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猪细小病毒H株在不同细胞上增殖特性的比较

更新时间:2016-07-05

猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)是引发猪细小病毒病的病原体,可引起胚胎的感染、死亡,母猪不表现比较明显临床症状的繁殖障碍性疾病。目前接种疫苗仍是解决本病的最好方案。为生产出优质的疫苗,需要摸索PPV毒株在不同细胞系上的增殖情况,如不能掌握其规律,生产出足够的抗原,将难以用于生产。PPV只能在猪的细胞和人的某些传代细胞中增殖,且在不同细胞上的生物学特性也不尽相同。通过培养比较,获得培养该病毒滴度高、病变明显的细胞及培养条件,为生产高水平疫苗提供实验数据。

SHEN Fang, SHEN Hong-jian, XING Peng-fei, JIANG Yue, HUANG Shi-ren, ZHANG Yong-wei, WU Tao, DENG Ben-qiang

闽台方言合唱音乐是极具地方特点的歌曲,主要由闽南方言演唱,是闽台地区喜闻乐见的文艺类型。腔韵有着独特的味道。腔韵是地方音乐之灵魂,它是在语言声调与旋律走向、旋律进行幅度对高度统一中,以一定对音列组合方式及旋律形态予以体现的[5]。闽台方言合唱题材丰富,既蕴含着个人情感、也蕴含着一种强烈的族群观念和祖根意识,表现着闽南人民强烈的思想思想。如闽台方言合唱《赛龙舟》,由陆樯作词,骆季超编曲,采用闽南诏安、漳浦龙船歌音调,充满浓厚的生活气息。这首作品是由闽台童谣改编的合唱,民谣风格的特点,将这种高雅艺术变得歌词朴素、通俗易懂,便于人们欣赏和涉足。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病 毒 PPV H株,实验室鉴定、保管和供应,经PK15细胞增殖,-70℃保存备用。

1.1.2 细 胞 ST传代细胞购自中国兽医药品监察所;PK15细胞由哈尔滨兽医研究所提供;猪睾丸、猪肾原代细胞取自初生健康仔猪,无菌取睾丸、肾,按常规方法消化,制备原代细胞。

1.2.3 TCID50测定 96孔微量培养板中每孔加入细胞悬液100μL,将待测病毒液分别作 10-1~10-7倍梯度稀释,每稀释度6孔,每孔加入不同稀释度的病毒液 100mL,细胞对照组加100μL细胞稀释液。置37℃ 5%CO2培养,逐日记录CPE出现孔,观察到120h,按Reed-Muench法计算病毒滴度。

1.1.4 主要仪器设备 CO2培养箱 (HF240型),HealForce公司;细胞培养瓶和96孔细胞培养板,美国Corning公司;倒置显微镜(TS100),Nikon 公司。

1.2 方 法

结果见表1。

2.2 有形成果 调查了对照组和观察组的重症监护病房MDRO感染终末消毒处置资料并列于表2。两组比较显示:所有的缺陷项目(擦拭方式不规范,操作流程不规范,标准预防不规范,医疗废物处置不规范及其合计),均差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

1.1.3 培养基与胰酶 购自GIBCO公司;新生牛血清(NBCS)购自GIBCO公司;胰酶(1:250为GIBCO公司产品。

2 结果与分析

2.1 病变情况

PPV-H株接种ST细胞后24h开始出现病变,细胞出现弥漫性颗粒,36h空斑明显增多,48h左右,细胞出现空斑、拉网、脱落现象。CPE可达80%左右,而同时对照组细胞未出现CPE。PPV-H株接种PK15细胞后24h开始出现病变,细胞出现弥漫性颗粒,40h空斑明显增多,60h左右,细胞出现拉网、脱落现象。CPE可达80%左右,而同时对照组细胞未出现CPE。PPV-H株接种猪睾丸、猪肾原代细胞后24h开始出现病变,细胞出现弥漫性颗粒,48h左右,细胞出现空斑、拉网、脱落现象。72h CPE可达80%左右,而同时对照组细胞未出现CPE。

1.2.2 HA测定 红细胞按实验室常规方法用pH7.2 PBS配成0.6%豚鼠红细胞悬液备用。测定以上4种细胞培养的病毒液的血凝价。

2.2 病毒滴度与血凝价测定结果

1.2.1 病毒增殖 待细胞长至30%~50%单层时,弃去营养液,将毒种接种至试验细胞,吸附1h,换含2%血清的维持液至病毒收获。并同时设未接毒对照细胞,至37℃ 5%CO2培养。每天观察并记录CPE情况,当70%~80%细胞出现CPE时收毒,冻融3次,-70℃冰柜保存备用,按此方法试验3次。

表1 PPV H株在不同细胞上增殖的TCID50和HA

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3 讨论与结论

PPV可在多种细胞上生长并导致细胞产生CPE。本研究采用ST、PK15、猪睾丸和猪肾原代细胞增殖该病毒,找到病毒在细胞上的病变特性和规律,确定收毒最佳时机,比较其增殖能力,对疫苗研制和生产起着极重要作用,为该病防控奠定基础。

选取表面温源加热装置有效加热区域中心点为测量位置。首先将表面温源加热装置升温至目标温度稳定后,用表面温度计温度传感器的感温元件紧密贴附于表面温源加热装置,使其参考端温度与环境温度充分达到热平衡后方可进行测量,每隔1min测量1次,10min内测量11次,分别记录设备示值和标准示值,计算出11组测量结果的平均值,并将设备示值的平均值与标准器实际值的平均值之差作为该仪器当前温度点的示值误差。[1]视实际计量需求,在该点处测完其它相应项目再将表面温源加热装置升温至下一个温度点进行测量。计量点若无特殊要求通常选取整十或整百的温度点。

血凝试验是病毒鉴定和血清学分析的常用手段。PPV对豚鼠红细胞有凝集活性。决定这一特性的是PPV血凝素。PPV凝血活性间接反映其生物活性。为了全面评价不同条件下PPV活性,本研究同时测定病毒含量和其血凝效价。由于PPV增殖需要利用细胞S期的DNA聚合酶。本研究表明PPV接种最佳期是在ST细胞形成30%~50%单层时进行接种,因为这个时期的多数细胞处于细胞合成期,这时细胞多聚酶有利于病毒的复制。另外,牛血清过多会引起免疫猪的过敏反应,用异步法接毒可以降低这种影响,还会保持接毒时细胞的状态稳定。

本研究结果显示,该PPV毒株在ST细胞上出现CPE时间较早,病毒含量和血凝价高,且比其他3种细胞上CPE出现的时间均较早,节省时间和培养成本。因此本试验建议将ST细胞作为增殖PPV-H毒株的首选细胞,这将为疫苗大规模生产提供依据。

参考文献

[1] 殷震,等.动物病毒学[M].第 2 版.北京:科学出版社,1997:1145-1155

[2]殷华平.等.猪细小病毒(PPV)SCl株的分离鉴定[J].黑龙江畜牧兽医,2006,7:63-65.

[3]朱绍辉等.猪细小病毒X株在不同细胞上增殖效果比较[J].东北农业大学学报,2012,6:6-10.

任德强,张立恒,宋新刚
《畜牧兽医科技信息》2018年第4期文献

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