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肺炎支原体肺炎患儿外周血及小鼠模型miRNAs差异表达

更新时间:2016-07-05

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)是介于病毒与细菌之间的一种病原微生物,其引起的肺炎支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae pneumonia, MPP)是儿童常见呼吸道感染疾病。有资料指出,儿童社区获得性肺炎中支原体肺炎占10%~40%[1-2]。MPP临床可表现易复发或迁延不愈,重症病例还可合并肺外组织器官病变,对儿童健康危害严重。目前认为机体在感染MP后通过激活免疫细胞产生多种炎症因子,通过免疫应答介导和调节免疫功能及炎症反应,导致MPP的发生和发展,但具体分子机制不明。

近年来,miRNA已作为一类全新的基因调控分子被研究者所认识。miRNA是一类进化上非常保守的内源性非编码短链的小RNA,已有研究表明它可以参与多种疾病的发生发展,有研究[3]证实抑制miR-221表达后哮喘小鼠模型中气道炎症反应减轻。目前miRNA在支原体肺炎的表达报道较少。本研究前期通过康城公司的miRNA芯片技术筛选MPP患儿和正常儿童血液淋巴细胞中存在差异表达的miRNAs,利用信息数据库选取参与炎症因子调控的存在差异表达显著的miRNAs,并通过RT-PCR方法验证芯片检测结果的准确性,同时在MP感染动物模型肺组织中进一步验证,为今后的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 资料

“王小景同学,你觉得大东沟海战,北洋水师失利的原因有哪些?”詹寻站在显示屏右边的电子地图前,看着用红蓝箭头分别标注的清军和日军的路线。

高家来人了,杨露露带着高成山和高枝赶来谷村;杨露露进了灵堂,坐在桃花对面,一声长一声短地号哭。黄家人原本还担心她责难,但她倒是通情达理的,只怪高木命薄。大家唏嘘不已。杨露露后悔当初不该拆散高木与桃花,如果当初她能像现在这么想,成全了他们,高木也就没事了;但人世间哪有后悔药可买,一切都已经发生了。高木在母亲的哭声中化作一捧灰,埋进了黄家的祖坟。他和梨花埋在一起,埋在张彩凤的右侧。

1.1.1 病例资料 病例均选自2016年3~8月在南京儿童医院呼吸科病房住院并确诊的MPP患儿。诊断标准参考第7版实用儿科学有关MPP的标准[4]:符合社区获得性肺炎诊断的前提下,满足以下标准之一:① MP-IgM阳性或恢复期MP-IgG滴度升高4倍及其以上;② 痰FQ-MP-DNA阳性,且≥1×104 copies/ml。排除常见的其他细菌和病毒感染,不伴有肺结核、支气管哮喘等其他呼吸系统疾病且留取标本前未使用大环内酯类、糖皮质激素及免疫调节剂。疾病组24例,其中男12例,女12例;年龄2~14(4.5±1.2)岁。正常组24例,男12例,女12例;年龄1~9(5.5±1.7)岁;均为同期在南京儿童医院外科准备行择期手术住院的患儿,近期无感染和慢性疾病史,且排除过敏性和免疫相关性疾病。其家长均知情同意并征得医院伦理委员会同意。经检验,两组间年龄、性别、体质量差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.3.1 芯片结果统计学分析 中值校正法获得校正后的标准化数值,标准化数据值=原始值-背景值/中位数。差异基因筛选软件为Significance Analysis of Microarrays(SAM,version 2.1)。

1.2 方法

1.2.3 基因芯片 委托上海康成生物公司完成miRNA的芯片检测。

1.3 统计学处理

2.1 疾病组患儿与正常组儿童外周血淋巴细胞中差异表达的miRNAs 通过miRNA芯片检测,将MPP患儿外周血淋巴细胞中miRNA基因的表达与正常儿童相比,初步筛选出105个表达上调的miRNA基因和133个表达下调的基因(P<0.05)。其中在表达差异较大的miRNAs中,利用信息数据库选取参与炎症因子调控的miRNAs,进一步采用实时定量PCR验证,结果如图1所示,miR-126、miR-181、miR-146a表达量相对升高(t=14.52、9.92、8.50),miR-155表达量相对降低(t=-8.93)。

