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β-榄香烯诱导人结肠癌细胞DLD-1的增殖抑制和凋亡研究

更新时间:2016-07-05

榄香烯是从传统中药姜黄属温郁金中提取分离的一种新型抗肿瘤药物,β-榄香烯是其主要成分,占60%~72%[1]。到目前为止,β-榄香烯作为一种非细胞毒性抗肿瘤药物,临床上已经用于脑癌、乳腺癌及肝癌等一些肿瘤的治疗[2]。结肠癌是一种常见的恶性肿瘤,在我国男女发病率和死亡率呈显著上升趋势,且多数患者发现时已属于中晚期[3]。目前结肠癌的治疗多以手术为主,5-氟尿嘧啶、奥沙利铂等化疗和放疗为辅,但会出现恶心呕吐、脱发、免疫功能下降等副作用,且患者容易复发,因此急需有效低毒的抗肿瘤药物治疗结肠癌[4]。有研究[5-6]表明β-榄香烯对结肠癌HT-29细胞和Lovo细胞有抑制增殖作用,但具体作用特点和机制尚未提及。故该研究旨在观察β-榄香烯对结肠癌细胞DLD-1增殖及凋亡的影响,并初步探讨β-榄香烯对DLD-1细胞活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)生成的影响。

基于大数据时代的城乡规划学,由于其在实践中的数据量增加,使计量方面的内涵也在发生变化,进而使该时代城乡规划计量内涵更加丰富。具体表现为:

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 β-榄香烯(大连金港制药有限公司);CellTiter 96® AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒(MTS)(普洛麦格北京生物技术有限公司);Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒(贝博生物有限公司);Hoechst 33342活细胞染色液(100×)、活性氧检测试剂盒(DCFH-DA)、Western及IP细胞裂解液、PMSF(100 mmol/L)、BCA 蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所);凋亡抗体套盒(美国Cell Signaling Technology公司);辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 细胞培养 DLD-1细胞由安徽医科大学药学院细胞库馈赠,复苏后加入含10%胎牛血清、20 U/ml的青霉素和链霉素的DMEM高糖培养基,于37 ℃、5% CO2的条件培养箱中培养。待细胞长至80%~90%时用胰酶消化进行传代,细胞传3代稳定后采用状态良好的对数生长期细胞进行实验操作。

1.3 MTS法检测细胞活力 胰酶消化处于对数生长期的DLD-1细胞并制成单细胞悬液,以每孔5×103个细胞接种至96孔板中,每孔200 μl,当细胞长至50%~60%时依序加入不同浓度β-榄香烯(25、50、100、200、300、400、500、600 μmol/L)作为药物组,设一个空白对照组,每组设6个复孔。分别处理24、48、72 h后,显微镜观察细胞生长状况。相应时间后每孔加入MTS/PMS混合物40 μl,1 h后于490 nm波长下测定各孔吸光度( optical density,OD)值。结果以细胞活力大小表示,细胞活力(%)=药物组OD / 空白对照组OD ×100%。

1.事件起因的多样性。由于我国社会经济发展进入新阶段,就业结构性矛盾突出,养老、医疗、住房、教育、收入分配、食品药品安全等不尽人意的问题依然多如牛毛,生产安全重特大事故也时有发生。从网络、新闻媒体报道和一些学者对群体性事件的分析来看,近几年我国行政执法行为引起的群体性公共事件,大部分与群众切身利益密切相关,主要集中于城市和农村的征地强拆问题,征地补偿和拆迁后的政府安置问题,环境污染项目引发环境保护问题,农民政治参与渠道堵塞问题,公民利益表达渠道堵塞问题,社会治安问题以及民族、宗教间的信仰问题及利益矛盾激化问题等等。

1.5 Hoechst 33342染色实验 取对数生长期DLD-1细胞接种到12孔板中,每孔1 ml,1×105个细胞;待细胞贴壁后每孔依次加入不同浓度β-榄香烯(50、100、200、300 μmol/L)作为药物组,设一个空白对照组。24 h后吸弃药液,PBS清洗1次,每孔加入1 ml Hoechst 33342染色液,放入培养箱孵育15 min后吸弃,PBS清洗2次后于荧光显微镜下观察。

