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牛肌内前体脂肪细胞的分离培养及分化相关基因的表达规律研究

更新时间:2016-07-05

在肉用动物生产中,脂肪组织的沉积和分布与动物生产效率及经济效益关系密切[1]。动物体内的脂肪组织主要包括皮下脂肪、内脏脂肪、肌间脂肪和肌内脂肪四大类[2]。其中肌内脂肪含量是影响牛肉品质的关键因素,对牛肉多汁性、嫩度、风味等食用品质具有重要影响,提高肌内脂肪含量是改善牛肉品质的重要途径[3]。因此,以牛肌内前体脂肪细胞为模型来研究脂肪形成的规律和机制,对于探讨肌内脂肪形成机理、改善牛肉品质具有重要意义。

肌内前体脂肪细胞来自肌内脂肪组织,贴壁培养时其形态为梭形,单层汇合形成后,能分化为成熟脂肪细胞[4]。前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的过程是一个由分化转录因子调控的复杂过程。目前已经确定的分化转录因子主要包括过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptors,PPARs)家族、CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein-α,C/EBPα)、脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase,LPL)、脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding protein,FABP4)和脂联素(adiponectin,ADIPOQ)等。其中PPARγ和C/EBPα是脂肪细胞分化成熟的主要调节基因[5-6],FABP4的功能也涉及肌内脂肪积累的发展[7]。ADIPOQ是调节脂肪细胞的重要功能的信号分子[8],并参与胰岛素敏感激素的调节[9]。脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)是成熟脂肪细胞的特征基因[10],LPL 对脂蛋白的合成及脂滴的选择性吸收具有重要的调节作用[11]

本试验以肉牛为动物模型,建立肌内前体脂肪细胞培养体系,探讨肌内前体脂肪细胞增殖与分化,及分化过程中相关基因的转录表达时序规律,为研究肉牛肌内脂肪沉积的机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DMEM/F12(1∶1)培养基、PBS为Hyclone公司产品;胎牛血清(FBS)为Sciencell产品;油红O、胰蛋白酶、地塞米松(DEX)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、胰岛素(INS)和双抗为Sigma公司产品;Ⅰ型胶原酶购自Gibco公司;CCK-8增殖检测试剂盒为南京诺唯赞生物科技有限公司产品;TRIzol购自Ambion公司;反转录和实时定量试剂盒购自TaKaRa;引物由上海生工合成。

1.2 培养基配方

完全培养基:DMEM/F12+10%FBS+1%双抗;诱导分化培养基:完全培养基+10 μmol/L INS + 0.5 μmol/L IBMX+1 μmol/L DEX; 维持分化培养基:完全培养基+10 μmol/L INS。

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1.3 前体脂肪细胞的原代培养

无菌条件下采集新鲜屠宰的牛背最长肌组织,分别用75%酒精和含双抗的PBS冲洗数次,浸入含双抗的PBS中并带回实验室。在实验室细胞间内,用37 ℃含双抗的PBS冲洗组织样品数次。带入超净台,剥离获取肌内脂肪组织,用PBS冲洗脂肪组织数次,转入培养皿中,剪成约1 mm3的小块,将脂肪组织碎块转入到离心管中,加入2倍体积的Ⅰ型胶原酶消化液,在37 ℃水浴锅中振荡消化60 min后,加入1倍体积的完全培养基,中和胶原酶的消化反应。之后将细胞消化液经200目细胞筛过滤,滤液经1 200 r/min离心10 min,弃去上清液,加入适量完全培养基,吹打均匀,制成细胞悬液,即获得牛前体脂肪细胞。将培养皿转到37 ℃恒温、饱和湿度、5% CO2的细胞培养箱中培养,24 h后更换培养基,之后每2 d更换1次完全培养基。然后对培养细胞进行形态学观察。

1.4 细胞传代培养

细胞原代培养至80%~90%汇合时, 用胰蛋白酶消化液在37 ℃下消化4 min,等体积完全培养基终止消化,1 200 r/min离心5 min,然后按1∶2的比例进行传代接种培养, 并标记为P1。传代培养过程中,每2 d更换1次完全培养基,直至细胞80%~90%汇合后再重复上述操作,标记为P2细胞用于试验。形态学观察同1.3。

