七氟烷具有血气分配系数小、诱导和苏醒较快、呼吸道刺激小、血流动力学稳定的特点，被越来越多地应用于临床麻醉。而目前关于吸入麻醉药的作用机制尚未阐明。1994年Franks提出膜蛋白质作用学说，认为吸入性麻醉药可作用于离子通道而产生麻醉，如 Na+、K+、Ca2+电压门控型通道等[1]。有研究[2]表明，L型钙通道CaV1.2蛋白参与调节快速眼动睡眠和疼痛，慢性疼痛状态的维持需要对基因表达的调节，这种表达依赖于钙的流入，钙离子内流通过神经元L-型电压门控钙通道（LTCC）起重要作用，特异性敲除CaV1.2使机械性痛觉过敏反应性增加。初步认为脊髓背角的L型钙通道在疼痛的处理过程中发挥一定作用，慢性神经病理性疼痛的维持具体取决于CaV1.2[3]；在血管平滑肌中，睾酮通过阻断L型Ca2＋通道而产生舒张作用[4]。这些均说明L型电压依赖性钙通道CaV1.2参与了镇静、镇痛、肌松的过程。基于此我们推测CaV1.2可能与七氟烷麻醉有关，本研究通过对大鼠七氟烷麻醉状态下CaV1.2蛋白的改变，探讨七氟烷麻醉作用机制。

因此，在确定体育赛事权属的同时，如何分配体育赛事转播权所产生的收益，也是需要明确的一大法律问题；而这一问题又与垄断问题密切相关。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

40只清洁级成年雄性SD大鼠，体重（200±20）g，由兰州大学医学院实验动物中心提供，该实验遵循了相关部门制定的有关实验动物保护和使用的指南，并通过了兰州大学医学院实验动物中心伦理委员会批准。大鼠饲养环境保持清洁安静，温度维持在22℃～25℃，湿度维持在55%～58%，给予大鼠自由进食和饮水。将大鼠按随机数字表法分为对照组（control）、七氟烷 1h 组（sevo1h）、七氟烷 2h组（sevo2h）、七氟烷 3h组（sevo3h）和七氟烷 4h（sevo4h），每组 8 只。

BCA蛋白浓度测定试剂盒购自中山金桥；CaV1.2和GAPDH抗体购自 Abcam（Cambridge，UK）。免疫组化ABC试剂盒购自武汉三鹰。

1.2 实验方法

各组均采用1.5MAC左右（气体浓度监测仪为Datex-ohmeda产品）的七氟烷（瑞沃德；型号：R511-22）进行维持麻醉[5-6]。打开麻醉机（北京易世恒），向麻醉箱内预充七氟烷3min，之后将大鼠放入自制麻醉箱中，每次1只，先以2MAC快速诱导，使用大夹尾钳测试看大鼠是否进入麻醉状态（翻正反射消失），从放入麻醉箱开始记录每个大鼠翻正反射消失的时间[7-8]，以1.5MAC左右七氟烷进行麻醉维持，按分组分别麻醉1h、2h、3h和4h，control组大鼠给予空气复合氧气。记录麻醉中大鼠生命体征，麻醉期间注意大鼠的保温。麻醉结束后，从大鼠心尖取血0.5mL行动脉血气分析（分析仪型号：RADIOMETER，ABL90）[9]，以排除缺氧及二氧化碳蓄积造成的影响。

