功能性消化不良( functional dyspepsia,FD)包括餐后饱胀不适、早饱、上腹痛或上腹部烧灼感等症状, 是指发生在胃和十二指肠没有任何系统性、代谢性和器质性疾病的一种或多种消化不良症状[1]。临床上关于FD的治疗还没有有效方法，对FD的防治成为亟待解决的课题。内质网应激可以通过处理内质网中未折叠蛋白或错误折叠蛋白的堆积来维持细胞的正常功能，是内质网中的自我代偿过程[2]。疾病的发生发展与内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)有密切关系，通过调节ERS来防治疾病已成为研究热点。柴胡疏肝散源自《景岳全书》，是疏肝理气法的代表方剂。本课题组既往研究[3- 4]显示柴胡疏肝散能够改善FD大鼠的胃动力，其机制可能与增强细胞活性和减少自噬有关，但是对于FD大鼠改善胃动力的深层机制尚不清楚。本研究从调控ERS角度来进一步探讨柴胡疏肝散防治FD的机制，通过观察ERS相关因子的变化，为柴胡疏肝散防治FD提供更深入的实验依据。

1 材料

1.1 动物 SPF级SD大鼠30只，雌雄各半，体质量(250±20) g，由广西医科大学实验动物中心提供。实验前适应性喂养1周后，按随机数字表法分为正常组、模型组、生理盐水组、柴胡疏肝散组及多潘立酮组，每组6只。SPF级环境饲养，温度(22±3)℃，湿度50%，明暗交替12 h。

1.2 药物 柴胡疏肝散(组成: 柴胡6 g, 陈皮6 g, 香附4.5 g, 川芎4.5 g, 枳壳4.5 g, 白芍4.5 g, 甘草1.5 g)及多潘立酮(10 mg/片, 西安杨森制药有限公司生产, 批准文号:150324778)均购于广西医科大学第一附属医院药房。柴胡疏肝散浓度参考徐叔云等主编的《药理实验方法学》第三版[5]，按照普通成人(60 kg/人)临床用量的3倍，以1 ∶5的容积比用蒸馏水泡30 min，煎煮2 次(30 min/次)，过滤，去渣取汁，合并滤液加热蒸发，制成0.32 g/ml水煎浓缩液，4 ℃保存备用；多潘立酮按成人(60 kg/人)临床用量的3倍，用蒸馏水制成浓度为0.30 mg/ml。

1.3 营养性半固体糊的制备 羧甲基纤维素2.5 g，溶于62.5 ml 蒸馏水中，分别加入4 g奶粉、2 g糖、2 g淀粉，搅拌均匀，配制成73 ml 的营养半固体糊。4 ℃保存备用，用时恢复至室温。

1.4 试剂 内质网应激因子肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)一抗、肿瘤坏死因子受体相关因子2(TNF receptor associated factor 2,TRAF2)一抗均购自Abcam公司；辣根过氧化物酶标记二抗、浓缩型DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；RNAiso Pius、SYBR Premix试剂盒购自TaKaRa公司；逆转录试剂盒购自Thermo公司；引物设计合成由上海生物工程有限公司负责。IRE1上游引物：5′-GAC CGG CAG TTG CAG TAC AT-3′,下游引物：5′-TGG TCT GAT GAA GCA AGG TG-3′，扩增长度为118 bp;TRAF2上游引物：5′-GGC TTC TCC AAG ACC CTT CT-3′,下游引物5′-CAG GCA GAA GGA GCA GTA GC-3′，扩增长度为123 bp；GAPDH上游引物：5′-GGC ACA GTC AAG GCT GAG AAT G-3′，下游引物：5′-ATG GTG GTG AAG GCG CCA GTA-3′，扩增长度为143 bp。

由表3可知，籽仁率、千粒重、产量表现，均以处理RT的最低；S45下的籽仁率最大为66.46%，较S30，RT分别提高1.61百分点，5.40百分点，其中S45处理较RT差异显著；千粒重在S45处理下最大为108.04 g，较S30，RT分别提高13.1%，33.0%，并显示3种耕作方式下的差异达到显著；产量以S45处理的最高为4 457.70 kg/hm2，与S30和RT的差异存在显著，较S30，RT分别提高了6.32%，10.38%。

