鸭沙门菌病(duck salmonellosis)又称为鸭副伤寒，是鸭的一种急、慢性传染病，主要由于鸭感染了一种或几种沙门菌而引起。大多数情况下，沙门菌发生在幼年的鸭群体中，成年鸭感染沙门菌常属隐性感染，但也会出现严重的临床疾病并伴有高死亡率。

1994年黄炳坤等[1]曾报道，5日龄的病鸭，初期发病率为19.3%，死亡率为9.5%；中期发病率为28.9%，死亡率为14.3%；后期发病率为49.9%，死亡率为32.9%。2003至2004年，欧盟国家鸭群中沙门菌的感染率为4.8%～57.2%[2]。在越南，沙门菌在成年鸭中感染率为8.8%～24.7%，死鸭胚中沙门菌的分离率是3.2%～31.7%[3-4]。2005年Tsai等[5]对台湾100个鸭场的调查结果显示沙门菌的感染率为4.6%。近年来，全国各地在鸭沙门菌病的研究中发现，沙门菌可以造成鸭病的原发、继发以及混合感染，而且越来越严重，这对养鸭业造成较大威胁。不仅如此，沙门菌在全国范围内造成了严重的食源性污染，有人报道中国细菌性食物中毒70%～80%由沙门菌引起[6-7]。国内相关统计也表明在所有食物中毒中，最为常见的食物中毒是由沙门菌所引起，占据食物中毒首位，约占细菌性食物中毒的42.6%～60%[8] 。全球每年有 1 200万～3 300万人感染伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌并引起全身性疾病，造成22万～ 60万人死亡[9]。每年约有13亿人因感染其他血清型沙门菌引发胃肠炎，其中死亡人数约300万[10]。我国是世界第一的禽生产和消费大国，年饲养量超世界总饲养量的75%。研究鸭源沙门菌在我国已引起各界学者的广泛重视[11]。本研究从徐州及周边地区养鸭场、临床病例和鸭肉产品中分离鉴定出沙门菌56株，通过血清学分型和分子分型，初步掌握了徐州及周边地区不同来源鸭沙门菌的流行特征及进化关系，为进一步开展防治工作奠定了研究基础。

新乘务员上岗之前，一般经历4个培训阶段。一是军训阶段：按照军人的要求进行严格训练、锻炼吃苦耐劳的精神，培养良好的作风和生活秩序，为做一名合格空乘打下坚实的基础。二是理论学习阶段，时间一个月左右。主要学习英语、航空理论与航空技术知识、航空气象、形体、健美操等。三是实际操作阶段（专业训练），时间一个半月。主要是客舱服务、各种机型教学、紧急救治等。四是思想政治教育，主要进行时事政治教育。空乘人员在飞机上的活动空间有限，服务重复单调，国内航线反复起降，国际航线劳动量大，时间长。有些乘客的素质可能你也听说了，所以要求空乘人员有一定的耐心和心理承受能力。

1 材料与方法

1.1 样品采集

参照Visscher等[12]方法无菌采集徐州市段庄、西苑、湖滨等12个菜场和6家大型超市的鸭肉及其副产品300份；从徐州丰县、沛县、铜山三个地区6个规模化养鸭场随机采取不同日龄肉鸭泄殖腔拭子、粪便以及饲料和用具等样品380份；2014至2015年，从不同鸭场无菌采集临床具有沙门菌症状鸭的肝、脾、盲肠等脏器50份冷藏保存。

1.2 参考菌株

大肠杆菌ATCC25922、肠炎沙门菌ATCC13076由扬州大学传染病实验室保存。

1.3 主要试剂

[7] Tsen H Y, Hu H H, Lin J S, et al. Analysis of the Salmonella typhimurium isolates from food-poisoning cases by molecular subtyping methods[J]. Food Microb, 2000, 17(2):143-152.

