细胞周期检验点是细胞进入有丝分裂前修复DNA损伤的重要关卡，在G2/M期，细胞损伤信号可激活P53-P21WAF1和Chk1-CDC25通路，抑制CyclinB1/细胞周期依赖激酶1(cyclin dependent kinases 1，CDK1)复合物的活性和进入细胞核，引起G2期阻滞，启动DNA损伤修复[1]。CDK1是G2/M期传导网络的核心因子，野生型p53基因主要通过作用于其靶因子P21WAF1调节CDK1的活性来调节G2/M检验点[2-3]。前期研究[4-5]表明，上皮性卵巢癌组织中存在P53蛋白高表达、P21WAF1蛋白低表达和CDK1蛋白高表达，随着患者临床分期的增加，P53表达逐渐增加、P21WAF1表达逐渐减少，CDK1高表达与临床分期无关，P53、P21WAF1和CDK1可能协同参与了上皮性卵巢癌的发生发展。该研究利用小发卡RNA干扰技术研究P53/CDK1信号通路在卵巢上皮性癌细胞SK-OV-3、OVCAR-3细胞增殖和凋亡中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂 人上皮性卵巢癌细胞SK-OV-3、OVCAR-3购自中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)；RPMI-1640完全培养基购自美国Hyclone公司；鼠抗人CDK1单克隆抗体、兔抗人磷酸化CDK1(Thr14/Tyr15)多克隆抗体、鼠抗人CyclinB1单克隆抗体、山羊抗人Ki-67多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；鼠抗人P53单克隆抗体、兔抗人磷酸化P53(ser15)多克隆抗体、鼠抗人P21WAF1单克隆抗体、兔抗人Survivin单克隆抗体、鼠抗人cleaved-Caspase3单克隆抗体、Western blot及IP蛋白裂解液、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自江苏碧云天生物公司；增强化学发光(ECL)试剂盒、兔抗人β肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体、鼠抗兔单克隆IgG、DAB染色试剂盒均购自北京中杉金桥科技有限公司；TUNEL检测试剂盒(POD法)购自美国Roche公司；CDK1、p53基因特异性shRNA质粒、阴性对照shRNA 质粒、shRNA 质粒转染试剂购自美国Santa Cruz公司。

1.2 细胞培养和转染 SK-OV-3、OVCAR-3细胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基在37℃、5% CO2、相对湿度90%的培养箱中培养，至对数生长期收集细胞用于后续实验。分别将CDK1、p53基因shRNA质粒及阴性对照质粒转染SK-OV-3、OVCAR-3细胞，经嘌呤霉素(2 μg/ml，美国Sigma公司)筛选，扩增建株，实验细胞分别命名为空白对照组、阴性对照组和沉默组。

1.3 Western blot法 蛋白裂解液提取细胞样本总蛋白，采用考马斯亮蓝法(Bradford法)进行蛋白定量。分别取30 μg总蛋白进行10% 十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰氨凝胶(PAGE)电泳，恒压20 V半干转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，含5%脱脂奶粉、0.05%吐温20枸橼酸盐缓冲液(TBST)室温封闭2 h，按说明书浓度分别用一抗、二抗4 ℃孵育过夜，IgG(1 ∶2000)室温孵育2 h。ECL发光试剂盒显色后曝光，Image Pro-Plus 6.0软件分析特异性目的条带的灰度值，将β-actin设为内参照，分别计算其相对表达水平(目的蛋白灰度值/β-actin灰度值)，每组实验重复3次。

淮河流域的行蓄洪区主要分布在安徽沿淮地区，原有4个蓄洪区和17个行洪区。2009年《淮河干流行蓄洪区调整规划》实施后，行蓄洪区调整为6个蓄洪区和7个有闸控制的行洪区，面积25.83万hm2，其中蓄洪区 18.93万 hm2，行洪区 6.90万 hm2。调整后的行蓄洪区增加了蓄洪区的面积比重，这有益于湿地生态的恢复和扩展。行蓄洪区内有大面积的湿地分布。

1.4 MTT法测定细胞增殖 将各组细胞按1×104个/孔接种于96孔板，每组细胞设3个复孔，另设3个空白对照孔，常规培养24 h，此后每24 h向每孔内加入5 mg/ml MTT 20 μl，连续5 d，加入MTT作用4 h后弃去上清液，每孔加入150 μl DMSO(美国Sigma公司)溶液，置于摇床上低速震荡10 min，酶标仪(美国Thermo公司)测量492 nm波长处各孔的吸光度(absorbance，A)值(A492)，以培养时间为横坐标，A492为纵坐标，绘制生长曲线。