1.5 仪器 实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，普通PCR扩增仪(美国Bio-rad公司)，超微量样本分光光度计(美国Thermo Scientific公司)，正置荧光相差微成像显微镜(日本OLYMPUS 公司)，凝胶成像分析仪(美国Bio-rad公司)。

1.6 方法

1.6.4 免疫组化检测胃窦组织IRE1、TRAF2蛋白的表达 取经4%多聚甲醛固定的胃窦组织，制作石蜡切片。按照免疫组化法说明书检测IRE1及TRAF2蛋白的表达，镜检显色呈棕黄色者为阳性表达。每只大鼠观察2张切片，每张切片在400倍光镜下选取5个互不重叠视野，采用正置荧光相差微成像显微镜及其图像采集系统采集图片，并以Image-ProPlus6.0图像分析软件分析图片，测量积分光密度(IOD) 值，取均值作为结果。

1.6.2 标本收集 在实验第28天各组大鼠禁食不禁水24 h，第29天各组大鼠予以半固体糊灌胃，30 min后将大鼠予10%水合氯醛腹腔麻醉，剖腹，结扎贲门和幽门。迅速剪取全胃，用滤纸拭干，称取重量为全胃重量，沿胃大弯剪开胃体，观察胃残留食物情况及黏膜表面有无肿胀、潮红、糜烂、溃疡及其他器质性病变，并用冷生理盐水洗净胃内容物，滤纸拭干，再次称取重量为空胃重量。最后取距幽门0.5 cm的胃窦组织分为两份，一份用4%多聚甲醛固定，用于免疫组化检测；另外一份放入冻存管中快速液氮保存，再转移到-80 ℃冻存，待后续Real-time PCR指标检测。

式中，A0为单井控制灌溉面积（hm2）；Q为单井出水量（m3/h）；t为灌溉期机井每天开机时间（h/d）；T2为每次轮灌期天数（d）；η 为灌溉水利用系数；η1为干扰抽水的水量消减系数，经抽水试验确定，要求不大于0.2；m为最大灌水定额（m3/hm2）。

2.3 各组大鼠胃窦组织IRE1及TRAF2蛋白表达 IRE1、TRAF2蛋白阳性表达为胞质染棕色，免疫组化显示，柴胡疏肝散组、多潘立酮组细胞质偶见少许棕色，生理盐水组、模型组阳性染色明显，片状浓染分布于胞质，见图1、2。与模型组相比，柴胡疏肝散组和多潘立酮组IRE1、TRAF2蛋白表达明显下降(P<0.05)，IRE1中F值：10.41，TRAF2中F值：15.18。各组结果见表2。

1.6.1 动物模型制备 30只SD大鼠，随机分为正常组、模型组、生理盐水组、柴胡疏肝散组及多潘立酮组，每组6只，雌雄各半，每6只一笼。参照改良夹尾刺激法[6]制造FD大鼠模型，即用纱布包裹止血钳轻度钳夹大鼠尾部中后1/3处，立即放开，每次30 min，2 次/d，持续4周。除正常组、模型组外，其余各组于造模同一天分别给予0.9% NaCl、柴胡疏肝散煎剂及多潘立酮灌胃，1.5 ml/100 g，早晚各1次，间隔12 h，连续给药4周。

1.3 免疫组化结果判定标准 在200倍镜下，每张切片随机选取5个视野，计数细胞，每个视野计数100个细胞；共计500个细胞。按照染色阳性细胞所占比例进行A评级：0级(0%)、1级 (<10%)、2级(10%～50%)、3级 (>50%)；按阳性细胞显色强度进行B评级：0级 (无着色)、1级 (淡黄色，+)、2 (黄色，)、 3 级(棕褐色，)。免疫组化评分(IHS)=A×B；IHS<2为染色阴性，IHS≥2为染色阳性。B7-H4和B7-H6蛋白共同表达为双阳，两者之一表达为单阳，均未表达为双阴。

