在我国，胃癌高发是疾病致死的主要原因之一。据2015年我国癌症统计报告，癌症发病达到429.2万/年，死亡病例高达281.4万[1]。胃癌的发生是环境与宿主基因等多种因素共同作用的结果[2]。慢性胃炎是胃癌形成最危险的因素。miRNA是宿主基因表观遗传学重要的调控因素。据报道miR-155是介导炎症和肿瘤的重要桥梁之一，在白血病细胞和实体瘤中高表达[3]。但胃肿瘤中miR-155如何与宿主基因相互作用，需要进一步探讨。

Kruppel 样因子(kruppel-like factor,KLF)家族是含有代表性的三个C2H2锌指样转录区域的锌指蛋白类转录因子，包括SP1样和KLF样家族在内的25个家庭成员。KLF4又称为胃肠富集KLF(GKLF)，其基因位于人类9号染色体长臂第三区第一条带，其通过锌指结构结合富含GC碱基的DNA序列。前期研究[4-5]显示胃癌中KLF4表达水平较正常组织明显下降，其表达与患者预后呈反相关性，KLF4表达降低与胃癌的发生发展关系密切[6]。但KLF4在胃癌中表达异常的原因未见报道。该研究通过建立稳定过表达miR-155-5p的细胞株初步探索其对KLF4影响及其功能。

1 材料与方法

1.1 细胞系 HEK-293T细胞，人胚胎肾上皮细胞系，用含10%血清的DMEM培养基培养，由本单位病理生理学省级重点学科实验室保存；胃黏膜上皮细胞株GES-1用含10%血清的F12培养基培养；AGS、GT-5、SGC-7901为胃腺癌细胞株，用含10%血清的DMEM培养基培养；以上细胞株均由西南医院病理科馈赠。大肠杆菌菌株DH5α用于扩增慢病毒表达载体和载体质粒的辅助包装，由本单位病理生理学省级重点学科实验室保存。

1.2 主要试剂 DNA ladder、T4DNA连接酶(美国Thermo Scientific公司)；Clone Express TMⅡ One Step Cloning Kit、DNA聚合酶(南京诺唯赞生物科技有限公司)；去内毒素质粒抽提试剂盒(德国Qiagen公司)；AgeI / NheI酶切(上海吉凯基因化学技术有限公司)；miRNA引物(上海捷瑞生物工程有限公司)；胰蛋白酶粉末(Tripsin)、Dulbecco＇s Modified Eagle Medium (DMEM)、Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium 1×(1640) (美国Gibco公司)；胎牛血清(广州康源生物技术有限公司)；嘌呤霉素(美国Sigma 公司)

1.3 主要实验方法

选取2015年2月1日～2016年2月1日收治的老年糖尿病合并脑梗塞患者100例作为观察组，另选取同期收治的中老年糖尿病患者100例作为对照组。排除标准：（1）临床资料不完整、（2）伴有精神疾病患者。纳入标准：（1）两组患者均签署知情同意书、（2）经过我院医学伦理委员会批准和同意。其中，观察组女50例、男50例，年龄50～80岁，平均年龄（65.21±1.15）岁；对照组女49例、男51例，年龄51～80岁，平均年龄（65.25±1.26）岁。两组患者平均年龄、性别等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.3.1.1 miR-155过表达慢病毒载体系统组成 由GV369、pHelper 1.0以及pHelper 2.0 三个载体质粒构成。GV载体包含人类免疫缺陷型病毒的3′LTR和5′LTR等基本元件和其他元件。pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒载体中也包含了包装病毒所需的基因蛋白。见图1。

1.3.1 miR-155过表达慢病毒载体系统

（一）制定合理的免疫方案 小鸡初免日龄最好先进行抗体检测，通常是7日龄ND-H120 一羽份点眼或滴鼻；21日龄新城疫IV2倍量饮水（如为蛋鸡，同时用新城疫灭活苗一羽份肌肉注射）；35日龄、90日龄分别再2.5～3倍量各饮水免疫一次；蛋鸡在开产后每两个月用IV3倍量饮水免疫。

