免疫学检测是实现药物残留快速检测的主要手段，获得可行的检测用抗体是关键。目前，以单链抗体为代表的重组抗体技术为抗体制备提供了新的途径。单链抗体(single-chain antibody)又叫单链抗体可变区片段(single-chain antibody variable fragment，ScFv)，是由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段连接肽(Linker)连接而成[1]，分子量为27～30 ku，是抗原特异性结合的最小功能单位。其免疫原性远小于单克隆抗体，具备有高特异性的特点，而且在制备过程中能够较为容易地控制抗体的亲和力和特异性，因此在免疫学检测和医学研究方面得到了广泛应用[2]。

氯霉素(chloramphenicol，CAP)作为一种高效广谱抗生素，曾经因为抗菌效果明显、价格低廉而被广泛运用于临床疾病治疗，但临床研究表明，即便是微量的氯霉素残留也会给人或动物构成很大的威胁[3]。美国食品与药物管理局(FDA)指出，由于氯霉素对人体的影响无法控制，所以不能制定安全标准。在美国、加拿大、欧盟，CAP被列入法定禁用兽药，禁用于产肉动物、蜂蜜、动物饲料等；2002年我国农业部也将CAP列入禁用药，作为进出口常规检测中的必检项目[4]。探究氯霉素残留的快速、灵敏、准确的检测手段一直是科研工作者研究的重点。本试验利用基因工程方法原核表达了具有免疫活性的抗氯霉素ScFv蛋白，为今后建立以单链抗体技术为支撑的氯霉素药物残留快速筛检方法奠定试验基础。

1 材料与方法

1.1 主要生物材料

NdeⅠ、XhoⅠ限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、DNA Marker购自Fermentas公司；pET-24a载体、Wizard DNA Clean-up System、抗His标签鼠单克隆抗体购自美国Promega公司；大肠杆菌 BL21大肠杆菌感受态细胞购自康为世纪公司；Yeast Extract及Tryptone为OXID公司产品；其他生化试剂均为国产分析纯级；pGEMTeasy-CAPScFv、氯霉素偶联产物CAP-OVA由本实验室保存。

1.2 引物设计

参照文献[5]，根据已扩增的氯霉素单链抗体基因(CAPScFv)序列，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成扩增ScFv的特异性引物，序列如下：F：5′-TACATATGATGGCCCAGGTGAAACTG-3′(NdeⅠ)；R：5′-GCTCGAGTTCTGCGGCCGCCCGTTT-3′(XhoⅠ)。

1.3 ScFv片段扩增

以实验室保存的pGEMTeasy-CAPScFv质粒为模板，合成的上下游引物进行PCR扩增， PCR反应体系按常规比例配成50 μL，反应程序为：95 ℃ 4 min；95 ℃ 40 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃ 10 min，取5 μL PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4 ScFv原核表达载体构建

以前期制备的氯霉素偶联产物CAP-OVA按照每孔2.5 μg的剂量包被ELISA板，1∶5 000稀释的HRP标记抗His标签鼠单克隆抗体为二抗，检测倍比稀释的纯化后CAPScFv，每个稀释度做3个重复(n=3)。同时设PBS空白对照和OVA阴性对照。

值得注意的是，在保险方面，中老年游客根据自身身体健康情况建议额外购买高额的补充险，包含海外救援的保额较高的意外险。特别是在一些欧美等发达国家，医疗费用相对较为高昂，随着游客年龄的增加，保额也会相应降低，因此建议选择保额较高，适合中老年游客的意外保险，这样可以给我们的出行带来一定的保障。

随着科学技术的快速发展，人们的生活方式、学习方式、娱乐方式等都发生了翻天覆地的变化，同时各国之间的利益关系也变得微妙起来，尤其是发展中国家的快速发展更是对国际力量产生了重要影响。与此同时，中国面临的国际形势越发严峻。另一方面，我国仍处于社会主义初级阶段，这是我国最大的国情，距离实现中华民族伟大复兴还有很长的一段路要走。在这样的环境下，中国共产党保持党的先进性，领导中国人民走向共同富裕、民族复兴成为重要内容，所以，重视党的建设成为新时期中国共产党的关键任务。[2]