2.1.3 CDK1基因沉默后对卵巢癌细胞晚期凋亡的影响 TUNEL结果显示，转染CDK1-shRNA质粒后SK-OV-3空白对照组、SK-OV-3阴性对照组和SK-OV-3沉默组细胞的晚期凋亡率分别为(4.67±0.58)%、(5.00±1.00)%和(26.67±2.08)%，差异有统计学意义(F=252.412，P<0.001)。OVCAR-3空白对照组、OVCAR-3阴性对照组和OVCAR-3沉默组细胞的晚期凋亡率分别为(6.67±1.53)%、(7.33±0.58)%和(31.67±3.06)%，差异有统计学意义(F=152.194，P<0.001)，而在SK-OV-3空白对照组和SK-OV-3阴性对照组细胞之间、OVCAR-3空白对照组和OVCAR-3阴性对照组细胞之间差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

2.3.1 p53基因沉默后对卵巢癌细胞增殖的影响 MTT结果显示，转染p53-shRNA质粒后SK-OV-3沉默组细胞(F=267.038，P<0.001)和OVCAR-3沉默组细胞(F=307.124，P<0.001)的增殖明显受到抑制，而在SK-OV-3空白对照组和SK-OV-3阴性对照组细胞之间、OVCAR-3空白对照组和OVCAR-3阴性对照细胞之间差异无统计学意义(P>0.05)。见图5。

燃煤电厂可将脱硫废水作为补给水源引入水力除渣和湿排除渣系统，作为一种以废治废的处理策略，其将高温炉渣中的大量碱性氧化物和溶出液，与脱硫废水相中和。同时利用炉渣废热也可实现脱硫废水在除渣系统里的蒸发结晶。

政策二：1月3日，国务院办公厅印发新修订的《省级政府耕地保护责任目标考核办法》。《考核办法》重点围绕突出耕地保护、强化政府责任的基本要求对原考核办法做了修订，以实行耕地数量、质量、生态“三位一体”保护为核心，进一步完善了考核实施机制、组织方式与考核内容，确保考核主体有抓手、考核内容有依据、考核标准更完善、考核结果能管用。

2.1.1 CDK1基因沉默后对卵巢癌细胞增殖的影响 MTT结果显示，转染CDK1-shRNA质粒后SK-OV-3沉默组细胞(F=417.027，P<0.001)和OVCAR-3沉默组细胞(F=378.229，P<0.001)的增殖明显受到抑制，而在SK-OV-3空白对照组和SK-OV-3阴性对照组细胞之间、OVCAR-3空白对照组和OVCAR-3阴性对照组细胞之间差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

[5]喻忠磊,庄立,孙丕苓,等.基于可持续性视角的建设用地适宜性评价及其应用[J].地球信息科学学报,2016,18(10): 1360-1373.

2 结果

2.1.4 CDK1基因沉默后对卵巢癌细胞周期分布的影响 流式细胞术检查结果显示，转染CDK1-shRNA质粒后SK-OV-3空白对照组、SK-OV-3阴性对照组和SK-OV-3沉默组细胞的G2期细胞数目分别为(5.44±0.68)%、(5.08±1.57)%和(19.85±1.95)%，差异有统计学意义(F=94.991，P<0.001)。OVCAR-3空白对照组、OVCAR-3阴性对照组和OVCAR-3沉默组细胞的G2期细胞数目分别为(8.16±0.88)%、(7.60±0.84)%和(23.33±1.89)%，差异有统计学意义(F=141.416，P<0.001)。而在SK-OV-3空白对照组和SK-OV-3阴性对照组细胞之间、OVCAR-3空白对照组和OVCAR-3阴性对照组细胞差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

1.7 流式细胞术检测细胞周期分布情况 分别收集对数生长期的3组细胞各1×106个，PBS漂洗细胞两次，70%冰乙醇固定24 h，洗涤离心后加入含100 mg/L RNaseA的碘化丙啶，室温避光染色后采用FACScan流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司)检测细胞周期时相变化，Mulpicycle for windows软件分析结果。

图1 CDK1基因沉默后对卵巢癌细胞增殖能力的影响

A：SK-OV-3细胞；B：OVCAR-3细胞

2.1.2 CDK1基因沉默后对卵巢癌细胞早期凋亡的影响 流式细胞术检测结果显示，转染CDK1-shRNA质粒后SK-OV-3沉默组和OVCAR-3沉默组细胞的早期凋亡率明显增加(P<0.001)，而在SK-OV-3空白对照组和SK-OV-3阴性对照组细胞之间、OVCAR-3空白对照组和OVCAR-3阴性对照组细胞之间差异无统计学意义。见表1。