1.3.2 稳定转染细胞株的建立

图1 质粒图谱

A：GV369；B：pHelper 1.0；C： pHelper 2.0

1.3.2.1 预实验 ① 铺板：接种2×104个目的细胞于24孔板中，设3个复孔，保证第2天进行病毒感染时细胞的融合度大约为30%；② 试剂稀释:使用完全培养基稀释polybrene (10 mg/ml),按1 ∶200稀释至浓度为50 μg/ml,感染体系使用终浓度为5 μg/ml；使用ENi.S液稀释病毒液至病毒滴度为1×108 TU/ml；③ 设3个感染浓度，感染条件为复感染指数(multiplicity of infection，MOI)=10时，F12/DMEM培养基445 μl + polybrene (50 μg/ml)50 μl+慢病毒液(1×108)5 μl，500 μl培养体系；MOI=20时，F12/DMEM培养基440 μl+polybrene(50 μg/ml)50 μl+慢病毒液(1×108)10 μl，500 μl培养体系；MOI=50时：F12/DMEM培养基425 μl + polybrene (50 μg/ml) 50 μl + 慢病毒液(1×108) 25 μl，500 μl培养体系；混匀；④ 根据细胞状态在感染后8～12 h内更换新鲜培养基；⑤ 感染2～3 d后，观察荧光表达，判断感染效果，确认最佳目的细胞感染条件。

2.4 过表达miR-155-5p对KLF4表达的影响 接着对miR-155-5p在胃癌中可能存在的功能作用进行了探索。通过Western blot检测了过表达miR-155-5p后 KLF4 蛋白表达。结果显示，GES-1细胞中，相较于对照组，过表达miR-155-5p抑制了KLF4蛋白表达,差异有统计学意义(F=5.702, P=0.041)，见图5。

1.3.2.2 正式感染实验 根据预实验确定最佳感染条件。① 24孔板中接种GES-1细胞1.5×104/孔，MOI=10条件感染miR-155模拟物/阴性对照慢病毒液-hsa-miR-155 mimic/Negative Control病毒；② 8 h后在细胞状态良好时更换新的培养液；③ 3 d后观察绿色荧光表达；④ 药物筛选与稳定细胞株的建立：通过设置不同的药物浓度梯度得到嘌呤霉素对于这两种细胞株的最低致死量，显微镜下观察。本实验筛选浓度为1 μg/ml。每隔3 d更换一次含有相应浓度嘌呤霉素的培养基。每周定期观察细胞状态和荧光强度，拍照记录。待细胞克隆扩大，即获得稳定表达目的基因的细胞株。

1.3.3 qRT-PCR检测miR-155表达 使用TRIzol提取GES-1细胞中总RNA。RNA提取后立即进行逆转录。逆转录和PCR反应试剂盒购自苏州吉玛基因股份有限公司(E22001-E22010)，按照说明书操作。逆转录反应程序为：25 ℃、 30 min，42 ℃、30 min, 85 ℃、5 min,逆转录产物于-80 ℃可长期保存。罗氏G480仪器进行荧光定量PCR, PCR反应程序为：95 ℃、3 min, 95 ℃、30 s，40个循环定量PCR反应 ，62 ℃、40 s。以U6作为内参进行相对定量分析。实验重复3次。

1.3.4 Western blot检测KLF4蛋白表达 抗KLF4抗体购自美国Abgent(AM2725A)公司；内参抗β-actin抗体购自美国Proteintech公司(6008-1-Ig)。蛋白提取全部在冰上操作。弃废液，预冷的PBS冲洗3次，加入适量含蛋白酶抑制剂的裂解液，摇床上快速裂解30 min。4 ℃离心，取上清液， 5×loading buffer与上清液混匀使其稀释至1×，即按4 ∶1的比例，99 ℃水浴10 min。电泳：10%蛋白分离胶电泳2 h；转膜：200 mA 1 h；封闭：5%脱脂牛奶2 h；一抗孵育：过夜，抗体浓度按1 ∶1 000配制。第2天上午TBST洗膜4次，每次5 min，二抗-鼠抗室温孵育1 h，TBST洗膜4次，每次5 min，凝胶成像仪显影，实验重复3次。