2.1 生活状态、组织学变化 大鼠在造模初期生活状态良好，发育正常，各组之间无明显差异。造模1周之后，除正常组外，其他组大鼠开始出现扎堆现象，毛发杂乱，情绪暴躁易激怒，夹尾大鼠体质量明显低于正常组大鼠。造模结束，解剖胃组织，可见胃窦表面光滑，有褶皱，无黏膜出血、溃疡、肿胀、潮红器质性改变。

黑米酒、小米酒等两款不同风味的米酒中的黄酮及多糖类化合物，主要来源于酿酒发酵原料及其在液体发酵过程中的浸出。绝大多数植物内都含有黄酮及多糖类化合物，其在植物的生长、抗菌防病等方面起着重要的作用。由图4可知，两组样品酒液中的黄酮含量差距不大，范围都在45～50 mg/L之间。黑米酒、小米酒等两款不同风味的米酒中都含有黄酮，但含量都较少。黑米酒中的总多糖含量高于小米酒，表明发酵过程中可能黑米原料中的多糖化合物更容易浸出。黄酮及多糖类化合物均具有抗氧化、清除自由基等生物功效，风味米酒中含有适量的黄酮及多糖类化合物，有利于提高酒体的营养价值，具有潜在的营养保健功效。

2.2 药物干预后胃排空率的比较 与模型组和生理盐水组比较，柴胡疏肝散组和多潘立酮组胃排空率均显著升高(P<0.05)，与正常组比较，模型组、生理盐水组胃排空率显著减低(P<0.05)，各组F值：13.25。见表1。

2 结果

1.6.5 Real-time PCR检测胃窦组织IRE1、TRAF2 mRNA 的表达 应用TRIzol法提取胃窦组织总RNA，用紫外分光光度计测定各组样品纯度。按反转录试剂盒明书操作，以 20 μl为体系将总RNA转录成单链，-20 ℃保存备用。进一步以模板(20 μl)+上/下游引物(各1 μl)+无核酸酶超纯水(6 μl)的反应体系，上荧光定量PCR仪进行扩增反应， 95 ℃预变性2 min，继以 95 ℃变性20 s，退火15 s, 72 ℃延伸30 s，如此反复40个循环后，结束后 4 ℃保存，每个循环结束后，采集荧光信号。每个样品设立3个复孔重复。结果采用相对定量2-ΔΔCt计算。

1.7 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件分析，实验结果以表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

表1 各组大鼠胃排空率比较

组别胃排空率柴胡疏肝散52.68±5.69*多潘立酮56.25±2.54*生理盐水11.60±3.53#模型13.97±3.39#正常69.83±2.41

与模型组比较：*P<0.05;与正常组比较：#P<0.05

图1 IRE1蛋白在各组大鼠胃窦的表达 免疫组织化学染色×400

A 柴胡疏肝散组；B多潘立酮组；C 生理盐水组；D 模型组；E 正常组

图2 TRAF2蛋白在各组大鼠胃窦的表达 免疫组织化学染色×400

A 柴胡疏肝散组；B多潘立酮组；C 生理盐水组；D 模型组；E 正常组

1.6.3 胃排空率测定 胃排空率=1-(全胃重量-空胃重量)/所灌固体糊重量×100%。

“一带一路”沿线的泰国、新加坡等亚洲国家近年来也加大了标准化工作力度。新加坡除等同采用了ISO 19100系列标准中的几乎全部标准外，还制定了自己的地理信息标准，涉及林业数据、位置数据、地表水数据和地理现象数据等，并新制定了新加坡3D地形测量标准与规范、新加坡公用设施测量标准与规范等标准。一直依赖援建国家标准或者翻译发达国家标准的泰国也于近几年开始，借助世界银行等国际组织的帮助，培养了一批高素质的标准化人才，并着手依据国际标准制定自己国家的地理信息标准。