1.4 沙门菌的分离培养

虽然分子分型的方法很多，但由于ERIC-PCR方法具有耗时短、成本低、多态性好、分辨率高等诸多优点，既克服了脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型中的昂贵设备投入，又弥补了随机扩增多态性DNA(RAPD)分型中随机引物的繁琐筛选试验带来的不确定性，被学者们广泛采纳[14,18]。21株沙门菌进行ERIC-PCR分子分型，分成18类基因型，遗传相似性在59%～100%，结果显示：不同来源相同血清型的沙门菌遗传距离有明显的差异，此分型方法能够快速地对动物源性沙门菌感染、食源性沙门菌污染进行溯源调查，一旦发现，快速分型跟踪，对动物生产、食品的质量安全有重大意义。

1.5 生化鉴定

取一只装有 2 mL灭菌生理盐水的指型管，用接种环从平板上挑取可疑沙门菌菌落至无菌生理盐水中，充分研磨后制成细菌悬液。按照生化鉴定条的操作步骤进行12种生化反应测定。

1.6 血清学试验

采用玻片凝集试验，参照Kauffman-White(1996年)血清学的分型方法进行沙门菌菌体(O)抗原及鞭毛(H)抗原的鉴定。

我国的农业生产一直坚持着“高投入、高产出”模式，耕地长期高强度、超负荷被利用，耕地质量呈现出中低产田比例高、耕地退化比例高、污染耕地占比高、有机质含量低、新补充耕地等级低、基础地力低的态势。土壤修护已经刻不容缓。如何在土壤修护事业上大步前进，怎样打造基层土壤修护服务体系，探索中国现代化农业可持续发展的服务模式是全社会共同关注的话题。

1.7 PCR鉴定

参考相关文献[13]，针对invA基因设计引物，目的片段大小为185 bp，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列：F:5′-CTTTGGTCGTAAAATAAGGCG-3′；R:5′-TGCCCAAAGCAGAGAGATTC-3′。按照试剂盒的方法提取DNA模板，进行PCR反应，反应体系为25 μL：2×Buffer 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/mL)1 μL，模板2 μL，双蒸水8.5 μL。反应条件如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测。

1.8 ERIC-PCR分型

参考Albufera等相关文献[14-15]合成ERIC引物，引物序列如下：ERIC R:5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，ERIC F:5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。将纯化的沙门菌按照试剂盒提取DNA模板，进行PCR反应，反应体系为25 μL：2×Buffer 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/mL)1.5 μL，模板2 μL，双蒸水7.5 μL。反应条件如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 50 s、45 ℃ 1 min、72 ℃ 3 min；30个循环；72 ℃ 10 min，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果

2.1 分离培养与染色镜检

[5] Tsai H J, Hsiang P H. The prevalence and antimicrobial susceptibilities of Salmonella and Campylobacter in ducks in Taiwan[J]. J Vet Med Sci, 2005, 67:7-12.

2.2 生化鉴定

其中P(Wk|Cj),为模式Wk在电子邮件中的占比，|D|为该类邮件的训练数N(Wk,di)为模式Wk在dt中所出现的次数，|V|为该类特征下对应的所有模式总和。

根据之前广大学者的研究我们发现，对于推迟法定退休年龄这一政策的看法，社会各界人士主要持两种观点。第一种观点为支持者所提出，首先，他们认为随着现代社会科学技术的进步、人们生活水平的提高，我国人均寿命已经有所提高，这导致了我国人口结构的变化，因此推迟退休年龄是更好地利用社会资源的需要；其次，随着我国人口老龄化现象日趋严重，推迟法定退休年龄有利于国家财政弥补养老金缺口。另一种观点为反对者提出，他们主要站在就业形势严峻的角度，认为推迟退休年龄会增加就业压力，对劳动力市场产生冲击。

其中：e1,e2,e3分别为误差信号的积分、误差信号，误差信号的微分；α1,α2,α3是非线性因子。值也取为：α1=0.5,α2=0.25,α3=0.125；β21,β22,β23分别为误差的积分的增益，误差的增益，误差的微分的增益。

