三氮脒属于芳香双脒类，是传统的广谱抗血液原虫药，对家畜梨形虫、锥虫和无形体均有治疗作用，并在国内外市场上具有广泛的运用。由于注射用三氮脒粉末配制后易降解不能长期保存，且用量不准易导致中毒，导致三氮脒中毒的病例频发。重庆布尔动物药业有限公司独立自主研制出一种新制剂三氮脒注射液，具有高度稳定、安全的特性，且在集中化、规模化的预防和治疗疾病的过程中能达到快速、准确的效果。虽然注射用三氮脒已有报道兔、猪、绵羊等药动学的研究，但不同剂型在不同动物中的药动学参数必会有所差异。为指导新药设计和制定临床给药方案提供依据，本试验通过对三氮脒注射液与注射用三氮脒的比较药动学研究，得到准确的数据，为三氮脒注射液在临床上的安全、合理使用提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

高效液相色谱仪：配备自动进样器和紫外检测器，Waters 2695系列(美国Waters公司)，色谱柱：Diamonsil Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。电子分析天平，型号CPA225D(赛多利斯科学仪器有限公司)，涡旋混合器，型号XW-80A(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，高速离心机，1-14 型(德国 SIGMA 公司)，可调微量移液器10～100、1000 μL(德国 Eppendorf公司)。

1.2 药品和试剂

三氮脒对照品(NGL Fine-Chem Ltd, India，批号DA/K/121/12，含量86.9%)；7% 三氮脒注射液(重庆布尔动物药业有限公司研制，规格：100 mL∶7 g)；注射用三氮脒(兰州正丰药业有限责任公司，规格：1 g)。甲醇、乙腈(美国Thermo公司，色谱纯)，磷酸二氢钾、三乙胺、磷酸为分析纯试剂。

1.3 试验动物

重庆大足黑山羊，12只，雌雄各半，6～8月龄左右，体重范围20～25 kg，试验前常规饲养，饮水、饲喂不含任何药物。

1.4 给药与采样

动物按随机交叉试验设计分为2组。试验前测定制剂的含量，按照2010版《兽药使用指南》选择3.5 mg·kg-1体重分别颈部肌内注射三氮脒和三氮脒注射液。

按上述样品处理方法，在0.5 μg·mL-1、2 μg·mL-1、5 μg·mL-1浓度下，平均回收率在(69.55±1.20)% ～(78.77±1.26)% 之间，批内和批间系数均不超过10.0%。由此可知，此血浆处理方法用液相检测方法可靠，重复性好。

1.5 样品处理

三氮脒在山羊体内符合一级吸收二室模型，三氮脒不同时间点血药浓度平均值见表1，GraphPad Prism 5绘制药时曲线见图3，主要药动学参数见表2。

1.6 色谱条件

流动相：0.085 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(含0.1%三乙胺，并用磷酸调节pH至3.0)-甲醇=85:15(V/V)，进样量：40 μL，流速：1.0 mL·min-1，柱温：40 ℃，紫外检测波长: 370 nm。

给药后不同时间点采集血浆样品经处理后，进行HPLC测定，采用3P97药动学软件，用Marquardt法以权重1，1/C，1/C2 3种进行曲线拟合，根据WSS和AIC值判断最佳药动学模型。采用SPSS 20对血药浓度和药动学参数进行方差分析。

1.7 回收率和变异系数

式中:I为城镇居民生活用电量;P为人口因素;A为财富因素;T为技术因素;α为模型系数;ε为误差项;b、c、d为影响因素的指数。

1.8 标准曲线和线性范围

在1.5 mL 的离心管中各加入空白血浆450 μL，后依次加入浓度为250 μg·mL-1、125 μg·mL-1、50 μg·mL-1、25 μg·mL-1、12.5 μg·mL-1、5 μg·mL-1的标准品工作液50 μL，制得三氮脒浓度为10μg·mL-1、5 μg·mL-1、2 μg·mL-1、1 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、0.2 μg·mL-1的血浆样品，涡旋混匀，按血浆样品方法处理后进样分析，以三氮脒色谱峰面积为横坐标(A)，药物浓度(B) 为纵坐标，绘制标准曲线，求得标准曲线回归方程和相关系数。

取三氮脒对照品适量，制成水溶液，采用紫外分光光度计在200～400 nm的波长范围内进行扫描，在251 nm和370 nm均有吸收，而在370 nm处吸收值最大，且此波长靠近可见光范围，对其他杂质吸收比较弱，故选择370 nm作为试验的紫外检测波长。