1.2.1 人外周血淋巴细胞的分离 疾病组及正常组患儿均于入院次日清晨采2 ml新鲜抗凝血,采用人外周血淋巴细胞分离液,分离收集淋巴细胞,加TRIzol后置于-80 ℃冰箱备用。

1.2.4 小鼠肺组织病理 取小鼠右肺下叶置入 4%甲醛溶液固定,后经石蜡包埋、切片、HE 染色,进行组织病理学观察。

1.3.2 统计学分析 应用SPSS 20.0统计软件进行分析,数据以表示,两小样本均数之间的比较经方差齐性检验,方差齐后选t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

为精确地描述液固两相流的流动特征,适应较高浓度泥浆流的模拟,并且在准确性和计算量之间达到平衡,采用基于颗粒流动力学理论的欧拉-欧拉双流体模型进行研究。

1.1.2 动物模型资料 选用生后3周龄BALB/c小鼠24只,雌雄各半,置于SPF级动物室饲养1周,体质量(14.89±2.31)g。

1.2.5 实时定量PCR 使用实时定量 PCR 试剂盒(中山大学达安基因股份有限公司)进行小鼠BALF沉淀物中MP DNA定量检测,采用实时定量PCR试剂盒(SYBR Green荧光定量PCR试剂盒,瑞士Roche公司)进行小鼠肺组织相关miRNA定量检测,实验步骤按照试剂盒说明书进行。各样品的MP-DNA及目的miRNA的测定,数据采用2-ΔΔct法进行分析。

2 结果

1.2.2 MP感染模型建立及标本留取 将小鼠称重,腹腔注射4%水合氯醛 0.1 ml/10 g,固定小鼠于动物手术台上,置于超净工作台中,戴无菌手套,抬高鼠板头端,干预组每只小鼠滴鼻接种浓度为108 CFU/ml MP菌液20 μl,随小鼠的自然呼吸动作MP菌液到达下呼吸道,空白组予等量灭菌生理盐水滴鼻吸入,滴注后竖起动物固定板,保持小鼠直立体位,直至恢复正常呼吸,头部稍高(以防胃内容物误吸)放置至小鼠苏醒。在干预第4天,处死小鼠。留取小鼠肺泡灌洗液(BALF),离心后弃上清液,取沉淀提取DNA,同时留取小鼠肺组织切片做组织病理学检测,并留取肺组织RNA以做进一步检测。

图1 疾病组患儿与正常组儿童外周血淋巴细胞中miRNAs的表达差异(n=12)

与正常组比较:*P<0.05

2.2 验证miRNA在支原体感染小鼠肺组织中的表达 小鼠肺组织病理结果显示,MP感染4 d后干预组小鼠肺泡间隔明显增宽,支气管和血管周围可见炎症细胞浸润,同时杯状细胞增生明显,见图2A。进一步通过PCR检测发现干预组小鼠BALF中MP DNA的相对表达量明显高于空白组(t=7.31),见图2B,提示模型构造成功。实时定量PCR检测显示,在干预组小鼠肺组织中,miR-126、miR-181、miR-146a相对表达均有不同程度的升高(t=9.75、7.63、8.74),而miR-155的相对表达降低(t=-7.83)。这与前一结果的趋势基本一致,见图2C。

3 讨论

目前MPP已成为儿童的常见病,由于病程较长,症状较重,易引发多种肺外并发症而越来越受到关注。但MPP引起的炎症反应的发生机制尚不十分清楚。目前认为MPP是免疫机制参与的全身性疾病,免疫细胞及细胞因子在免疫损伤中占主导地位[5],而其中引起病理变化的分子机制并不十分明确。本研究通过miRNA芯片检测发现在MPP患儿外周血淋巴细胞中miRNA存在表达差异,提示miRNA可能参与MPP的发生发展。在这些miRNA中,本课题组经过进一步PCR验证发现miR-126、miR-181、miR-146a相对表达量不同程度的上调,miR-155相对表达量下降,结果与芯片趋势一致。为了进一步验证MP感染对肺组织局部miRNA表达的影响,本研究构建了MP感染小鼠模型,通过组织病理及肺泡灌洗液中沉淀物内MP-DNA测定均验证了模型构建成功。通过PCR检测显示MP呼吸道感染后小鼠肺组织内上述4个miRNA均有类似改变,进一步提示其可能参与MPP的发生发展。