1.3 实验大鼠大脑组织形态学观察

麻醉结束后，每组取5只大鼠进行心脏灌注：取出大鼠固定于手术台上，持续吸入七氟烷，固定四肢，打开胸腔暴露心脏，用止血钳固定心脏，将针头垂直刺入左心室，再从右心耳剪一切口，先泵入速率为25r·min-1，待右心耳处流出的液体接近无色，灌注4%多聚甲醛，灌注速率30r·min-1，待鼠尾出现卷翘，降低灌注速率为15 r·min-1，灌注10min。灌注结束之后，生理盐水冲洗灌注泵，进行下一只动物的灌注固定。将灌注好的大鼠断头取脑，剥离全脑，进行标记，放入4%多聚甲醛进行24h固定，然后放入20%蔗糖2~3d，再转至40%蔗糖3~4d，直至沉底。处理后的大脑组织在恒温冰冻切片机下进行20μm厚的连续冠状切片并及时行贴片，存于-20℃保存待用，用于HE染色和免疫组化检测。

麻醉结束后，剩余3只大鼠快速断头取脑，冰上操作，取其大脑皮层区于-80℃冻存。提取蛋白，依次经过组织匀浆、超声、4℃、12000r·min-1、30min离心后，取上清使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量，加入相应的loding buffer与β-巯基乙醇混匀煮5min，8%SDAPAGE变性凝胶电泳，浓缩胶使用恒压90V，30min，分离胶120V、90min，经湿转250mA、2h恒流转至PVDF膜上；5%脱脂奶粉室温封闭120min；加入CaV1.2一抗（1∶200；CaV1.2，Abcam 批号：ab84814）4℃封闭过夜；第2天加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗室温孵育90min，ECL显色，用软件Image pro plus 6.0分析灰度值。用目的蛋白灰度值除以GAPDH灰度值计算大脑皮层组织中CaV1.2蛋白表达。

翻译工作坊实施之后，每组同学要求撰写翻译心得与反思。从学生的反馈来看，学生较为认同翻译工作坊的教学模式，纷纷表示能从翻译实践中不断体会到翻译所涉及的因素以及翻译的策略与标准，从而真正地参与到翻译实践中。由理论指导实践，又从实践中验证理论的指导性。

各组大鼠麻醉诱导时间（翻正反射消失的时间）、呼吸、心率、血压和血氧饱和度（SpO2）差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。各组大鼠麻醉结束后心尖取血行动脉血气分析，结果各组大鼠血pH值、PCO2、PO2和HCO3-差异均无统计学意义（P均＞0.05），表 2。

1.4 Western blot检测大脑皮层组织中CaV1.2蛋白表达

用水总量方面，2013年全市实现GDP 14 500亿元，同比增长11.97%，工业增加值达到5 889亿元。在全市经济保持持续增长的情况下，近三年来用水总量基本持平并呈下降趋势，全市原水供应总量由2011年的19.55亿m3下降到2013年的19.07亿m3，下降2.5%。2013年全市自来水供应总量为15.91亿m3，与2011年相比下降1.49%。

1.5 统计学方法

Western blot检测结果显示，随着七氟烷麻醉时间的延长，大鼠大脑皮层组织中CaV1.2蛋白表达量呈下降趋势（P＜0.05）；sevo3h与 sevo4h组大鼠大脑皮层组织中CaV1.2蛋白表达量均低于 control组（P＜0.05），且 sevo3h组高于 sevo4h组（P＜0.05），见图 2。

2 结果

2.1 七氟烷麻醉大鼠麻醉诱导时间及生命体征、血气分析结果

1.3.2 免疫组化ABC染色法分析大脑皮层区CaV1.2阳性细胞表达情况 0.01mol·L-1PBS冲洗脑组织切片，4%多聚甲醛固定15min及山羊血清（A液）封闭液孵育1h，进行固定和封闭；加入兔抗 CaV1.2（1∶200）一抗 4℃过夜；次日 0.01mol·L-1PBS反复清洗后，依次加入（B、C液），之后进行酒精脱水、封片，光学显微镜下观察大脑皮层区CaV1.2阳性细胞表达情况。

 

表1 各组大鼠麻醉诱导时间及血压和心率的变化（x±s）

  

