上游法和PureSperm密度梯度离心法是目前生产上最常用的精子优选方法，本研究首次引用上述2种方法应用于牛性控冷冻精液的生产，通过检测优选精液冷冻后的精子活力、存活时间、顶体完整率、膜完整性、线粒体活性等指标对2种方法的精子优选结果进行评估。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

BoviPureTM100、BoviDilute和BoviWashTM100(Nidacon)；NaHCO3、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、MgCl2、KCl、NaCl、Na2HPO4，丙酮酸钠、葡萄糖、乳酸钠和BSA(Sigma，St Louis，USA)。

光信号经光耦合器1分为两路光信号，其中一路在振动传感光纤中传输，另一路在参考光纤中传输，两路信号在耦合器2处合成一路光信号输出。当没有局部干扰时，耦合输出的光信号为稳定的干涉信号；存在局部干扰时，在振动臂传输的光信号受干扰发生相位延迟使得干涉光信号发生改变，进而得到干扰信息。

1.2 TALP染色液配方

10 mmol/L NaHCO3，40 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，0.4 mmol/L MgCl2，3 mmol/L KCl， 95 mmol/L NaCl， 0.3 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L丙酮酸钠，5 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L 乳酸钠，0.3%BSA。

1.3 采精、运输和原精保存

选取内蒙古赛科星繁育生物技术(集团)股份有限公司种公牛站健康成年种公牛，采用假阴道法进行采精。原精到达实验室后，使用50 μm的滤器过滤，检测密度、活力，选取密度大于6×108/mL、死精率45%～60%的原精置于18 ℃恒温箱中保存待用。

1.4 PureSperm法处理精液

分离液配制：配制40%顶层分离液和80%顶层分离液，然后按如下步骤操作：分别将2.5 mL BoviPureTM底层分离液、2.5 mL BoviPureTM顶层分离液注入锥形离心管，保证上下层间液面清晰；将精液注入离心管顶部，不能弄混之前的分离液；室温下，300 g离心10 min、移去上层分离液和大部分下层分离液；将最底层精液吸出，注入带有1 mL BoviWashTM洗液的锥形离心管(15 mL)，混匀；室温下，300 g离心5 min，吸弃上清液；用TALP液把底部精液稀释(浓度为200×106/mL)。

由于模型桩尺寸和试验条件的限制,本试验采用的摄像头为红外微型摄像头,可在黑暗环境下采集图像.该摄像头分辨率为640×480,摄像频率为30帧/s.摄像头安装在桩身一侧的支架上,并贴有减震材料以防桩体贯入时摄像头抖动而影响成像质量(见图2).摄像头通过数据线与电脑相连,利用图像采集软件将沉桩过程中观察窗口观测到的图像以视频格式保存下来.最后将采集获得的图像在Matlab中进行处理,利用MatPIV图像工具箱运算得到桩-土界面土体位移场.通过对平移后的图片进行位移计算验证了相关图像获取和计算方法的可行性和精度.

1.5 上游法处理精液

[2] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB 4143-2008牛冷冻精液[S]．北京：中国标准出版社，2008：5-6.

1.6 性控冻精生产

按照性控冻精生产流程[1]进行精子染色、分离、冷冻保存。

1.7 性控冻精品质评估

[1] 李喜和.家畜性别控制技术[M]．北京：科学出版社，2009：68-73.

1.8 数据统计

PureSperm法处理后与对照组相比，死精率下降了11.51%，差异显著，但分离速度提升不明显，冷冻后活力下降7%、存活时间下降0.75 h，与对照相比差异不显著，可能反复离心操作会对精子造成一定损伤[4]，不利于后续精子染色、流式细胞仪分离等操作。此外，PureSperm试剂盒价格昂贵，单支成本显著增加，无法在牛性控生产大规模推广 。

2 结果

2.1 PureSperm法、上游法对分离精子活力、存活时间的影响

由表1可知，原精对照组和PureSperm法处理组在使用流式细胞仪分离后，死精率出现显著差异(P<0.05)，解冻后活力、存活时间下降但无显著差异(P>0.05)；上游法处理后死精率下降但无显著差异(P>0.05)、分离速率差异显著(P<0.05)，解冻后活力、存活时间均无显著差异(P>0.05)。

ESR检测：空腹采集患者静脉血，1.6 mL静脉血加入到0.4 mL含109 mmol/L枸橼酸钠溶液的真空管中，混合均匀后放入Monitor-100型自动红细胞沉降率分析仪（美国Monitor公司产品）的检测位，静置30 min后自动报告结果。正常值参考范围：1～20 mm/h。

表1 PureSperm法、上游法对分离精子活力、存活时间的影响

组别分离后死精率/%分离速率/(103·s-1)解冻后活力存活时间/h对照24 96±8 62a4 07±0 53a0 38±0 14 34±0 61PureSperm法13 45±3 13b3 89±0 77a0 31±0 13 59±0 58上游法17 2±2 17a4 76±0 24b0 40±0 044 50±0 55

注：同列肩标无字母或字母相同表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同

2.2 上游法处理后分离精子解冻后的质膜完整性、线粒体活性和顶体完整率

参考文献：

表2 解冻后精子膜完整性、线粒体活性、顶体完整率

组别膜完整性线粒体活性顶体完整率对照0 22±0 020 43±0 080 61±0 03上游法0 26±0 030 47±0 080 61±0 03

1. Rcodamine滤光片； 2. FITC滤光片； 3. 自然光

图1 荧光显微镜下观察精子膜完整性(×1000)