1.8 统计学处理 使用SPSS17.0软件进行分析，计量资料以表示，多组数据间均数的差异性检验采用单因素方差分析(ANOVA)和Bonferroni分析，P<0.05为差异有统计学意义。

表1 分别沉默CDK1和p53基因对各实验组细胞早期凋亡率的影响

组别CDK1沉默p53沉默SK-OV-3空白对照1.86±0.481.84±0.42SK-OV-3阴性对照1.99±0.461.88±0.48SK-OV-3沉默14.69±1.719.60±1.71F值145.87953.804P值<0.001<0.001OVCAR-3空白对照3.50±0.883.25±0.97OVCAR-3阴性对照4.93±1.293.25±0.90OVCAR-3沉默15.36±1.1112.52±1.23F值102.87278.785P值<0.001<0.001

1.5 流式细胞术检测细胞早期凋亡率 每实验组收集1×105个细胞，弃上清液，加入195 μl的Annexin V-FITC结合液重悬细胞，然后加入5 μl Annexin V-FITC轻轻混匀后，再加入10 μl碘化丙啶混匀，室温、避光孵育15 min，冰浴后立即采用FACScan流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司)检测细胞早期凋亡情况，Cell Quest软件进行分析，本实验重复3次。

2.1 CDK1基因沉默后对卵巢癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

图2 CDK1基因沉默后对卵巢癌细胞晚期凋亡率的影响 DAB染色×400

A、B、C：SK-OV-3细胞空白对照组、阴性对照组、沉默组；D、E、F：OVCAR-3细胞空白对照组、阴性对照组、沉默组；与空白对照组比较：*P<0.05；与阴性对照组比较：#P<0.05

图3 CDK1基因沉默后对卵巢癌细胞G2期细胞数目的影响

A、B、C：SK-OV-3细胞空白对照组、阴性对照组、沉默组；D、E、F：OVCAR-3细胞空白对照组、阴性对照组、沉默组；与空白对照组比较：*P<0.05；与阴性对照组比较：#P<0.05

图4 CDK1基因沉默后对卵巢癌细胞G2/M检验点相关蛋白表达的影响

与空白对照组比较：*P<0.05；与阴性对照组比较：#P<0.05

2.2 CDK1基因沉默后对卵巢癌细胞P53/CDK1通路相关蛋白表达的影响 Western blot结果显示，CDK1基因沉默后SK-OV-3、OVCAR-3细胞中CDK1和p-CDK1(Thr14/Tyr15)蛋白表达明显减少(P<0.05)，而P53、p-P53(ser15)、 P21WAF1、CyclinB1蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)。此外，在SK-OV-3沉默组和OVCAR-3沉默组细胞中检测到Ki-67、Survivin蛋白表达减少(P<0.05)，cleaved-Caspase3蛋白表达增加(P<0.05)。上述蛋白的表达在SK-OV-3空白对照组和SK-OV-3阴性对照组细胞之间、OVCAR-3空白对照组和OVCAR-3阴性对照组细胞之间差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

2.3 p53基因沉默后对卵巢癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

耐心极好的嘉庆皇帝也渐渐陷入焦躁。上谕中开始出现连篇累牍的斥责、抱怨甚至痛骂。他自认为已经非常凌厉的手段和措施，经过“死猪不怕开水烫”的官僚体系的层层减震，到了基层，竟然已经如同抚摸般温柔。他发现自己面对的是一个巨大的混沌，自己的记记重拳打上去，都如同打在了棉花团上。事实证明，常规的反腐已经不能解决清朝中后期的严重腐败问题。

1.6 TUNEL法检测细胞晚期凋亡率 在载玻片上滴加单细胞悬液，培养4～6 h至细胞贴壁，4%多聚甲醛(美国Sigma公司)固定25 min，PBS浸洗3次，0.2% Triton X-100孵育5 min，然后按TUNEL试剂盒说明书处理细胞，DAB染色后封片，高倍镜(400倍)下随机选取5个视野，计数每100个细胞中凋亡小体的数目，取均数计算细胞晚期凋亡率。

2.3.2 p53基因沉默后对卵巢癌细胞早期凋亡的影响 流式细胞术检测结果显示，转染p53-shRNA质粒后SK-OV-3沉默组和OVCAR-3沉默组细胞的早期凋亡率明显增加(P<0.001)，而在SK-OV-3空白对照组和SK-OV-3阴性对照组细胞之间、OVCAR-3空白对照组和OVCAR-3阴性对照组细胞之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