组别n诱导时间/s心率/（次·min-1）呼吸/（次·min-1）收缩压/mmHg sevo1h 8 110±15.73 316±0.78 89±1.45 126±1.23 sevo2h 8 108±17.13 320±0.76 87±0.81 130±0.65 sevo3h 8 112±10.48 318±0.89 90±0.70 134±0.98 sevo4h 8 109±12.20 325±0.99 87±0.76 125±0.90 F值 1.176 2.333 2.680 2.049 P值 0.336 0.096 0.066 0.130舒张压/mmHg 88±1.15 80±0.54 83±0.78 86±0.89 2.680 0.066 SpO2/%98±0.81 98±0.55 98±0.40 98±0.44 1.333 0.283

 

表2 各组大鼠麻醉末动脉血气分析结果（x±s）

  

组别npHPCO2/mmHgP02/mmHgHCO3-/（mmol·L-1）sevo1h 8 7.373±0.052 38.7±2.1 106±11 22.4±12.5 sevo2h 8 7.365±0.010 40.6±2.6 100±10 20.9±11.2 sevo3h 8 7.364±0.019 41.2±3.5 104±10 21.6±10.1 sevo4h 8 7.337±0.031 43.5±3.3 125±9 23.6±8.9 F值 0.778 2.059 0.728 0.442 P值 0.516 0.128 0.544 0.725

2.2 七氟烷麻醉对大鼠大脑皮层区细胞细胞形态及CaV1.2阳性细胞表达的影响

七氟烷作为吸入麻醉药因麻醉诱导和觉醒平稳迅速，麻醉深度容易调节，且有着镇静、镇痛、肌松效果良好而广泛应用于临床，但其作用机制尚未阐明。本研究旨在探讨七氟烷全身麻醉的分子机制，为其临床应用提供新的理论依据。

  

图1 大鼠脑皮层区细胞形态及CaV1.2阳性细胞表达率直方图

2.3 七氟烷麻醉对大鼠大脑皮层组织中CaV1.2蛋白表达的影响

应用SPSS 20.0软件对结果进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间均数比较用t检验，多组均数比较采用方差分析，P≤0.05为差异统计学意义。

1.3.1 HE染色 隔3个孔从96孔板里选择一张脑片，放于0.01M的PBS液里，在载玻片上贴片，贴片后，烘片机37℃烘干，过夜。次日，经以下处理：苏木紫染色8min→自来水冲洗2min→伊红染色20s→自来水冲洗1min→75%乙醇30s→85%乙醇30s→95%乙醇30s→100%乙醇1min→二甲苯1min以上，用盖玻片封片，通风橱中晾干，以观察大鼠大脑皮层区细胞形态学改变。

3 讨论

采用1.5MAC的七氟烷麻醉各组大鼠1、2、3和4h，与control相比，各麻醉组大鼠大脑皮层区细胞无形态学改变（图1A），表明七氟烷麻醉对大脑皮层神经细胞形态无损害，所以选择1.5MAC的七氟烷麻醉大鼠是在安全剂量范围内。免疫组化染色结果显示：各组大脑皮层区CaV1.2阳性细胞呈棕褐色（图1B）；免疫组化半定量结果显示：随着七氟烷麻醉时间的延长，大鼠大脑皮层区CaV1.2阳性细胞表达率逐渐降低（P＜0.05）；麻醉sevo4h组CaV1.2阳性细胞表达率低于control和 sevo1h 组（P＜0.05）（图 1C）。

据统计，2013年～2016年普通读者(A卡)占持卡总数的70%，青少年读者(B卡)占持卡总数的28%，研究型读者(C卡)占持卡总数的1.2%(见表1)。

  