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1.6 Annexin V/ PI双染法检测细胞凋亡 取对数生长期DLD-1细胞接种到6孔板中,细胞密度为105个/ml。待细胞贴壁后依次加入不同浓度β-榄香烯(50、100、200、300 μmol/L)作为药物组,设一个空白对照组。置培养箱中培养24 h后用不含EDTA的胰酶消化细胞,并进行细胞计数,取5×105个细胞进行Annexin V-FITC细胞凋亡检测实验。细胞收集后用冷PBS洗涤2次,离心后用400 μl 1× Annexin V结合液重悬细胞,加入5 μl Annexin V-FITC进行染色,2~8 ℃避光孵育15 min,再加入10 μl PI染色液轻轻混匀,于2~8 ℃避光孵育5 min,用流式细胞仪进行检测。

1.4 克隆形成实验 取对数生长期DLD-1细胞接种到6孔板中,每孔2 ml,1×103个细胞;待细胞贴壁后每孔依次加入不同浓度β-榄香烯(50、100、200、300 μmol/L)作为药物组,设一个空白对照组。24 h后吸弃药液,每孔加入2 ml含10%胎牛血清、20 U/ml的青霉素和链霉素的DMEM高糖培养基后继续培养,每隔2 d换液1次。待长出细胞集落,14 d后处理。PBS清洗细胞2次,每孔加入1 ml多聚甲醛固定液固定30 min后吸弃,加入1 ml过滤的结晶紫染色液染色15 min,用清水轻轻冲掉结晶紫染色液,将6孔板残余的水分晾干、拍照。

1.8 ROS检测

1.7 Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达 β-榄香烯(100、200、300 μmol/L)及空白对照组处理DLD-1细胞24 h后,提取各组细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度并将蛋白调整为相同浓度。SDS-PAGE法将蛋白转至PVDF膜上,5%脱脂牛奶室温封闭2 h,兔抗人GAPDH(1 ∶1 000)、Cleaved PARP(1 ∶1 000)、PARP(1 ∶1 000)、Cleaved Caspase-9(1 ∶1 000)、Caspase-9(1 ∶1 000)、Cleaved Caspase-3(1 ∶1 000)和Caspase-3(1 ∶1 000)一抗4 ℃孵育过夜,二抗(1 ∶5 000)室温孵育2 h,显影。

2.3 β-榄香烯对DLD-1细胞核的影响 β-榄香烯(50、100、200、300 μmol/L)处理细胞24 h后进行Hoechst 33342染色,结果显示细胞均出现蓝染,空白对照组细胞核规则均匀,核膜完整,但药物组随着β-榄香烯浓度增加,部分细胞核成碎块状,核染色质固缩发生高亮呈现致密浓染(F=140.9,P<0.05,P<0.01),见图4。

1.8.2 流式细胞术检测ROS水平 β-榄香烯(50、100、200、300 μmol/L)及空白对照组处理DLD-1细胞24 h后,收集细胞于1.5 ml离心管,用PBS清洗2次离心,每管加入1 ml DCFH-DA荧光探针,吹打混匀放入培养箱孵育20 min,3 min颠倒混匀1次,用无血清培养基清洗3次,充分去掉未进入细胞的DCFH-DA,上机检测。

(2)建设护理质量管理控制体系。在日常护理工作中结合等级医院评审相关要求,建设"院控、科控、自控"的护理质量管理控制体系,科室成立护理质量管理控制小组,采取医院抽查、科室互查、自我复查的方式,从护理病案质量、临床护理质量等方面定期组织督导考核,将相关结果反馈并督促整改到位。

1.8.1 荧光显微镜观察ROS水平 β-榄香烯(50、100、200、300 μmol/L)及空白对照组处理DLD-1细胞24 h后,PBS清洗2次,每孔加入1 ml DCFH-DA荧光探针,放入培养箱孵育20 min,用无血清培养基清洗3次,去掉未进入细胞的DCFH-DA,荧光显微镜下观察。