库车山前气田为西气东输主力气源，试油期间测试放喷天然气全部放空燃烧，向大气中排放了大量的二氧化碳和烃类气体，具有井口压力超高、井口温度超高、井口产量超高的特征，尤其是克深区块试采井的温度、压力、产量，最高井口关井静压超110 MPa，天然气回收难度极大，国内外无先例借鉴。

图5 沉默p53基因后对卵巢癌细胞增殖能力的影响

A：SK-OV-3细胞，B：OVCAR-3细胞

2.3.3 p53基因沉默后对卵巢癌细胞晚期凋亡的影响 TUNEL结果显示，转染p53-shRNA质粒后SK-OV-3空白对照组、SK-OV-3阴性对照组和SK-OV-3沉默组细胞的晚期凋亡率分别为(4.64±0.56)%、(6.00±1.00)%和(23.67±1.99)%，差异有统计学意义(F=178.647，P<0.001)。OVCAR-3空白对照组、OVCAR-3阴性对照组和OVCAR-3沉默组细胞的晚期凋亡率分别为(6.33±1.46)%、(7.00±1.00)%和(27.33±2.52)%，差异有统计学意义(F=132.655，P<0.001)，而在SK-OV-3空白对照组和SK-OV-3阴性对照组细胞之间、OVCAR-3空白对照组和OVCAR-3阴性对照组细胞之间差异无统计学意义(P>0.05)。见图6。

这么多家族长辈，对何东来说选个专业，找个工作，谈个对象，家族常委会都管。就是家庭聚会，何东还得象只打鸣公鸡似的挺着，装优秀青年玩，谁让他是长孙呢。

2.3.4 p53基因沉默后对卵巢癌细胞周期分布的影响 流式细胞术检测结果显示，转染p53-shRNA质粒后SK-OV-3空白对照组、SK-OV-3阴性对照组和SK-OV-3沉默组细胞的G2期细胞数目分别为(3.50±0.61)%、(3.44±0.75)%和(12.00±2.33)%，差异有统计学意义(F=34.229，P=0.001)。OVCAR-3空白对照组、OVCAR-3阴性对照组和OVCAR-3沉默组细胞的G2期细胞数目分别为(5.81±1.24)%、(5.88±1.18)%和(28.26±2.06)%，差异有统计学意义(F=210.030，P<0.001)。而在SK-OV-3空白对照组和SK-OV-3阴性对照组细胞之间、OVCAR-3空白对照组和OVCAR-3阴性对照组细胞之间差异无统计学意义(P>0.05)。见图7。

2.4 p53基因沉默后对卵巢癌细胞P53-CDK1通路相关蛋白表达的影响 Western blot结果显示，p53基因沉默后SK-OV-3、OVCAR-3细胞中P53、p-P53(ser15)、 P21WAF1蛋白表达明显减少(P<0.05)，p-CDK1(Thr14/Tyr15)蛋白表达明显升高(P<0.05)，而CDK1、CyclinB1蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)。此外，在SK-OV-3沉默组和OVCAR-3沉默组细胞中检测到Ki-67、Survivin蛋白表达减少(P<0.05)，cleaved-Caspase3蛋白表达增加(P<0.05)。上述蛋白的表达在SK-OV-3空白对照组和SK-OV-3阴性对照组细胞之间、OVCAR-3空白对照组和OVCAR-3阴性对照组细胞之间差异无统计学意义(P>0.05)。见图8。

图6 沉默p53基因后对卵巢癌细胞凋亡能力的影响 DAB染色×400

A、B、C：SK-OV-3细胞空白对照组、阴性对照组、沉默组；D、E、F：OVCAR-3细胞空白对照组、阴性对照组、沉默组；与空白对照组比较：*P<0.05；与阴性对照组比较：#P<0.05

图7 沉默p53基因后对卵巢癌细胞G2期细胞数目的影响

A、B、C：SK-OV-3细胞空白对照组、阴性对照组、沉默组；D、E、F：OVCAR-3细胞空白对照组、阴性对照组、沉默组；与空白对照组比较：*P<0.05；与阴性对照组比较：#P<0.05

