有利于活性的提高，如化合物10(pIC50=6.60)在R1取代基的位置上用—H取代了化合物6、7、8和9上(pIC50=5.97，5.93，6.14，6.43)的—CH3、—OCH3、—CF3及—Cl取代基，活性明显提高；化合物4(pIC50=6.39)在R1取代基的位置上用—Cl取代了化合物5上(pIC50=6.30)的—F，也相对提高了活性；由图3C可以看出，R9取代基被大块绿色区域覆盖，说明在此位置引入大体积的基团有利于分子抑制活性，例如41号分子(pIC50=8.22)在R9位置上引入较大的—tBu基团取代了化合物36、37、38和39(pIC50=7.83，7.42，8.05，8.09)上较小的—CH3、—CH2CH3及—Pr取代基，活性明显增大；46号分子(pIC50=7.84)在R9位置上用—iPr基团取代了化合物47(pIC50=8.24)上较大的—tBu取代基，活性明显降低。

2.3 分子设计

研究发现A会计师事务所在合并之后CPA的人数不断增长，员工的专业水平和独立性都有了提高，事务所的业务收入综合排名都有提升，非标审计意见的数量也有所增加，表明审计质量有所提高，但是审计质量提高的幅度较小，事务所的合并对审计质量的影响还不是很显著，非标审计意见比例这个指标体现得最为明显。但由于选取的衡量指标较少，数据样本的有限，可能结论会有一定的局限性。

由图3B看出，R1和R2附近有大片红色区域，表示在该位置引入带负电荷的基团有利于分子活性提高，比如11号分子(pIC50=7.16)在R1和R2取代基上用—Cl取代了2号分子(pIC50=5.79)R1和R2取代基上的—H，活性显著增加，而且11号分子(pIC50=7.16)的活性大于3～10号分子的活性(pIC50=6.10，6.39，6.30，5.97，5.93，6.14，6.43，6.60)，再比较10号分子(pIC50=6.60)在R2取代基上用—Cl取代了3～9号分子(pIC50=6.10，6.39，6.30，5.97，5.93，6.14，6.43)上的—H，活性显著增大，在苯环的C-4、C-5、C-6附近出现了大块蓝色表明可以在该区域减小基团的电负性，有利于化合物活性的提高；图3D中蓝色区域代表引进带正电荷的基团有利于化合物抑制活性增加，如42号分子(pIC50=8.25)在R9位置上引入—Cyclohexyl基团取代了化合物36、37和38(pIC50=7.83，7.42，8.05)R9位置上的—CH3和—CH2CH3，活性显著增大。

表3 新设计化合物的分子结构及预测活性值 Table 3 Molecular structures and predictive activity values of new design compounds

No.StructurepIC50PredNo.StructurepIC50Pred1-18.474-108.211-28.354-118.141-38.324-127.982-48.455-138.582-58.345-148.482-68.295-158.413-78.496-168.14

(续表3)

No.StructurepIC50PredNo.StructurepIC50Pred3-88.426-177.893-98.366-187.86

从表3可知，有12个新设计化合物的预测活性值比模板分子高，可以作为抗艾滋病新药的候选化合物。从新设计化合物分子的结构中可以观察到，其在Ra环基上较多引入了较强的吸电子基团，而且在Rb的位置引入了体积较大的基团，所以化合物的生物活性有所提高。例如，2～9号化合物的Ra位置上有电负性较强的—CN三键和—CO双键，因此具有较模板分子高的生物活性值。而10～12号化合物及16～18号化合物的Ra位置上无强吸电子基团且Rb的位置上取代基的体积较小，故生物活性值均低于模板分子。上述6个化合物活性值低还可能是由于：虽然筛选出的Ra与Rb基团均具有较高的贡献值，但化合物组合后的能量及空间结构不相匹配，阻碍了其活性增大。以上解释均符合Topomer CoMFA模型等势图分析。

图4 氢键相互作用图 Fig.4 The hydrogen bond interaction diagram a:the hydrogenbond interaction between compounds 42(42号分子与蛋白氢键作用图)；b:the hydrogenbond interaction between compounds 4(4号分子与蛋白氢键作用图)；c:the hydrogenbond interaction between compounds 8(8号分子与蛋白氢键作用图)；d:the hydrogenbond interaction between compounds 14 (14号分子与蛋白氢键作用图)

2.4 分子对接结果分析

图4为分子对接的结果，棒状表示配体，线状表示氨基酸残基，黄色虚线表示氢键给体。从图4A可见，42号分子配体与晶体结构中的主要氨基酸残基共形成了3个氢键，与ASP 30、ASP 29和ASN 25形成氢键相互作用，总打分函数(Total-Score)、配体对接进受体时的不适当程度(Crash)和极性打分函数(Polar)分别为4.903 5、-1.506 9和0.012 3。

图4B、C、D分别表示新设计的化合物2-4、3-8和5-14对接到蛋白的活性结合位点的交互作用，黄线表示氢键给体。如图4B所示，2-4与ILE 50、ASP 30、ASP 29、ASN 25及ARG 8形成氢键给体交互作用，总打分函数(Total-Score)、配体对接进受体时的不适当程度(Crash)和极性打分函数(Polar)分别为6.688 7、-3.122 0和1.962 6；图4C显示新设计的化合物3-8与ARG 8、VAL 82、THR 80及ASP 29形成氢键给体交互作用，总打分函数、配体对接进受体时的不适当程度和极性打分函数分别为5.493 3、-0.957 5和1.718 4；图4D显示新设计的化合物5-14与ASP 29、ICE 50、VAI 82及THR 80形成氢键给体交互作用，总打分函数(Total-Score)、配体对接进受体时的不适当程度(Crash)和极性打分函数(Polar)分别为7.892 3、-2.181 3和2.838 2。结果表明，所设计的化合物对接结果是可靠且有益的。所有新设计的化合物均对接进蛋白5COK，比较Total-score、Crash和Polar打分，化合物1-3、4-11，4-12和6-16均具有较高的预测活性，但总打分函数相对较低，因此这些化合物是无用的。虽然使用Topomer search可以获得具有高贡献值的某些片段，但获得的化合物在片段整合后不具有良好的结果，这可能是因为碎片和支架在空间位置或能量上不匹配，证明了分子的局部优化具有有界性，片段和支架之间的合理匹配是药物设计的重要条件。

3 结 论

本文利用Topomer CoMFA方法对48个喹诺酮羧酸类衍生物进行了研究，建立了3D-QSAR模型，并通过Topomer search进行虚拟筛选，设计了12个比模板分子活性高的喹诺酮羧酸类衍生物。该模型通过提供立体场和静电场的可视化图像，直观地揭示了化合物中不同的取代基结构对其活性的影响。结果表明，模型的q2和r2等参数在合理的范围内，且具有较好的统计学结果。利用模板分子与新设计的分子进行对接，探究配体和受体蛋白之间的约束关系，对接结果表明小分子与大分子蛋白的氨基酸残基ASP 30、ASP 29和ASN 25可以形成氢键，说明所建立的模型值得信任，可为设计高活性分子提供理论参考。

马库什权利要求的修改和部分优先权问题探讨............................................................................................柳 冀 01.92

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