图2 七氟烷麻醉对大鼠大脑皮层组织中CaV1.2蛋白表达的影响

本研究结果显示，各组大鼠给予1.5 MAC的七氟烷麻醉，麻醉诱导时间（翻正反射消失的时间）、呼吸、心率和血压及动脉血pH值、PCO2、PO2和HCO3-差异无统计学意义，说明在大鼠麻醉期间生命体征较为平稳。有研究[10]报道，七氟烷因麻醉浓度和时长的不同可能会对神经细胞造成损伤，本研究分别对大鼠进行七氟烷麻醉1～4h，维持麻醉深度1.5 MAC，HE染色结果显示大脑皮层神经细胞无形态学改变，说明1.5MAC七氟烷麻醉1～4h没有造成神经细胞损伤。

有研究[11]证实，吸入麻醉药的作用靶点应该是蛋白质，而细胞膜上离子通道可能是最终的作用位点，如电压-门控钾离子通道、钙离子通道。电压-门控钙通道在激活促进Ca2+进入神经元中是一种重要的机制，并且调节多种神经元细胞的功能[12]。L型钙离子通道包括一个成孔的α1亚基（CaV1.1，CaV1.2，CaV1.3，CaV1.4）和辅基 α2δ 与β亚基[13]。哺乳动物大脑中主要表达CaV1.2和CaV1.3[12-14]。CaV1.2是构成L型钙离子通道的主要亚型，占80%左右。研究[15]表明，阻断L型钙离子通道可用来治疗疼痛，抑制L型钙离子通道可增强阿片类药物的镇痛作用[16]。有文献[17]报道，CaV1.2与脑电图节律和快速眼动睡眠恢复有关，参与了睡眠的调节。选择性的阻断Ca2+通道会导致昼夜节律中断。研究显示，乙醇通过抑制L型钙离子通道，松弛膀胱平滑肌诱导利尿。以上报道说明，L型钙离子通道与镇静、镇痛、肌松的产生有密切的关系。本研究结果显示，随着七氟烷麻醉时间的延长，大鼠大脑皮层区CaV1.2阳性细胞表达率和CaV1.2蛋白表达量逐渐降低；麻醉sevo4h组CaV1.2阳性细胞表达率低于control和sevo1h组；CaV1.2蛋白表达量的降低以麻醉3h和4h组最为显著，表明七氟烷通过降低大脑皮层L型钙离子通道CaV1.2蛋白表达量而发挥麻醉作用。Verma等[18]认为，L型钙离子通道阻断剂发挥镇痛作用的机制可能与其影响中枢神经系统中Ca2+内流有关。研究还发现，L型钙离子通道阻滞剂同样通过对Ca2+内流的抑制，产生睡眠或麻醉的作用[19]。乙醇对膀胱平滑肌的松弛作用亦与抑制Ca2+内流有关。由此推测，L型钙离子通道CaV1.2蛋白通过对Ca2+内流的影响介导了七氟烷的麻醉作用，这有待于进一步的研究。

综上所述，1.5MAC七氟烷麻醉不会造成大鼠大脑皮层神经细胞损伤。L型钙离子通道CaV1.2蛋白表达下调参与了七氟烷的麻醉作用。

2002年12月26日，胡锦涛首次提出要把农业、农村、农民问题作为全党工作的“重中之重”。[2]此后，以工补农、以城带乡、多予少取、统筹城乡等成为改革重点。从2004年始，每年的中央一号文件均聚焦于“三农”问题。2006年取消了沿袭数千年的农业税，直补农民、强农惠农的政策体系初步形成；党的十六大提出要“统筹城乡经济社会发展”；十六届三中全会把“统筹城乡发展”摆在“五个统筹”之首；党的十七大提出了要“形成城乡经济社会发展一体化”，推进社会主义新农村建设，着手构建统筹城乡发展的制度框架。2011年中国城镇化率首次超过50%，达到了51.3%，城镇化在加速推进。

参考文献：

［1］ Franks NP，Lieb WR.Molecular and cellular mechanismsofgeneralanaesthesia［J］.Nature，1994.367（6464）:607-614.

［2］ Kumar D，Dedic N，Flachskamm C，et al.Cacna1c（Cav1.2） modulates electroencephalographic rhythm and rapid eye movement sleep recovery［J］.Sleep，2015，38（9）:1371-1380.