2.1.1 扩增目的miRNA引物信息 其中ACCGGT是AGEI酶切位点，上游为配对碱基，下游为目的基因钓取序列。见表1。

1.4 统计学处理 本研究实验均独立重复3次。使用Statistics 17.0进行统计分析。实验数据均用表示。多组间结果采用单因素方差分析ANOVA,注明F值，两组间结果采用独立t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.3 稳定过表达miR-155-5p细胞株的建立 为了下一步研究做准备，构建了稳定过表达miR-155-5p 及阴性对照的GES-1细胞株，见图4，荧光倒置显微镜镜下观察视野，两株细胞均有80%以上的感染效率。

1.3.5 MTT法检测细胞增殖 MTT试剂盒购自江苏凯基生物技术有限公司(货号:KGA312)。取生长状态良好的GES-1细胞，常规处理。计数后稀释细胞数至1×105。铺96孔板：加细胞数1 000个/孔，每组5个复孔，放入细胞培养箱中培养。设0、1、2、3 d。每天在同一时间加入50 μl 1×MTT,37 ℃培养4 h后弃上清液，加DMSO 150 μl/孔，摇床室温摇匀。检测490 nm波长处每孔吸光度。结果分析：将各孔的OD490值减去空白OD490值(即完全培养基加MTT,无细胞)，各复孔的OD490值取统计分析。实验重复3次。

表1 获取目的片段引物信息

引物序列号hsa-mir-155(9659-1)-P1GAGGATCCCCGGGTACCGGTCACAAACCAGGAAGGGGAhsa-mir-155(9659-1)-P2CACACATTCCACAGGCTAGCTGAAGTCTAAGTTTATCC

2.1.2 GV369酶切 PCR电泳图显示载体成功的被酶切成线性载体(图2A)；经重组连接后转化，转化子 PCR鉴定电泳图，说明重组载体构建成功(图2B)。图2C为重组慢病毒液不同滴度下明场视野和荧光视野图，Negative control病毒滴度检测为1E+9 TU/ml, miR-155-5p mimic病毒滴度检测为5E+8 TU/ml。

根据计算结果，以“区内相似、区间相异”为原则，本文将研究区分为地质灾害高易发区、地质灾害中易发区、地质灾害低易发区、地质灾害极低易发区4个区。结合频度分布曲线，为了合理划定不同分区的界限值，采用自然间断点分级法[28-29]对易发性分区图进行重分类，结果显示自然间断点分别为0.39,0.54,0.69。据此，可以确定易发性分区的界限值，即高易发区为(0.69,1)，中易发区为(0.54,0.69)，低易发区为(0.39,0.54)，极低易发区为(0,0.39)。利用GIS的重分类功能，得到分区结果如图2所示。

图2 Hsa-miR-155-5p过表达慢病毒载体的构建

A：PCR酶切电泳；B：转化子PCR鉴定；C：miR-155-5p mimic荧光法滴度测定图 ×200；1：10 bp DNA marker；2：载体酶切后产物；3：未酶切的载体；4：阴性对照ddH2O； 5：阴性对照；6：阳性对照GAPDH；7：5 000 bp marker；8～11： 1～4号转化子

2.2 miR-155在不同细胞株中表达的测定 通过qRT-PCR检测了miR-155在GES-1和各胃癌细胞株中的表达。结果显示，miR-155在胃黏膜上皮细胞株GES-1和恶性程度相对较低胃癌细胞株AGS中表达水平较低，在胃腺癌细胞株SGC-7901细胞中其表达较高，差异有统计学意义(t=-5.633，P<0.05)，以下研究在正常的胃黏膜上皮GES-1细胞株中进行验证。见图3。