1.9 样品测定与数据处理

如我校经过飞思卡尔、机器人擂台等比赛，获得了学校、企业等有关方面的投资和建设，建成了相关实验室(飞思卡尔实验室、机器人实验室、周立功单片机实验室等)，促进了实验教学的发展，科创竞赛及学科建设参与实验教学后的情况具体如表1所示，教师在理论教学到实践实验指导中不断发现问题，并加以完善和提高教学方法，通过学科建设、科研项目和实验教学的有机结合，促进教学发展，提高了学生对实验技术方法的研究能力[11]。

2 结果

2.1 药物的紫外吸收光谱

式中：wn为评价指标cn的关联权重，3.2节中已求得；pdm为应急方案epm的实际表现情况与期望值之间的加权主观感知欧式距离；ndm为应急方案epm的实际表现情况与最低要求之间的加权主观感知欧式距离；

图1 三氮脒对照品水溶液紫外扫描图谱

2.2 方法的专属性

在1.6的色谱条件下，三氮脒的保留时间为8.3 min。与血浆中的其他杂质有效分离，峰型对称性良好，无明显拖尾，色谱图如图2。

将已知浓度的标准液加入山羊空白血浆中，配得低(0.5 μg·mL-1)、中(2 μg·mL-1)和高(5 μg·mL-1) 三个样品浓度，按1.5 样品处理方法处理样品，进行HPLC测定；同时分别取浓度为 0.5 μg·mL-1、2 μg·mL-1、5 μg·mL-1三氮脒标准系列溶液进行 HPLC测定，不同浓度样品分别重复5次，以峰面积比计算，求其回收率。每批(日内) 作 5次重复，共作 5 个批次(日间)。计算每批内和每批间的色谱峰面积平均值及标准误，求得各变异系数。

2.3 线性范围

血浆中三氮脒线性回归方程为Y=16816X-1939.5 (r2=0. 9992)，线性范围为0.2～10 μg·mL-1，按信噪比S/N=3为检测限(LOD)，S/N=10为定量限(LOQ)，求得本方法测定血浆中三氮脒检测限为0.1 μg·mL-1，定量限为0.2 μg·mL-1。

2.4 回收率和变异系数

给药前采取空白血浆，给药后0.083 h、0.25 h、0.5 h、0.75 h、1 h、1.5 h、2 h、4 h、10 h、24 h、48 h，每次采血约3 mL，置于肝素钠抗凝管中，3000 r/min离心10 min，用移液器小心吸取血浆于1.5 mL EP管中，每个样品保存两份，置-20 ℃保存备用。

A: 空白血浆；B:三氮脒对照品溶液；C:空白血浆添加三氮脒对照品；D:空白血浆添加三氮脒注射液 图2 三氮脒专属性高效液相色谱图

2.5 血药浓度和主要药动学参数

取500 μL血浆样品，加入750 μL的沉淀剂(乙腈)，立即涡旋混匀，静置后14000 r·min-1离心15 min，吸取上清液，经0.22 μm有机系针筒式过滤器过滤后用于HPLC分析。

从谈话中可以看出，丧偶老年女性表现出更多的顾虑。一是由于传统的对女性在家从父、出嫁从夫、夫死从子的要求。再婚重新进入另一家庭，有可能使养老面临不确定的风险。二是受传统道德习俗的影响，很多子女不同意丧偶老年女性再婚。

表1 单剂量注射三氮脒后各采血点羊血浆中三氮脒浓度(x±s，n=6)

采血时间/h血药浓度/(μg·mL-1)三氮脒注射液组注射用三氮脒组0.0834.822±1.7644.365±1.5680.256.398±1.0966.643±0.3800.57.194±0.7196.180±1.1380.756.986±0.6554.914±0.39615.700±0.7124.250±0.4181.54.564±0.5013.638±0.53922.756±0.5753.046±0.52942.362±0.4032.439±0.25062.095±0.3321.796±0.109101.542±0.0920.996±0.083240.886±0.0700.621±0.046480.543±0.0510.294±0.046

图3 山羊单剂量肌内注射三氮脒注射液与 注射用三氮脒后药时曲线

3 讨论

3.1 方法学

根据紫外扫描结果，在370±2 nm的整数波长范围内，并结合相关文献，选择370 nm作为本试验的紫外检测波长。

试验前查看文献报道三氮脒的流动相，并根据条件比较选择不同流动相，最终选定磷酸盐缓冲液和乙腈作为流动相，并用磷酸调节pH值在3.0左右。经过调整流动相的比例，使保留时间适中并与杂质有效分离，且色谱峰尖锐；在流动相中加入0.1%三乙胺使之先与色谱柱固定相中的硅羟基结合，从而减少三氮脒上的脒基等基团在离子键、化学键等作用导致的峰拖尾；pH值在3.0可以抑制色谱柱中十八烷基硅烷键合硅胶中的硅羟基离子化，减少离子间相互作用、有助于三氮脒分离，形成良好峰型。最终确定流动相为：0.085 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(含0.1%三乙胺，并用磷酸调节pH至3.0)︰ 甲醇=85︰15(V/V)。