1.5 CAPScFv的原核表达

以pGEMTeasy-CAPScFv为模板，通过PCR技术扩增获得了带有NdeⅠ、XhoⅠ酶切位点的ScFv片段，如图1。

1.6 CAPScFv免疫活性检测

NdeⅠ、XhoⅠ双酶切ScFv的PCR纯化产物，回收后与同样经NdeⅠ、XhoⅠ双酶切的pET24a载体连接，连接体系与程序参考载体说明书进行，连接产物按照常规方法转化筛选鉴定，获得经酶切鉴定正确的重组质粒pET24a-CAPScFv，同时送英潍捷基(上海)贸易有限公司完成测序测定。

2 结果

2.1 ScFv片段扩增

阳性菌pET24a-CAPScFv于37 ℃培养至OD600为0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，37 ℃继续培养5 h，诱导后的菌体经PBS缓冲液悬浮，超声波破碎菌体，破碎后离心，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE，确定目的蛋白表达情况，并参考文献[6]进行表达蛋白的纯化，设置pET24a空载体作对照。

M. DL1000 DNA分子质量标准；1. ScFv PCR扩增产物；2. 阴性对照

图1 ScFv的PCR扩增产物

2.2 ScFv原核表达载体构建与鉴定

纯化后ScFv PCR产物与pET24a载体分别经NdeⅠ、XhoⅠ双酶切后连接，产生重组质粒pET24a-CAPScFv，重组质粒经NdeⅠ、XhoⅠ双酶切后可释放出预计大小的插入片段(图2)。随机挑取2个重组质粒进行序列测定，与预期序列同源性为100%。

M: DL5000 DNA分子质量标准；1: NdeⅠ、XhoⅠ双酶切pET24a-CAPScFv

图2 pET24a-CAPScFv酶切鉴定

2.3 CAPScFv的原核表达

pET24a-CAPScFv在37 ℃、1 mmol/L IPTG诱导培养5 h后，经超声裂解进行SDS-PAGE分析，与空载体相比，在27.5 ku处出现了预期大小的蛋白，并以包涵体形式存在。经尿素变复性纯化后可见特异性单一条带，结果如图3。

海归新生代企业家受西方教育，深知关注每个个体意愿表达的重要性，他们愿意引导每人去设计属于他们自己的一份令人有持续不断工作动力的职业生涯规划。西方企业的组织是对工作有着同样热情的个体的集合，加入到这个群体是因为兴趣所在，此时一份能让人不断提高能力的工作便是有吸引力的，每个人都会乐意去规划自己职业生涯。但处于中国情境下，对工作拥有源源不断的热情的人毕竟是少数，个体的意愿并不是要在工作中取得骄人的成绩，或者虽然想要有好的结果，但看到要为之努力的职业生涯规划时，又失去了恒心与耐力，强制性的职业生涯规划就显得管理模式刻板，给予员工的人文关怀不够，不够了解员工心声。

2.4 CAPScFv免疫活性检测

相关研究结果表明，甘氨酸是分子量最小、侧链最短的氨基酸，可增加侧链的柔性，丝氨酸可增加亲水性[7-8]。因此本研究选取目前构建单链抗体基因片段(ScFv)最为广泛的Linker序列(Gly4Ser)3，即由重复的4个甘氨酸和1个丝氨酸构成的15个氨基酸短肽。从诱导表达及活性检测结果显示，运用该链接可以稳定地表达ScFv，而且未改变ScFv的空间构象，表达蛋白有生物学活性。

M. 预染蛋白质分子量Marker；1. pET24a诱导表达产物；2. pET24a-CAPScFv诱导表达产物；3. pET24a-CAPScFv 诱导表达产物沉淀

图3 pET24a-CAPScFv诱导表达产物的SDS-PAGE分析

表1 间接ELISA初步鉴定CAPScFv免疫活性结果(OD490)