2.3 PCR检测

用沙门菌invA基因特异性引物对分离菌进行PCR扩增，结果见图1。阳性菌株扩增的DNA片段与预期片段大小基本一致，表明分离菌均为沙门菌。

经过上述筛选与匹配，在2339家沪深A股上市公司中，最终获得597家上市公司的785个对外直接投资观测值，该比例远远超过毛其淋和许家云 （2014）［14］等学者的工业企业数据库的匹配比例，说明上市公司的对外直接投资更为积极，具有重大的研究意义。本文按照通常做法，对连续变量前后1%进行温莎处理。

2.4 血清型鉴定

对56株沙门菌进行血清型分型，共鉴定出53株的血清型，占分离菌株的94.6%。分属6个不同的血清型，主要分布在B群有22株：鼠伤寒沙门菌5株，印第安纳沙门菌15株，阿贡纳沙门菌2株；C1群有2株，均为彼茨坦沙门菌；D1群有26株,均为肠炎沙门菌；E1群有3株，均为鸭沙门菌见表1。

c.风险观念的差异.我国企业的管理者重视稳定和规则，缺乏创新精神和竞争意识;而西方管理文化通常倡导冒险，积极进取，勇于变革.

M.DL1000Marker；1. 分离菌；2. 阴性对照

图1 PCR鉴定结果

表1 不同来源的 53株鸭沙门菌血清型及分布情况统计

血清型鸭产品鸭场临床病例鼠伤寒沙门菌(O4)7 7%(2/26)12 5%(3/24)鸭沙门菌(O10)7 7%(2/26)4 1%(1/24)印第安纳沙门菌(O4)16 7%(1/6)15 4%(4/26)41 7%(10/24)肠炎沙门菌(O9)66 7%(4/6)61 5%(16/26)25%(6/24)阿贡纳沙门菌(O4)8 3%(2/24)彼茨坦沙门菌(O7)8 3%(2/24)

2.5 ERIC-PCR分型

用NTSYSpc2.1软件对PCR结果(图2)进行聚类分析，采用非加权算术平均组对法(UPGMA)做树状图，聚类分析树状图见图3。通过聚类分析，21株沙门菌分离株的遗传相似性在59%～100%之间，分为18类基因型。印第安纳沙门菌、阿贡纳沙门菌和鼠伤寒沙门菌(都为O4血清型)的遗传相似性在76%～100%之间，鸭沙门菌(O10血清型)和彼茨坦沙门菌(O7血清型)的相似性为69%，肠炎沙门菌(O9血清型)相似性在74%～100%，不同来源相同血清型的沙门菌遗传距离有明显的差异。

M.DL2000 Maker;P1-P4.来源于鸭产品;F1-F7.来源于鸭场;C1-C10.来源于临床病例

图2 21株鸭沙门菌的ERIC-PCR指纹图谱

图3 21株鸭沙门菌的ERIC-PCR指纹图谱聚类树状分析

3 讨论

本研究对徐州及周边地区6个鸭场采集的肛拭子、粪便以及饲料和用具等、临床具有鸭沙门菌病变特征的病鸭脏器及超市和市场鸭肉及产品进行沙门菌分离，不同来源的样品分离率和血清型有较大差异。共分离到56株沙门菌，鉴定出53株的血清型，以肠炎沙门菌和印第安纳肠炎沙门菌为主。结果显示分离来自市场的鸭产品和鸭场的沙门菌以肠炎血清型为主，与王茂起等[16]2001年、张秀丽等[17]2006-2007年的调查研究结果相似。而发病鸭以印第安纳血清型为主，其次才是肠炎血清型，推测目前徐州养鸭环节中主要流行的是致病性较低的肠炎沙门菌。

本试验结果表明：市场和超市总共采集300份样品，分离到6株，以肠炎沙门菌为主(4/6，66.7%)，分离过程中发现靠近肛门附近的鸭肉及产品沙门菌分离率相对较高，推测可能是由于在屠宰过程中被粪便污染的原因。6个鸭场，其中5个为徐州佳合禽业发展有限公司下属或合同养殖场，总共采集了300份样品，分离到17株，分离率5.7%，血清型以肠炎为主；1个为个体养殖场，采集80份样品，分离9株，分离率11.25%，血清型以印第安纳为主，还有肠炎、鼠伤寒和鸭沙门等血清型。说明个体养殖场沙门菌存在的血清较复杂，在饲养管理及疾病防控方面，与大型连锁养殖企业存在差距。临床分离50份样品，分离到24株，分离率48%，血清型以印第安纳为主，其次是肠炎，临床病鸭的分离率最高，而且包含的血清型最多。分离过程发现，4—5月份的病鸭最易分离到沙门菌，而7—9月份相对分离率较低，可能由于夏天气温高，鸭病死后尸体迅速腐败，不利于细菌的生存有关。