依我看翠姨还没有她从前漂亮呢,不过她们说翠姨漂亮得像棵新开的腊梅。翠姨从来不擦胭脂的,而那天又穿了一件为着将来作新娘子而准备的蓝色缎子满是金花的夹袍。

1.5 生长曲线绘制

将细胞悬液按细胞密度为6×103个/孔接种于96孔培养板中,每孔容积100 μL,24 h后(1 d),在每孔中加10 μL CCK-8 溶液,继续培养4 h 后,测定各孔在450 nm波长下的光吸收值,记录结果,之后每隔2 d(第1天至第17天),在同一时间取6孔检测。

1.6 诱导分化及细胞内脂肪含量测定

将细胞悬液接种于6孔板,细胞完全汇合2 d开始诱导分化,并记为分化的第0天,之后每3 d更换1次诱导分化培养基,分化第6天更换为维持分化培养基,待脂肪细胞成熟后,在分化第8天用油红O染色法验证。细胞用PBS洗2次,10%甲醛等渗盐缓冲液固定30 min后,PBS洗3次。油红O工作液染色1 h,蒸馏水漂洗培养板数次,直至完全漂洗干净,倒置显微镜下观察并拍照。之后加入500 μL 异丙醇萃取30 min,于分光光度计510 nm波长处测吸光度。

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分别在分化第1、2、3和8天收集细胞,每个时间点共取3个重复,提取细胞总RNA并纯化,按照TaKaRa试剂盒说明书反转录为cDNA。采用实时荧光定量RT-PCR方法检测牛肌内前体脂肪细胞分化过程中关键基因PPARγ、C/EBPα、FABP4、ADIPOQ、ATGL、HSL、LPL mRNA 的相对表达量。PCR反应体系为10 μL:5 μL SYBR Premix Ex Taq TM,0.2 μL ROX Reference Dye,0.2 μL上、下游引物(10 μmol/L),1 μL cDNA模板和3.4 μL灭菌双蒸水。PCR反应参数为:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,40个循环;60 ℃ 30 s。反应结束后用2-ΔΔct法分析脂肪细胞分化中关键基因的表达情况,以GAPDH作内参。用Primer-BLAST(NCBI)设计引物(表1), 引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列

基因登录号引物(5′→3′)片段长度/bpPPARγNM_181024 2TGGAGACCGCCCAGGTTTGCAGCTGGGAGGACTCGGGGTG111C/EBPαNM_176784 2TGGGCAAGAGCCGGGACAAGACCAGGGAGCTCTCGGGCAG166FABP4NM_174314 2TCCTTCAAATTGGGCCAGGAACCCTTGGCTTATGCTCTCTCA218ADIPOQNM_174742 2TCCTACTTCCACCCTGACTGGGGGGATCTTCCATGTTGTCC132ATGLFJ897536 1TCTGCCTGCTGATTGCTATGGGCCTGGATAAGCTCCTCTT121HSLNM_001080220 1ATTGCCGACTTCCTACGAGAAGTCCGATGGAGATGGTCTG119LPLNM_001075120 1GAGGACACTTGCCACCTCATTACATTCCTGTCACCGTCCA113GAPDHNM_001034034 2TGCCCGTTCGACAGATAGCCGCGACGATGTCCACTTTGCC148

1.8 数据分析

所有试验均设置3个重复,试验所得数据以平均值±标准误表示,运用SPSS 17.0软件中的One-way ANOVA或独立样本t检验进行方差分析与显著性检验,显著性水平定为P<0.05 。

2 结果

2.1 牛前体脂肪细胞原代培养和传代培养的形态学观察

牛背最长肌组织经胶原酶消化分离培养成功获得牛肌肉前体脂肪细胞。刚接种时,细胞质回缩,为小圆球形,呈悬浮状(图1A)。6 h原代培养后开始有少量成纤维细胞样细胞散在贴壁,未贴壁细胞为球形,悬浮在培养液中。培养 24 h,大部分细胞贴壁,细胞形态为小梭型、星型、三角形和不规则形状(图1B),换液除去未贴壁细胞。48 h后换液,细胞生长速度加快,细胞形态向成纤维状生长。传代细胞与原代细胞形态基本无差异,传代培养的细胞成分更均一,形态更一致(图1C)。