表2 各组大鼠胃窦组织IRE1、TRAF2蛋白表达量的比较

组别IRE1(IOD值)TRAF2(IOD值)柴胡疏肝散2803.11±966.67*1000.27±163.50*多潘立酮3818.90±820.86*1064.98±119.52*生理盐水99920.40±1569.99△53031.22±9954.09△模型71437.32±14458.74△34268.24±9806.26△正常227.72±111.42258.34±64.16

与正常组比较：△P<0.05；与模型组比较：*P<0.05

2.4 各组大鼠胃窦组织IRE1及TRAF2的mRNA表达 如图3所示，RT-PCR检测结果显示，在143 bp处可见GAPDH的条带。生理盐水组、模型组在118 bp和123 bp处分别可见IRE1和TRAF2扩增条带，其余组只有微量的表达。相比正常组，模型组和生理盐水组的IRE1、TRAF2 mRNA的表达均升高(P<0.05)；相比模型组，治疗组IRE1、TRAF2 mRNA表达下降的更为明显，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 各组大鼠胃窦组织IRE1、TRAF2 mRNA的实时定量PCR电泳结果及相对表达量

A 柴胡疏肝散组；B多潘立酮组；C 生理盐水组；D 模型组；E 正常组：与正常组比较：*P<0.05；与模型组比较：△P<0.05

3 讨论

FD作为消化系统常见疾病，严重影响着人类正常的生活和健康。在对1 016个健康中国人的随机调查中显示：239例患有FD，其中有93例被不同程度的抑郁和焦虑困扰[7]。怎样有效地预防与治疗该疾病越来越受到医学界的关注。中医在防治FD方面有其独特的优势，临床上应用柴胡疏肝散治疗FD取得了不错的效果[8]。

私有云平台遵循OpenStack标准建设，整个私有云计算平台由云资源管理平台和一个或多个资源池系统组成，云资源管理平台包含多个远端资源管理模块。远端资源管理模块部署在资源池系统中，云资源管理平台通过资源管理接口(内部接口，OpenStack API)与远端资源管理模块互通，实现对资源池系统的管理。各资源池的全局IT网管信息可通过资源管理接口上报给云资源管理平台，在资源池部署的上层业务系统仍然按照原方式接入各自(数据)网管系统。

ERS是把双刃剑，它可以通过自己的代偿作用消除对机体不利的影响，但是当自身代偿不足以维持内质网稳态时，通过细胞凋亡或细胞自噬途径,细胞会发生损伤甚至死亡[9]。内质网腔中蓄积的或错误折叠的蛋白可通过自噬或凋亡被清除。这个过程的发生离不开内质网应激分子IRE1的参与，ERS促使IRE1与GRP78分离，通过二聚化和转磷酸化使IRE1的核酸内切酶活性被激活，可招募接头分子TRAF2，并可后续引起细胞自噬或凋亡等其他变化，造成FD的发生[10-11]。本研究显示，与正常组大鼠比较，模型组胃窦的IRE1和TRAF2蛋白与mRNA表达明显增高，说明FD大鼠的IRE1信号通路被激活。

本研究表明，与正常组比较，模型组大鼠的胃排空率偏低，说明造模使大鼠发生了胃肠动力障碍，大鼠胃窦无溃疡、肿胀、潮红改变，伴有情绪暴躁易怒、体重减轻，说明FD造模成功。柴胡疏肝散立足肝脾胃, 常用于治疗合并有胁肋疼痛，情志抑郁易怒，胸闷喜太息，或嗳气，腹胀痞满等症状的患者。柴胡疏肝散在临床上已广泛应用于治疗FD、肠易激综合征等胃肠动力障碍疾病，对这类疾病有明显的改善作用[12-14]。关于柴胡疏肝散对FD大鼠内质网应激相关分子IRE1和TRAF2表达的影响，相关文献报道较少。该研究在FD造模成功基础上，发现复方柴胡疏肝散可以提高FD大鼠的胃排空率，同时RT-PCR和免疫组化结果显示该药物可以降低大鼠胃窦组织中IRE1、TRAF2基因和蛋白的表达，说明其可以抑制IRE1、TRAF2的过度表达，改善内质网应激，从而提高胃肠道细胞活力，来达到缓解FD的作用。

参考文献

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