图3 miR-155在恶性程度较高的胃癌细胞株中相对高表达

与GES-1细胞比较：*P<0.05;与GT-5细胞比较：#P<0.05

2.1 Hsa-miR-155-5p过表达慢病毒表达载体的构建

1.3.1.2 慢病毒载体构建和包装 第一部分：miRNA过表达慢病毒克隆的制备。 ① 使用限制性内切酶获得线性化的慢病毒载体；② 使用prime primer 5等引物设计软件设计获取目的片段的PCR扩增引物，扩增miRNA，获得miR-155-5p片段；③ 加入线性化的病毒载体DNA(GV369 vector病毒载体)和纯化后的PCR产物，在DNA连接酶的作用下将目的基因与病毒载体连接,获得环形重组质粒；④ 转化。反应产物与感受态细胞中混匀，置于冰上30 min；42 ℃热激90 s，冰水浴2 min；加入500 μl 溶菌肉汤培养基，37 ℃振荡培养1 h。取菌液涂板，挑取单克隆，PCR进行克隆鉴定。对阳性克隆进行测序，测序结果与miR-155目的序列进行结果比对，确保正确。抽提质粒从而获得高纯度的GV-369-hsa-miR-155-5p-mimic的慢病毒表达载体。第二部分：慢病毒包装和质量检测。以GV369(携带miR-155-5p mimic 序列)的工具载体质粒、病毒包装质粒 Helper 1.0 和Helper 2.0 共转到293T细胞中，转染后48～72 h收获细胞上清液(未纯化的病毒液)，经过浓缩与纯化即离心、过滤、低温高速离心2 h后弃上清液、加入病毒保存液得到高滴度的目的慢病毒液，最后进行病毒液滴度检测。按照预期的病毒滴度铺96孔板，通过梯度稀释的方法将病毒液加入96孔板中，感染3 d后观察荧光表达。病毒滴度的计算，如果在显微镜下看到2个荧光细胞，那么96孔板中应该至少有2个病毒颗粒感染了细胞，则病毒滴度为荧光细胞数/病毒原液量。

既往研究认为，JME难以治愈，即使癫痫长时间内得到控制，绝大多数病人也需要终生服药。近年来有些长期随访研究提示，在一些JME患者中，并不需要终身服用抗癫痫药物，停药数年后仍可保持发作终止，预后良好，有望治愈[28-29]。JME预后与发作类型、确诊时间、用药情况、脑电图表现等诸多因素有关，早期正确诊断，特别是赶在GCTS出现之前给予及时合理治疗，预后会更好，因此，更多的临床医生加强对此病的认识和判断，非常有意义。

图4 稳定过表达miR-155-5p细胞株的建立×100

A：miR-Nega；B：miR-155-5p-mimic；1：明场视野；2：荧光视野

2.5 过表达miR-155-5p对GES-1细胞增殖的影响 MTT法检测过表达miR-155-5p 对GES-1细胞增殖的影响。结果显示：与Normal control组比较，随着天数的增加，在GES-1细胞中过表达miR-155-5p后增殖较快，且在第2天和第3天较为明显，差异有统计学意义(F=96.980、37.797，P<0.001)；过表达miR-155促进了GES-1细胞增殖。见图6。