图8 沉默p53基因后对卵巢癌细胞G2/M检验点相关蛋白表达的影响

与空白对照组比较：*P<0.05；与阴性对照组比较：#P<0.05

3 讨论

卵巢上皮性癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤，由于卵巢居于盆腔深处、发病隐匿、疾病症状不典型等因素影响，大部分卵巢癌患者被诊断时已到疾病晚期，虽然可行系统的肿瘤细胞减灭术和以铂类为基础的联合化疗进行治疗，但其死亡率仍高居妇科恶性肿瘤之首[6]。研究[7]表明，细胞周期调节异常和信号通路传导异常与卵巢癌的发生发展关系密切。

G2/M检验点是细胞周期中除G1/S检验点之外最重要的细胞检测点，是决定细胞一分为二的控制点，是细胞进入有丝分裂前修复DNA损伤的最后时机 [3]。CDK1与CyclinB1结合形成异源二聚体CyclinB1/CDK1，又称为细胞成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF)，MPF是真核细胞有丝分裂G2/M期转换所必需的蛋白激酶，只有活化的MPF才能触发有丝分裂[8]。CDK1又名P34CDC2，是CDC2基因编码的34 ku的蛋白质，其N末端第161个氨基酸苏氨酸(Thr161)、第15个氨基酸酪氨酸(Tyr15)和第14个氨基酸苏氨酸(Thr14)的磷酸化状态对其活性的影响至关重要，其中Thr14/Tyr15位点的磷酸化和去磷酸化是调节CDK1活性的关键，CDK1去磷酸化激活后进而调节CyclinB1/CDK1复合物的活性，推动细胞进入有丝分裂期[9-10]。细胞DNA损伤时可使CDK1失活，最终导致细胞周期阻滞在G2期。

研究表明，在喉癌[11]、肺癌[12]、结直肠癌[13]和肾癌[14]等多种癌组织中均检测到CDK1的高表达，其高表达与上述恶性肿瘤的预后有关，CDK1可能在上述恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用。抑制CDK1基因的表达后，卵巢癌细胞的增殖明显受到抑制、凋亡明显增加、G2期细胞数目增加，提示CDK1的异常表达与上皮性卵巢癌细胞的增殖和凋亡关系密切。进一步研究显示，抑制CDK1基因表达对SK-OV-3、OVCAR-3细胞中P53、p-P53(ser15)、 P21WAF1、CyclinB1蛋白的表达无明显影响，而CDK1和p-CDK1(Thr14/Tyr15)蛋白表达则明显降低，同时细胞增殖相关蛋白Ki-67表达减少、凋亡抑制基因Survivin蛋白表达减少、凋亡相关蛋白cleaved-Caspase3蛋白表达增加，提示CDK1基因沉默后对卵巢癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响可能与CDK1蛋白的表达受到抑制有关。

多数恶性肿瘤细胞中存在p53基因突变和突变型P53蛋白高表达，p53基因在细胞周期G1/S期转换、G2/M期转换等多个环节中发挥重要作用，P21WAF1基因是野生型p53基因的主要靶因子之一[15]。抑制p53基因表达后，卵巢癌细胞的增殖明显受到抑制、凋亡明显增加、G2期细胞数目增加，提示P53蛋白异常表达与卵巢癌细胞的增殖和凋亡关系密切。进一步研究显示，沉默p53基因后SK-OV-3、OVCAR-3细胞中P53、p-P53(ser15)、 P21WAF1蛋白表达明显减少，p-CDK1(Thr14/Tyr15)蛋白表达明显升高，而CDK1、CyclinB1蛋白的表达无明显改变，同时Ki-67表达减少、Survivin表达减少、cleaved-Caspase3表达增加，上述结果说明抑制P53蛋白表达后可引起P21WAF1蛋白表达减少、CDK1蛋白的Thr14/Tyr15位点磷酸化增加、CDK1活性受到抑制，提示可能是通过P53-P21WAF1信号通路引起CyclinB1/CDK1复合物活性受到抑制，导致被阻滞在G2期的卵巢癌细胞数目增加，进而引起其下游细胞增殖和凋亡相关蛋白表达异常，最终引起卵巢癌细胞增殖抑制、凋亡增加。

综上所述，本研究通过体外实验显示CDK1蛋白的异常表达与上皮性卵巢癌细胞的增殖和凋亡相关，G2/M检验点P53-P21WAF1-CDK1信号通路可能参与调节卵巢癌细胞的增殖和凋亡。在本研究基础上进一步探讨CDK1及G2/M检验点与卵巢癌的关系，有助于阐明卵巢癌发病与细胞周期调节异常的关系，也可为卵巢癌的临床靶向治疗提供潜在的治疗靶点。

参考文献

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