血浆中的药物含量是反映动物体内药物浓度的重要指标。为了准确测定血浆中的药物含量，需要完全释放与蛋白结合的药物，并去除蛋白质，同时也可保护仪器性能免受损害，延长色谱柱的使用期限。日常常用的蛋白沉淀剂是甲醇、乙腈、丙酮等与水混溶的有机溶剂，通过与蛋白质分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚。通过筛选最终选择乙腈作为沉淀剂，操作简便并能有效的除去蛋白质，仪器响应值高，测量结果准确。

表2 羊单剂量注射三氮脒注射液与注射用三氮脒后主要药动学参数比较

参数名称单位数值〛三氮脒注射液组(n=6)注射用三氮脒组(n=6)Aμg·mL-111.651±4.6465.343±0.423α1/h1.175±0.3310.604±0.418Bμg·mL-12.173±0.2251.467±0.483β1/h0.031±0.0020.035±0.014ka1/h6.080±2.70719.671±3.952V/f(c)(mg·mL-1)·(μg·mL-1)-14.666±0.5468.061±1.442t1/2αh0.628±0.1841.567±0.610t1/2βh22.442±1.40822.230±6.465K211/h0.255±0.0530.178±0.150K101/h0.143±0.0360.125±0.031K121/h0.808±0.2800.336±0.252AUCμg·mL-1*h77.425±6.71453.960±6.874CL(s)(mg·mL-1)·h -1·(μg·mL-1)-10.657±0.0930.978±0.106Tmaxh0.402±0.1020.223±0.035Cmaxμg·mL-17.631±0.4125.974±0.371t1/2kah0.128±0.0410.037±0.009

3.2 药动学比较

从吸收半衰期(t1/2ka)、分布半衰期(t1/2α)可以看出三氮脒注射液比三氮脒具有缓慢吸收、快速分布的特性，从而保证药物在体内的安全性。试验中三氮脒的达峰浓度(Cmax)为5.97 μg·mL-1、达峰时间(Tmax)为0.22 h与报道大致相符，与三氮脒注射液的Cmax为7.63 μg·mL-1和Tmax为0.40 h比较，三氮脒注射液在体内达到平衡时所需要的时间更长和浓度更高的特点，表明三氮脒注射液的安全性更好，不良反应更少。三氮脒的药时曲线下面积(AUC)为53.96 μg·mL-1*h，与报道三氮脒在治疗急性感染期牛的AUC为49.05 μg·mL-1*h基本相符，而三氮脒注射液的药时曲线下面积AUC增加了23.47 μg·mL-1*h，表明药物在山羊体内的含量更高，作用时间相对延长，起到缓释长效的特点。剂型是影响药物动力学的重要因素，不同剂型的药物在机体内药物动力学特征有所差异。姚龙泉等报道，不同剂型三氮脒在正常动物体内，达峰浓度存在显著差异。通过改变药物的剂型研发具有高度稳定、安全且使用方便的产品将是一种趋势。

城市地铁换乘站距离的平衡性是建筑设计时首要考虑的问题。在一些客流量比较大的城市地铁换乘站中，为了有效避免换乘乘客在行走过程的相互干扰，从而可以提高客流量和客流速度，实际中换乘站经常被建筑设计为单向通道，因为在建筑设计的过程中只考虑到了换乘时的平均距离，而没有加以考虑双向换乘距离以及其平衡性，所以最终使得相同方向的换乘距离存在较大的差异，也有可能会引起部分乘客开始逆行，也给地铁管理增加了一定的难度。

产业集聚在不同的发育程度表现出不同的环境效应，在产业集聚的初期，由于产业间关联疏散、企业之间的网络化协作水平较低，此时产业集聚呈现出较强的负环境效应，表现为污染物排放增加（耿焜，2006）。随着产业集聚水平逐步高级化，产业之间合作逐步深化，通过物质循环、生态效率提高等途径，产业集聚能有效降低资源消耗和减少废弃物排放（Gargava et al.，1996）。当产业集聚发展到高级阶段时，区域资源综合利用网络基本成型，知识和技术的溢出效应有效发挥，产业集聚的负面环境效应最弱，污染物排放强度最低（Šlachtová et al.，1998；张攀等，2008）。

三氮脒注射液以3.5 mg·kg-1肌内注射后，山羊血浆中Cmax可达到7.63 μg·mL-1，在给药后24 h内血药浓度维持在0.89 μg·mL-1，高于对常见原虫的MIC值，因此，推荐三氮脒注射液可按3.5 mg·kg-1剂量注射给药，1 ～2日1次。

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