1.9 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件对数据进行分析,所有实验重复3次以上。数据以表示,多组资料比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 β-榄香烯对DLD-1细胞活力的影响 β-榄香烯(25、50、100、200、300、400、500、600 μmol/L)处理细胞24 h后,倒置显微镜下观察,空白对照组细胞贴壁生长,呈不规则梭形、边缘光滑;β-榄香烯药物组随着药物浓度的升高,细胞存活数目减少、细胞间隙变大,细胞皱缩且形态模糊,见图1。MTS法结果显示,50~400 μmol/L β-榄香烯显著抑制DLD-1细胞的活力(F=97.78、153.3、175.7,P<0.05,P<0.01),见图2。

图1 β-榄香烯处理DLD-1细胞24 h后细胞形态 ×200

A:空白对照组;B~D:β-榄香烯100、200、300 μmol/L

图2 β-榄香烯抑制DLD-1细胞增殖

A:空白对照组;B~I:β-榄香烯25、50、100、200、300、400、500、600 μmol/L;与同一时间空白对照组比较:*P<0.05,**P<0.01

2.5 β-榄香烯对DLD-1细胞凋亡相关蛋白表达的影响 Western blot结果表明,β-榄香烯作用DLD-1细胞24 h后,Cleaved PARP、Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3表达水平随着β-榄香烯浓度增大而增加;PARP、Caspase-9和Caspase-3蛋白的表达水平变化不明显(F=18.61、7.92、261.3、33.68、213.9、17.99,P<0.01)。提示β-榄香烯促进PARP、Caspase-9和Caspase-3蛋白剪切,促进了DLD-1细胞的凋亡,见图6。

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2.4 β-榄香烯对DLD-1细胞凋亡的影响 采用β-榄香烯(50、100、200、300 μmol/L)处理DLD-1细胞24 h后,与空白对照组相比,β-榄香烯给药组的凋亡率增加(F=305.4,P<0.01),表明当β-榄香烯浓度增大时,可以诱导DLD-1细胞出现凋亡,抑制细胞的生长,见图5。

图3 β-榄香烯对DLD-1细胞克隆形成能力的影响

A:空白对照组;B~E:β-榄香烯50、100、200、300 μmol/L;与空白对照组比较:**P<0.01

图4 Hoechst 33342染色实验测定DLD-1细胞凋亡 ×200

A:空白对照组;B~E:β-榄香烯50、100、200、300 μmol/L;与空白对照组比较:*P<0.05,**P<0.01

图5 β-榄香烯诱导DLD-1细胞凋亡

A:空白对照组;B~E:β-榄香烯50、100、200、300 μmol/L;与空白对照组比较:**P<0.01

图6 β-榄香烯对DLD-1细胞凋亡相关蛋白表达的影响

A:空白对照组;B~D:β-榄香烯100、200、300 μmol/L;a:Cleaved PARP;b:PARP;c:Cleaved Caspase-9;d:Caspase-9;e:Cleaved Caspase-3;f:Caspase-3;与空白对照组比较:**P<0.01

2.2 β-榄香烯对DLD-1细胞克隆形成能力的影响 克隆形成实验结果表明,β-榄香烯显著抑制DLD-1细胞增殖。与空白对照组相比,随着β-榄香烯浓度增大,细胞克隆数目变少,细胞集落数逐渐减少(F=337.9,P<0.01),见图3。

2.6 DLD-1细胞内ROS的表达 荧光显微镜下观察结果显示,β-榄香烯(50、100、200、300 μmol/L)作用于DLD-1细胞24 h后,与空白对照组相比,β-榄香烯药物组DCF的荧光强度依次增加(F=279.7,P<0.01),流式细胞仪检测结果与荧光显微镜相一致(F=280.22,P<0.01),表明β-榄香烯浓度增大使细胞内ROS水平增加,见图7、8。