A.刚分离的前体脂肪细胞;B.原代前体脂肪细胞;C.传代前体脂肪细胞

图1 前体脂肪细胞的形态(×100)

2.2 CCK-8比色法绘制牛前体脂肪细胞的生长曲线

由图2可知,牛肌内前体脂肪细胞符合体外培养细胞的正常生长规律,生长曲线近似“S”形,即经历潜伏期、指数生长期、平台期和退化衰老期4个阶段。在接种后的第1~5天生长较为缓慢,第5~11天增殖迅速,为对数生长期,此阶段细胞快速繁殖,并于第11天达到峰值。第11~13天为平台期。第13天之后细胞活力开始下降,随后细胞开始衰老死亡。

图2 牛肌内前体脂肪细胞生长曲线

2.3 细胞内脂肪含量测定

[3] Listrat A, Pissavy A L, Micol D, et al. Collagens XII and XIV: Two collagen types both associated with bovine muscle and intramuscular lipid metabolism[J]. Livest Sci, 2016, 187: 80-86.

图3 油红O染色的脂肪细胞(×200)

随后,用异丙醇抽提油红O后测定OD510值,结果表明诱导分化组细胞内脂肪含量极显著高于对照组(P<0.01),与形态学观察结果一致。详见图4。

嘉庆十年(1805年)十一月初五,皇帝“念初彭龄平日官声尚好本日所出右庶子一缺着加恩,以初彭龄补授(示朕终不废弃敢言之臣以期有禆政治至意)”[35],思过一年后,重新起用。此次复出持续了十年之久,是其人生最为辉煌的时期。十二月初十,补授光禄寺卿,负责在实录馆恭阅正本。十二月十九兼署所有副都御史事务。二十参奏监犯兆昌遣人在其家投递禀帖。二十二初彭龄充实录馆总校官。

注:**表示差异极显著(P<0.01)

图4 第8天细胞内脂肪含量

2.4 牛前体脂肪细胞分化过程中标志基因表达情况

牛前体脂肪细胞分化过程中7个标志基因的表达如图5所示,PPARγ、FABP4和ATGL在牛前体脂肪细胞分化的早期就有表达,分化过程中表达量逐渐升高,而且在分化的各个时间段变化差异显著(P<0.05)。C/EBPα在分化的早期开始表达,但表达量较低,而且第2天与第1天相比,差异不显著(P>0.05), 随着脂肪细胞的分化,在分化的后期,表达量明显增加,在分化的第 8天达到最大。ADIPOQ在分化过程中表达量逐渐升高,但分化早期表达量较低,且差异不显著(P>0.05)。HSL在分化早期表达量最高,随着分化过程表达量逐渐下降,分化第8天表达量最低,分化各阶段差异均显著(P<0.05)。LPL在分化早期表达量逐渐升高,且在第3天达到最高值,随后表达量开始下降,分化各阶段差异均显著(P<0.05)。

3 讨论

成功分离培养原代前体脂肪细胞涉及的因素很多,包括取材对象的品种、性别、年龄,取材组织部位,分离时离心力的大小和离心时间,胶原酶消化的时间、培养基的选择等。Lee等[12]用胶原酶消化40 min, 先1 500 r/min离心10 min,再1 796 r/min 10 min获得猪的前体脂肪细胞;Koltes等[13]用胶原酶消化40 min获得牛前体脂肪细胞,Liu 等[14]用2 370 r/min离心10 min获得鸡的前体脂肪细胞。因种属、细胞体积大小等的不同,本试验采用胶原酶消化60 min,1 200 r/min离心10 min成功获得牛肌内前体脂肪细胞,有效地减少了分离过程中细胞的损失,保证细胞数量,提高细胞获取量。

注:小写字母相同表示差异不显著(P>0.05),不同表示差异显著(P<0.05)

图5 牛前体脂肪细胞分化过程中基因mRNA的表达情况

[6] Rosen E D, Hsu C H, Wang X, et al. C/EBPalpha induces adipogenesis through PPARgamma: a unified pathway[J]. Genes Dev, 2002, 16(1):22-26.