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图2 miRNA在支原体感染小鼠肺组织中的表达

A:小鼠肺组织病理学变化; B:小鼠BALF中MP DNA相对拷贝数变化;C:小鼠肺组织中miR-126、miR-181、miR-146a、miR-155表达变化;a:空白组;b:干预组;与空白组比较:*P<0.05

有研究[6]已指出miRNA可以参与炎症的发展,如let-7家族通过抑制IL-13的表达,对IL-13的分泌及TH2细胞介导的炎症反应起着主要的调控作用;肺部炎症损伤时,miR-127表达水平下调, 而增强miR-127的表达可抑制巨噬细胞释放细胞因子[7]。已知机体在感染MP后通过激活免疫细胞产生多种炎症因子,通过免疫应答介导和调节免疫功能及炎症反应,导致MPP的发生和发展。本研究显示 miR-126、miR-181、miR-146a、miR-155在MPP患者血清中及MP呼吸道感染小鼠肺组织中存在差异表达,提示以上miRNA可能参与MPP的疾病发展。现有研究指出,miR-126表达抑制后可以减少气道炎症反应,减轻气道高反应性,减少嗜酸性粒细胞及中性粒细胞在肺泡灌洗液及肺组织的浸润,同时抑制TH2细胞,减少炎症因子IL-5、IL-13的释放[8]。哮喘患者气道上皮和血浆中miR-181表达水平与哮喘的嗜酸性粒细胞炎症程度有明显相关性,提示该miRNA可能参与了气道嗜酸性粒细胞炎症。miR-146a的抑制剂可增加IL-1β诱导IL-8和趋化因子的释放,而miR-146a的模拟物则能发挥抑制作用,表明miR-146a可以负性调节IL-1β诱导的炎症反应[9]。miR-155可调节人类巨噬细胞对IL-13的反应,其靶向基因是IL-13α1,通过调控IL-13通路,进而使TH1/TH2平衡向TH1方向倾斜[10]。以上均提示这些miRNA分子可能在MPP疾病过程中参与的炎症反应,值得进一步探索。

本研究通过前期芯片技术的筛选以及后期RT-PCR方法验证,发现在MPP中,miR-126、 miR-181、 miR-146a表达上调,miR-155表达下降,而这些miRNAs在此前文献报道中已提示与炎症反应及炎性介质释放有不同程度的相关性,故提示它们可能通过调节炎症因子及炎症介质的释放参与疾病的发生发展,为MPP的进一步研究提供了理论基础。

裂缝在主应力方向上延伸的基础上,向储层降压严重的邻井偏转。通过对韩城区块高产井组排采数据反褶积处理后进行试井分析,对不同年度降压半径扩展速度计算发现:韩城开发区压降漏斗的扩展速度较慢,经过5年的排采,降压半径57.6~187.5 m,韩城区块主流开发井距为280~350 m,因此在渗透率相对较低的区域,压降半径小,不易受邻井压裂影响,渗透率高的井区,压降半径大,易受邻井压裂影响,导致产气量降低。在已知压力波及时间 t 时,可用以下公式推算波及距离为

参考文献

[1] 柯莉芹, 王凤美, 李银洁,等. 儿童肺炎支原体肺炎流行病学特征[J]. 中国当代儿科杂志, 2013, 15(1):33-6.

[2] Youn Y S, Lee K Y, Hwang J Y, et al.Difference of clinical features in childhood Mycoplasma pneumoniae pneumonia[J]. BMC Pediatr, 2010, 10 (1) :48.

[3] Qin H B, Xu B, Mei J J, et al. Inhibition of miRNA-221 suppresses the airway inflammation in asthma[J]. Inflammation, 2012, 35(4): 1595-9.

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[10] Martinez-Nunez R T, Louafi F, Sanchez-Elsner T. The interleukin 13 (IL-13) pathway in human macrophages is modulated by microRNA-155 via direct targeting of interleukin 13 receptor alpha1 (IL13Ralpha1)[J]. J Biol Chem, 2011, 286(3):1786-94.

许长娣,周瑶,赵德育,刘峰
《安徽医科大学学报》2018年第4期文献

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