纯化CAPScFv稀释倍数11∶211∶221∶231∶241∶251∶261∶271∶281∶29OVAPBS12 7922 6661 9901 9681 7491 7011 0230 8380 5200 4210 0360 01922 7012 6821 9261 9151 7551 6981 0100 8510 5350 4230 0400 02032 7362 7531 9761 9601 7421 7001 0440 8320 5300 4330 0330 019

3 讨论

间接ELISA检测结果如表1，结果表明，表达的CAPScFv能特异性结合氯霉素偶联产物CAP-OVA(P/N> 2)，具有免疫活性。

获得特异性好、亲和力强的抗体是建立免疫学检测方法和免疫治疗的前提。单链抗体具有结合位点单一、分子量小、免疫原性低和易在大肠杆菌中表达等特点[9]，因此是目前报道较多的一类小分子抗体，但其应用主要集中在疾病诊断和治疗方面，对于农兽药残留检测方面的研究较少。本文在前期构建好的氯霉素ScFv基础上，利用重组DNA技术获得了CAP的原核表达载体，并表达了具有免疫活性的ScFv，为今后建立以单链抗体技术为支撑的氯霉素药物残留快速筛检方法奠定了基础。进一步将多个单链抗体基因借助分子生物学手段串联表达，可避免传统单克隆抗体检测目标单一的缺点，有望开发多特异性单链抗体为基础的药物残留检测方法。

4444)组成,每天给予量为每千克0.5克;(2)其余的氮供给由7%-11.4%的氨基酸溶液(广东利泰制药股份有限公司,国药准字H20068014)供给;(3)并且给予患者适当的维生素,保证水电解质的代谢平衡,将补给的总量配制1.5升,然后对患者行静脉输注。

统一存储和分布式存储是实现大数据平台的基础 把先前分散存放在各个服务器上的数据统一存放在磁盘阵列上，实现统一存储。磁盘阵列通过器件冗余、RAID重构、硬盘坏道检测修复和快照等技术，保障数据的安全。同时，统一存储也可以配置备份存储，对数据进行定期增量备份或者异地灾备。由于实施了统一存储，各个应用所需要的磁盘空间可以“统筹规划，按需分配”，彻底解决单台服务器磁盘空间不足或者过剩的问题。智慧校园将使用统一存储，为SAN、NAS和iSCSI提供多层存储。统一存储支持基于块访问协议（如FCP和iSCSI）和基于文件访问协议（如CIFS和NFS），并使用相同的管理工具和管理界面。

参考文献：

[1] Blažek D， Celer V. The production and application of single-chain antibody fragments [J]. Folia Microbiol, 2003, 48 (5)：687-698.

[2] 秦丽莉, 张春明. 单链抗体研究进展及其在医学中的应用[J]. 国外医学(放射医学核医学分册),2005(6):53- 54.

[3] Li P,Qiu Y,Cai H,et al. Simultaneous determination of chloramphenicol, thiamphenicol, and florfenicol residues in animal tissues by gas chromatography/mass spectrometry[J]. Chin J Chromatogr，2006, 24(1):14-18.

再看财政科研支出这一块。列举两年的数据为例，1996年财政科学研究支出为348.6亿元，占财政支出比重和占GDP比重分别为4.39%、0.51%，2002年财政科学研究支出为816.22亿元，占财政支出比重和占GDP比重分别为3.70%、0.75%。将其与西方国家的科研经费支出进行横向比较发现我国科研支出依然不足。科研支出占GDP的比例、财政支出的比例和人均科研投入都不高。即使是这些不足的科研经费投入究竟有多大比重是真正用于研发以及产生了多大效益都无从得知。

内蒙古农业可持续发展的制约因素与发展对策分析…………………………………………………………………… 郑文哲（135）

[4] 吴永宁,邵兵,沈建忠.兽药残留检测与监控技术[M].北京：化学工业出版社，2007：379.

[5] 陆辉, 左伟勇, 王健, 等. 抗氯霉素单链抗体基因扩增与序列测定[J]. 江苏农业科学, 2013, 41(10) :28-30.

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