细胞活力的检测方法应用较多的是MTT比色法。MTT比色法具有简便、经济、安全等特点,但同时MTT法存在检测稳定性不佳、重复性较差等缺点。而CCK-8比色法灵敏度高、重复性好、检测结果准确性要优于MTT比色法。本试验通过CCK-8比色法检测了前体脂肪细胞的生长曲线,符合正常细胞生长特征。

前体脂肪细胞的分化是诸多转录因子协同作用的结果。有研究表明,PPARγ和C/EBPα在小鼠3T3-L1细胞分化过程中表达显著上调[17]。本研究中,PPARγ基因表达水平呈明显升高趋势,并且在第8天达到最高。C/EBPα在分化早期表达量无显著变化,分化后期表达量则显著升高,表明C/EBPα在分化后期可能发挥重要作用。FABP4是脂肪细胞分化晚期的标志基因[18-19],在分化第8天的脂肪细胞中表达量急剧升高。ADIPOQ 作为脂肪组织分泌的重要因子, 参与细胞分化过程,促进脂滴形成[20-21],本研究中,ADIPOQ 在分化早期表达量较低,随着前体脂肪细胞的分化,其表达量急剧增加,在分化第8天的脂肪细胞中表达量达到最大。ATGL是脂肪动员的关键酶,在脂肪组织甘油三酯分解代谢中发挥至关重要的作用[22],本研究中ATGL在分化过程中表达量逐渐升高,在分化第8天 的脂肪细胞中表达量达到最大。HSL在脂肪分解过程中起着关键作用,本研究中HSL在分化初期表达量最高,随分化过程表达量逐渐降低,这与Harada等的研究一致[23]。LPL在甘油三脂的代谢中起关键作用[24],本研究中LPL在分化早期表达量逐渐升高,在分化后期表达量又随之下降。

渗透检测:利用毛细现象,通过渗透剂覆盖在试件表面来显示放大缺陷痕迹。渗透检测设备简单、携带方便、适合野外工作,适用于陶瓷、玻璃、塑料、粉末炼金等各种材料制造的零部件表面开口缺陷的检测。

4 结论

本研究利用胶原酶消化法成功获得了牛肌内前体脂肪细胞,通过添加多种诱导因子将前体脂肪细胞诱导为成熟的脂肪细胞,转录因子PPARγ、C/EBPα、FABP4、ADIPOQ和ATGL的表达量随着分化过程增强,HSL的表达量随着分化过程逐渐降低,而LPL的表达量在分化早期逐渐升高,分化后期逐渐下降。本试验成功建立了牛前体脂肪细胞原代培养及诱导分化方案,可为深入研究牛肌内脂肪细胞增殖与分化及脂肪沉积机制提供良好模型。

参考文献:

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在他不到一岁的时候,因患小儿麻痹症左脚落下残疾,父亲希望他长大后自强自立,因此给他取名“自立”。他是个性格开朗、乐观向上的人,做事执着认真。上学时学习成绩一直比较好,多次被评为“三好学生”。高中毕业后,由于父亲因病早逝,母亲身体因过度劳累也一直不太好,因此他便毅然决定回到五连,陪伴在母亲身边。

诱导分化第8天的前体脂肪细胞发育成椭圆形或圆形成熟脂肪细胞,脂滴数目增多且体积由小变大,绝大部分细胞脂滴融合,细胞被一个或多个大脂滴占据,培养液中有脂滴分泌物及脱落的细胞。为了证明分化的细胞内确实存在大量的脂滴,本研究采用油红O染色法进行鉴定,由图3B可见,这些颗粒被染成了红色,而对照组(未诱导分化)细胞无明显脂滴集聚(图3A)。

[4] Gregoire F M. Adipocyte differentiation: from fibroblast to endocrine cell[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2001, 226(11):997-1002.

[5] Farmer S R. Transcriptional control of adipocyte formation[J]. Cell Metab, 2006, 4(4):263-273.