图7 荧光显微镜下观察β-榄香烯对DLD-1细胞内ROS的影响 ×100

A:空白对照组;B~E:β-榄香烯50、100、200、300 μmol/L;与空白对照组比较:**P<0.01

图8 流式细胞仪检测β-榄香烯对DLD-1细胞内ROS的影响

A:空白对照组;B~E:β-榄香烯50、100、200、300 μmol/L;与空白对照组比较:**P<0.01

3 讨论

姜黄属植物莪术作为我国常用的传统中药,具有行气止痛、积散结、破血祛瘀作用,《医家心法》论“广茂即莪术,凡行气破血,消积散结皆用之”等。大量研究[7-8]表明莪术对多种肿瘤如乳腺癌、肝癌及胃癌等有很好的治疗作用,β-榄香烯是从中药莪术根茎中提取并分离的有效活性单体,其具有低毒有效、广谱的性质,对多种肿瘤有明显的抑制作用,是临床上常用的抗肿瘤药物。有研究[9]表明,β-榄香烯作为一种天然的抗血管生成剂,可以通过抑制VEGF介导的血管生成,抑制黑素瘤的生长和转移。另外,β-榄香烯通过上调P53蛋白的表达促进外泌体的释放,抑制人肺癌细胞的增殖[10]。在本研究中,MTS实验和克隆形成实验显示,β-榄香烯能够显著抑制结肠癌DLD-1细胞的增殖。

综上所述,高中生物教师要想提升高中生物课堂的教学有效性,就必须更新教学观念,结合学生学情,大胆运用新的教学方式方法,并做好教学评价、教学反思等工作。希望本文的研究成果能够给予其他高中生物教师一定的参考与借鉴,共同推动高中生物课堂教学水平迈上一个新的台阶。

在一定条件下,细胞受内在遗传机制的控制自动结束生命的过程称之为细胞凋亡,其对多细胞生物体的胚胎发育和组织稳态起着至关重要的作用[11]。当细胞发生凋亡时,细胞体积缩小,线粒体膜电位消失,核质浓缩,DNA降解,胞膜内侧外翻到膜表面,最终细胞被分割包裹为几个凋亡小体,继而被吞噬细胞吞噬[12]。在细胞凋亡过程中Caspases扮演着十分重要的角色,细胞凋亡过程其实就是Caspases不可逆有限水解底物的级联放大反应过程。当细胞色素C进入细胞质后,募集Caspase-9前体并使其剪切活化,从而进一步激活效应Caspase-7和Caspase-3,而PARP是细胞凋亡核心元件Caspase-3 的切割底物,共同启动Caspase级联反应,最终引发细胞凋亡[13]。本研究探讨了β-榄香烯诱导DLD-1细胞凋亡的初步机制。Hoechst 33342染色显示β-榄香烯可使细胞出现细胞核聚缩和致密浓染的表现,Annexin V/PI双染结果表明,β-榄香烯可诱导DLD-1细胞出现凋亡;Western blot结果表明β-榄香烯诱导DLD-1细胞凋亡与PARP、Caspase-3、Caspase-9的活化有关。以上说明β-榄香烯作为中药有效活性成分能够诱导结肠癌DLD-1细胞发生凋亡。

ROS作为一种自由基,与肿瘤之间的关系密切,越来越多的研究表明ROS不仅与肿瘤的发生和发展有关,还和肿瘤的治疗有着密切联系。ROS在不同水平下会有不同的作用。低水平的ROS促进细胞分裂与增殖,中等水平的ROS导致细胞周期阻滞,而高水平的ROS诱导细胞发生凋亡或坏死[14]。许多抗癌药物如烷化剂和喜树碱等会通过介导ROS的大量释放和线粒体膜电位的变化,激活Caspase-3 等蛋白酶来诱导癌细胞发生凋亡[15]。本研究观察了β-榄香烯对ROS的影响,荧光显微镜下观察和流式细胞仪检测结果显示β-榄香烯处理DLD-1细胞24 h后,随着β-榄香烯作用浓度增加,药物组细胞内ROS 水平与空白对照组相比明显增加,表明ROS可能在β-榄香烯抑制DLD-1细胞增殖及诱导凋亡中发挥重要作用。

综上所述,β-榄香烯抑制人结肠癌细胞DLD-1的增殖并诱导细胞凋亡,这可能与ROS升高及上调凋亡相关蛋白有关,为β-榄香烯应用于结肠癌的临床治疗提供了实验依据。

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汪国玉,张蕾,耿亚迪,冯晓俊,陈昭琳,赵晓晓,姜玲,魏伟
《安徽医科大学学报》2018年第4期文献

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