分别称取采集的鸭肉、饲料、粪便25 g，无菌条件下粉碎后置于225 mL BPW中，37 ℃培养10 h进行前增菌，取10 mL增菌液加入150 mL SBG选择性增菌培养基中，37 ℃培养24 h；鸭肛拭子、棉拭子于10 mL SBG选择性增菌培养基中，37 ℃培养24 h；临床鸭脏器于150 mL SBG选择性增菌培养基中，37℃培养24 h。用接种环沾取少量SBG菌液三区划线在沙门菌显色培养基表面培养上，同时采用沙门菌参考菌株和大肠杆菌参考菌株做对照。疑似菌落涂片、革兰染色、镜检。

对分离到的56株疑似沙门菌进行生化试验，绝大部分菌株的生化反应结果一致：靛基质试验、氰化钾试验(氰化钾对照生长，氰化钾不生长)、尿素酶试验、水杨苷试验、丙二酸盐试验、ONPG试验阴性；山梨醇试验、赖氨酸脱羧酶试验、甘露醇试验、卫矛醇试验阳性，符合沙门菌属的生化特征。

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随着保护地面积的逐年扩大和多年连作的影响，土传病害日益严重，而目前对土传病害的防治，还没有特效药。采用嫁接育苗技术，是把栽培的蔬菜嫁接到抗病性强的砧木上，是减轻土壤传染病害的最有效措施。如用黑籽南瓜等嫁接黄瓜，可防治枯萎病、菌核病等土传病害，用野生茄等嫁接茄子可防治茄子黄萎病。同时也利用砧木根系发达、抗病、抗寒、耐热、耐湿、吸肥力强等特点，能使嫁接的蔬菜生长健壮，对不良环境抵抗能力增强，从而收到早熟、增产的效果。

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从鸭肉及其产品、鸭场和病鸭脏器共分离到56株沙门菌，其中：市场及超市产品共分离到6株沙门菌(命名为P1～P6)，鸭场共分离到26株沙门菌(命名为F1～F26)，优势血清型均为肠炎沙门菌；临床发病鸭分离到24株(命名为C1～C24)，优势血清型为印第安纳沙门菌和肠炎沙门菌。沙门菌显色培养基上呈现边缘整齐、中间微隆起的紫色菌落，经革兰染色后，镜检见革兰阴性小杆菌，大小均一，多散在、无芽胞，无荚膜。

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Cary-Blair半固体运送培养基、BPW增菌液、SBG增菌液、沙门菌显色培养基、改良马丁培养基、LB液体培养基、肠杆菌科细菌生化管鉴定系统购自青岛海博生物技术有限公司；沙门菌属诊断血清购自宁波天润生物药业有限公司；革兰染色液购自杭州天和微生物试剂有限公司；Taq DNA polymerase、dNTP mixture(2.5 mmol/L )购自宝生物(大连)有限公司；DNA 快速抽提试剂盒、DL1000、DL2000 Marker购自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

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研究中间品多样性和制造业产品创新能力的关系时，必须考虑到企业产品创新对中间品的进口行为具有反向作用，提高创新性产品的生产能力需要进口新颖的中间产品，进而形成进口中间产品的多样性。双向因果关系易引起内生性问题，导致估计结果准确性不高。为了避免和减弱内生性干扰，使用在时间序列模型与面板模型里常用的滞后期工具变量方案。工具变量的选择具有两个要求：

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“王爷，白荷有个不情之请。”我说，“你每日吩咐下人备的补汤我喝不惯那个味，明天开始我可不可以不再喝了？”

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