［3］ Fossat P.Knockdown of L calcium channel subtypes:differential effects in neuropathic pain［J］.Neurosci，2010，30（3）:1073-1085.

［4］ Perusquia，M，Flores-Soto E，Sommer B，et al.Testosterone-induced relaxation involves L-type and storeoperated Ca2+channels blockade，and PGE 2 in guinea pig airway smooth muscle［J］.Pflugers Arch，2015，467（4）:767-777.

［5］ Steffey MA，Brosnan RJ，Steffey EP.Assessment of halothane and sevoflurane anesthesia in spontaneously breathing rats［J］.Am J Vet Res，2003，64（4）:470-474.

［6］ Hüneke R，Zitzelsberger D，Fassl J，et al.Temperature-independent Inhibition of L-type calcium currents by halothane and sevoflurane in human atrial cardiomyocytes［J］.Anesthesiology，2004，101（2）:409-416.

［7］ Mutoh T，Nishimura R，Sasaki N.Effects of medetomidine-midazolam，midazolambutorphanol，or acepromazine-butorphanol as premedicants for mask induction of anesthesia with sevoflurane in dogs［J］.Am J Vet Res，2002，63（7）:1022-1028.

［8］ Mutoh T.Effects of premedication with fentanyl and midazolam on mask induction of anaesthesia of dogs with sevoflurane［J］.Vet Rec，2007，160（5）:152-156.

［9］ Brito MV，Cunha IC，Aragón MG，et al.Effects of blood storage on ice in biochemical and arterial blood gas analysis of rats［J］.Acta Cir Bras，2008，23（5）:462-468.

［10］ Yang X，Yang S，Hong C，et al.Panax Notoginseng Saponins attenuates sevofluraneinduced nerve cell injury by modulating AKT signaling pathway［J］.Mol Med Rep，2017，16（5）:7829-7834.

［11］ Soholm H.，Olsen NV.Volatile anaesthesias'molecular biological course of action［J］.Ugeskr Laeger，2013，175（3）:123-127.

［12］ Sinnegger-Brauns MJ.Expression and 1，4-dihydropyridine-binding properties of brain L-type calcium channel isoforms［J］.Mol Pharmacol，2009，75（2）:407-414.

［13］ Wang HG.Ca2+/calmodulin regulates trafficking of Ca（V）1.2 Ca2+channels in cultured hippocampal neurons［J］.J Neurosci，2007，27（34）:9086-9093.

［14］ Aviner B，Gradwohl G，Moore HJ，et al.Modulation of presynaptic Ca2+currents in frog motor nerve terminals by high pressure［J］.Eur J Neurosci，2013，38（5）:2716-2729.

［15］ Gadotti VM，Bladen C，Zhang FX，et al.Analgesic effect of a broad-spectrum dihydropyridine inhibitor of voltage-gated calcium channels［J］.Pflugers Arch，2015，467（12）:2485-2493.

［16］ Weizman R，Getslev V，Pankova IA，et al.Pharmacological interaction of the calcium channel blockers verapamil and flunarizine with the opioid system［J］.Brain Res，1999，818（2）:187-195.

［17］ Malysz J，Afeli SA，Provence A，et al.Ethanol-mediated relaxation of guinea pig urinary bladder smooth muscle:involvement of BK and L-type Ca2+channels［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2014，306（1）:45-58.

［18］ Verma V，Mediratta PK，Sharma KK.Potentiation of analgesia and reversal of tolerance to morphine by calciumchannelblockers［J］.IndianJExpBiol，2001，39（7）:636-642.

［19］ Sukiasyan N，Hultborn H，Zhang M.Distribution of calcium channel Ca（V）1.3 immunoreactivity in the rat spinal cord and brain stem［J］.Neuroscience，2009，159（1）:217-235.