目前,对前体脂肪细胞诱导分化的方法各异。Peshdary等[15]用INS、DEX、IBMX、吲哚美辛(IM)对人的前体脂肪细胞进行诱导分化; Chen等[16]采用INS、IBMX、罗格列酮(ROG)和DEX的联合诱导4 d后INS继续诱导前体脂肪细胞。本试验采用INS、IBMX、ROG和DEX的联合诱导6 d后INS继续诱导2 d的方法,第8天观察到大量大脂滴,呈现出成熟脂肪细胞的形态。体外培养条件下前体脂肪细胞的分化时间进程存在差异,可能是与细胞种类、动物的年龄、所用诱导分化的试剂及浓度有关。

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1.7 RNA提取及基因表达检测

由图5可以看出,工艺②的钼粉K含量整体较工艺①的小,较高的温度有利于K元素的升华,而较大的氢气流量在同等条件下,能带走更多的水汽等杂质。但是过高的温度又影响K含量的分离效果[9],较低K含量的MoO3生产的钼粉K含量也相对较低。

一是美味猕猴桃嫁接对萼猕猴桃雄性营养系,亲合力最好,成活率可以达到80%以上,而且嫁接出来的树长势良好,不会出现“小脚”,也没有发现溃疡病感染。嫁接的苗木生产出来的果实口感好,不影响品质。张清明认为,对萼猕猴桃的雄性优系有望成为猕猴桃嫁接砧木首选。由此可以初步确定,美味猕猴桃选用水杨桃嫁接时,应选择水杨桃里边的雄性营养系,并采用高位嫁接法建园(克服“小脚”现象)。

然而,也有其他的影像学以及临床研究得出不一定的结论。在Kim等[17]的研究中共纳入了523名急性脑卒中患者,研究进行了糖尿病相关指标的检测以及颅脑MRI检查,研究没有发现糖尿病明显增加颅内小血管病变的危险性,仅增加了大血管病变的发生率,研究推测糖尿病与LA可能没有直接的相关性。Weinger等[18]应用颅脑 MRI评价脑白质的病变程度,研究结果未能提示1型糖尿病患者与LA的发生有明确相关性的证据,推测1型糖尿病患者与T2DM患者在参与LA形成的病理生理机制上可能有所不同。

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对于已有丰富作战经验的云南顺丰来说,早在几个月前就已进入全面备战状态,确保服务质量“不打折”。除新增投入皮带机、安检机、叉车、智能分拣柜等设备外,还临时增加1300余名非全日制工作人员,昆明市区网点也从平日的“4集4散”调整为“5集5散”,并加密昆明至州市的集散中心往返车辆,保证货物的及时集散。

(3)水资源情况。洞庭湖总蓄水量167亿m3,南汇湘、资、沅、澧四水,北纳松滋河、虎渡河、藕池河、华容河(1958年建闸控制)四口分泄的长江洪水,东接汨罗江和新墙河水,由城陵矶注入长江,见表1。1956—2013年多年平均入湖水量为2 759亿m2,其中四水来水1 655亿m2,荆南三河年均来水846亿m2,区间来水288亿m2。但径流量年内分配不均,季节性水位变化大,多年最大水位变幅达18.77m。汛期蓄水量、湖面是枯期的10倍、5倍以上。

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将配制好的碱液、吸收液和适宜的滴定液分别置自动蒸馏仪相应的瓶中,按照仪器说明书的要求将消化管装入正确位置,关上安全门,连接水源,设定好加入试剂的量(碱液30 mL;吸收液30 mL;水50 mL)、时间、清洗条件及其他仪器参数等,即开始自动蒸馏和滴定。

[23] Harada K, Shen W J, Patel S, et al. Resistance to high-fat diet-induced obesity and altered expression of adipose-specific genes in HSL-deficient mice[J].Am J Physiol-Endoc M, 2003, 285(6):E1182-E1195.

奇招有效,李太嶂一鼓作气,连使头槌,嘭!嘭!嘭!直撞得秦铁崖面色紫胀,连连吸气。李太嶂心头大喜:搜神手呀搜神手,你的龙爪手呢?声名赫赫的龙爪手,只能用来缠对手双肩?太可惜了吧?

[24] Sha H B, Sun SY, Francisco A B, et al. The ER-Associated degradation adaptor protein Sel1L regulates LPL secretion and lipid metabolism[J]. Cell Metab, 2014, 20(3):458-470.

张萌萌,魏胜娟,王艺如,王深圳,郑月英,郑豪,颜培实
《畜牧与兽医》 2018年第5期
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