图2 无线粒体活性(A)和有线粒体活性(B)精子染色形态(×1 000) 图3 部分缺失(A)和完整(B)精子顶体染色形态(×1 000)

3 讨论

比较对照组和经PureSperm法、上游法处理后精液在流式细胞仪分离后死精子比例、分离速率、解冻后活力、存活时间、膜完整性等指标，采用SPSS 16.0进行方差分析。

上游法与PureSperm法相比可有效提升精子分离效率并能保持精子活力、顶体完整性和线粒体活性的生理机能，可应用于性控冻精生产。

1984年美国的Parrish等首次采用上游法分离牛的精子进行体外受精，发现可使受精率由46%提高到59%，这一发现在许多实验室得到证实并广泛应用。上游法主要利用活动精子的游动能力，从而与死精子(活力低的精子)、未成熟的精子、畸形精子、白细胞等物质自行分离，由于纯物理作用而使精子重新分布，故理论上不影响精子的生物学特性。而Ren等[5]对上游法和PureSperm法的优选结果进行对比研究显示，经上游法处理后，精子活率及受孕率均高于PureSperm法。本试验显示，上游法处理原精后，死精率呈下降趋势(24.96% vs 17.2%)，分离效率与原精相比提升17%，解冻后活力(0.38 vs 0.40)及解冻后存活时间(4.34 h vs 4.50 h)有提升，但均无显著差异，上游法处理后与原精相比顶体完整率(61% vs 61%)、线粒体活性(0.43 vs 0.47)、膜完整性(0.22 vs 0.26)均无显著差异。由于上游法是利用精子自身运动特性的原理而设计的，上游过程中可以脱离精浆中某些不利于自身的物质，使精子在体外存活时间得以延长，从而提高精子的受精能力。

为进一步验证上游法对精子受精能力的影响，检测精子膜完整性、线粒体活性、顶体完整率结果见表2。上游法处理组与对照组相比无显著差异(P>0.05)。图1 Rcodamine滤光片下显示的是被PI染成红色的膜不完整精子，FITC滤光片下显示的是被6-CFDA染成绿色的膜完整精子；图2显示无线粒体活性(A)和有线粒体活性(B)精子染色形态；图3显示部分缺失(A)和完整(B)精子顶体染色形态。

性控冻精解冻后检测精子活力、37 ℃条件下存活时间、质膜完整性、线粒体活性、顶体完整率指标。精子活力检测方法参照GB 4143-2008[2]；37 ℃条件下存活时间检测方法：每隔0.5 h检测记录精子活力，直到视野内无直线运动精子；精子质膜完整性、线粒体活性、顶体完整性检测方法参照文献[3]，根据精子所染荧光颜色区分精子膜是否完整、线粒体是否具备活性以及顶体完整率。

基底节区高血压脑出血在临床上发病率高,残疾和死亡率高,严重危害人类健康。高血压患者基底节颅内出血可发生在短时间内,血肿压迫周围脑组织,造成脑缺血缺氧,产生严重神经损害,需及时手术治疗,尽早清除血肿[1]。本研究分析了微创穿刺引流术在基底节区高血压脑出血患者治疗中的应用及效果,报告如下。

使用60 mL注射器按顺序先吸取15 mL TALP液,再缓慢吸入5 mL密度为100×106/mL的精液(操作要点：不使用针头，精液保持在底部不能吸入TALP液中)，盖上注射器针帽，注射器底部垂直向下静止放置于37 ℃水浴中30 min，去掉注射器针帽，缓慢推动注射器推杆弃掉底部精液4～5 mL，保留剩余上清液约15 mL，室温下360 g离心5 min，吸弃上清液，用TALP液稀释底部精液(浓度为200×106/mL)。

[3] 白修云,王有柱, 李向臣 ,等. 哺乳动物精子质量检测原理及方法[J]. 中国畜牧兽医，2007， 34(9)：24-28.

“真的啊？那你可是我女儿的学长咯，她年底就要来悉尼大学报到了。”提到她女儿时，她的眼里如同能放出光芒般神采飞扬。“她学习成绩可好了，省重点熊猫班前三……”

[4] O W S, Chen H，Chow P H．Male genital tract antioxidant enzymes—their ability to preserve sperm DNA integrity[J]. Mol Cell Endocrinol，2006，250(1)：80-83.

[5] Ren S S，Sun G H，Ku C H．et al.Comparison of four methods for sperm preparation for IUI[J]．Arch Andeal,2004，50(3)：139-143.

e-tron和e-tron Sportback之后，奥迪将推出第三款电动车型—e-tron GT。e-tron GT概念车于2018洛杉矶车展全球首发，量产版计划2020年底前实现量产。作为保时捷Taycan的同平台车型，奥迪e-tron GT的技术由奥迪与保时捷合作开发完成，由奥迪旗下负责高性能车型的子公司奥迪运动有限公司负责量产。概念车的前后轴各配备一台电动机，系统功率590马力，0～100公里/小时和0～200公里/小时加速分别仅需3.5秒和12秒，电池组容量超过90千瓦时，WLTP标准下续航里程超过400公里。