图5 过表达miR-155-5p抑制了KLF4蛋白表达水平

1：Normal control；2：miR-Nega；3：miR-155 mimic；与Normal control组比较：*P<0.05

图6 过表达miR-155-5p 促进了GES-1细胞增殖

与Normal control组比较：**P<0.01，***P<0.001

3 讨论

miRNA是一个片段短的、非编码的小RNA分子，研究[7]显示miRNA在生理学与病理生理条件下广泛的参与到了多种靶基因的转录后水平的调控，在调控疾病发生和发展中扮演着十分重要的角色，对其已经进行了大量的研究和讨论。目前研究在很多实体肿瘤中显示miRNA 的异常表达或者miRNA基因突变，比如白血病、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌等等。miR-155由B细胞诱导的淋巴瘤的禽白血病病毒整合的B细胞整合簇转录而来。miR-155-5p通过作用于不同的靶基因在癌症当中发挥了不同的功能。一些研究[8]显示miR-155-5p在正常细胞向肿瘤细胞转化的过程中起到了重要的作用，骨髓中miR-155-5p的缺失造成了M2型巨噬细胞的集聚。miR-155-5p通过下调TP53INP1、DMTF1等抑癌基因的表达而发挥了一个癌基因的作用[9]。miR-155-5p通过靶向经典的癌基因c-myc等充当抑癌基因的角色也有报道[10]。miR-155-5p功能的多样性使得很多学者对其产生了浓厚的兴趣，但是也增加了研究的难度。

本研究对miR-155-5p在胃癌中的功能做了初步的探讨。首先构建了过表达miR-155-5p基因的慢病毒表达载体(图2)，其感染效率高、毒性小，是常用的手段之一。PCR结果显示GES-1和恶性程度相对较低的AGS细胞株中miR-155表达较低(图3)。因此，通过慢病毒转染的方式，建立了稳定过表达miR-155-5p的GES-1细胞株(图4)，这为以后研究miR-155功能的体内外实验奠定了良好的基础。KLF4是一个含有锌指结构的转录因子，已经证实在胃肠道肿瘤中发挥着抑癌基因的作用。本研究通过生物信息学预测显示KLF4 有可能是miR-155靶基因，因此本研究在蛋白水平上做了验证，显示miR-155能够抑制KLF4蛋白表达(图5)，并且miR-155促进了胃黏膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞AGS的增殖(图6)，这在一定程度上说明miR-155有可能在转录后翻译的水平抑制KLF4表达，进而参与胃癌的发生发展。但是在胃癌中，miR-155功能还需要在体内外水平上进一步验证。

清末民初，在社会教育和通俗教育思潮的推动下，儿童教育日益受到社会各界的关注，儿童图书馆建设也受到各级教育社团及组织的重视。自1920年开始，中华教育改进社、中华图书馆协会、苏浙皖三省师范附小联合会等组织均通过了推动儿童图书馆发展的相关议案，各类型儿童图书馆的建设逐步展开，故此阶段被研究者称为“儿童图书馆运动”的兴起［1］（39）。 相关的儿童图书馆研究著作也有一定增长，1924年，陈逸翻译的日本金泽慈海等著的《儿童图书馆之研究》由上海商务印书馆出版；1929年，王京生翻译并刊印美国图书馆协会编的《儿童图书馆》，这些均为对国外儿童图书馆情况的介绍。

室内试验表明，应力路径对饱和砂土液化有重要影响。图6为沉管近、远场海床的应力路径由图6可见，沉管远场海床监测点6处遵循Ishihara[18]指出的典型应力路径：应力主轴连续偏转，偏应力(几乎)保持不变。然而，沉管近场海床的应力路径则明显不同，呈斜椭圆型，意味着在应力主轴连续偏转的同时偏应力幅值也在不断变化。

胃癌的发展是一个从慢性胃炎、胃溃疡、萎缩性胃炎、肠化生、异常增生到癌症的一个发病过程，导致其发生的分子机制复杂。各种因素导致的慢性胃炎的持续发生是导致胃癌发生的最危险因素。在正常的胃黏膜上皮中，miRNA表达不同；在慢性胃炎、胃溃疡、胃黏膜相关淋巴瘤等胃疾病中不同的miRNA 表达也有差异[11-12]。尽管miRNA的功能已经进行了很多的研究，但是在炎症发生到胃癌形成的过程中，异常表达的miRNA在胃癌的发生发展中又发挥了怎样的作用目前尚不清楚。报道[13]表明miR-155是调控免疫系统最重要的miRNA之一,其通过作用于不同的单个或者多个靶基因影响机体的免疫反应。miR-155靶向抑制κB-Ras1,从而增强了NF-κB的活性，最终造成了骨髓微环境中骨髓炎症的持续发生，导致骨髓增生性疾病[14]。在慢性淋巴细胞性白血病的B细胞中miR-155尤其高表达，有望成为B细胞淋巴细胞增多症恶性进程的生物标志[15]。目前，对miR-155在胃癌中的功能还知之甚少。了解miR-155在慢性胃炎至胃癌形成的过程中如何发挥其调控作用将会对胃癌发病机制研究提供有力的参考依据，同时这也是需要克服的难点。

（五）病虫害防治。芦笋的主要病虫害有茎枯病、褐斑病、根腐病、蓟马、飞虱等。物理防治采用蓝光灯或蓝板诱杀飞虱；农业防治要施足优质有机肥，合理密植，清洁田园。

参考文献

[1] Chen W, Zheng R, Baade P D, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin,2016, 66(2): 115-32.

[2] Amieva M R, El-Omar E M. Host-bacterial interactions in Helicobacter pylori infection[J]. Gastroenterology,2008, 134(1): 306-23.

[3] Cui B, Chen L, Zhang S, et al. MicroRNA-155 influences B-cell receptor signaling and associates with aggressive disease in chronic lymphocytic leukemia[J]. Blood,2014, 124(4): 546-54.

[4] Wei D, Gong W, Kanai M, et al. Drastic down-regulation of Kruppel-like factor 4 expression is critical in human gastric cancer development and progression[J]. Cancer Res,2005, 65(7): 2746-54.

[5] Wei D, Kanai M, Huang S, et al. Emerging role of KLF4 in human gastrointestinal cancer[J]. Carcinogenesis,2006, 27(1): 23-31.

[6] Li Q, Jia Z, Wang L, et al. Disruption of Klf4 in villin-positive gastric progenitor cells promotes formation and progression of tumors of the antrum in mice[J]. Gastroenterology,2012, 142(3): 531-42.

[7] Lin Q, Ma L, Liu Z, et al. Targeting microRNAs: a new action mechanism of natural compounds[J]. Oncotarget,2017,8(9):15961-70.

[8] Fassi Fehri L, Koch M, Belogolova E, et al. Helicobacter pylori induces miR-155 in T cells in a cAMP-Foxp3-dependent manner[J]. PLoS One,2010, 5(3): e9500.

[9] Peng Y, Dong W, Lin T X, et al. MicroRNA-155 promotes bladder cancer growth by repressing the tumor suppressor DMTF1[J]. Oncotarget,2015, 6(18): 16043-58.

[10] Sun S, Sun P, Wang C,et al. Downregulation of microRNA-155 accelerates cell growth and invasion by targeting c-myc in human gastric carcinoma cells[J]. Oncol Rep,2014, 32(3): 951-6.

[11] Feng Y, Wang L, Zeng J, et al. FoxM1 is overexpressed in Helicobacter pylori-induced gastric carcinogenesis and is negatively regulated by miR-370[J]. Mol Cancer Res,2013, 11(8): 834-44.

[12] Teng G G, Wang W H, Dai Y,et al. Let-7b is involved in the inflammation and immune responses associated with Helicobacter pylori infection by targeting Toll-like receptor 4[J]. PLoS One,2013, 8(2): e56709.

[13] Gironella M, Seux M, Xie M J, et al. Tumor protein 53-induced nuclear protein 1 expression is repressed by miR-155, and its restoration inhibits pancreatic tumor development[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2007, 104(41): 16170-5.

[14] Wang L, Zhang H, Rodriguez S, et al. Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner[J]. Cell Stem Cell,2014, 15(1): 51-65.

[15] Ferrajoli A, Shanafelt T D, Ivan C, et al. Prognostic value of miR-155 in individuals with monoclonal B-cell lymphocytosis and patients with B chronic lymphocytic leukemia[J]. Blood,2013, 122(11): 1891-9.