传统的聚合酶链式反应（polymerase chain re⁃action，PCR）由于需要3个不同的热循环，还需要对反应产物进行电泳或荧光标记等多种操作，大大限制了其在口岸检测和产地检测等现场平台上的应用。随着技术发展，已经开发了更加方便的等温扩增技术如核酸序列基础扩增（nucleic acid sequence⁃based amplification，NASBA）、旋转聚合酶扩增（rotational polymerase amplification，RPA）、解旋酶依赖扩增（helicase dependent amplification，HDA）、聚合酶螺旋扩增（polymerase spiral amplifi⁃cation，PSR）、环介导等温扩增（loop⁃mediated iso⁃thermal amplification，LAMP），其中 LAMP 技术是最具有代表性的等温（60～65℃）核酸扩增程序。该技术通过使用一种具有链置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）和一套共4条引物进行扩增反应。

环介导等温扩增技术首次报道于2000年，目前已经经历了十余年的研究和发展，广泛用于单核苷酸多态性、病毒和病原体检测［1］。随着越来越多的科学家研究LAMP技术，使得此技术使用范围不再局限于病原微生物的检测和定量，LAMP技术也应用于寄生虫和胚胎鉴定领域。Yeeling等［2］介绍了LAMP技术检测弓形虫。最近，用于检测寄生虫的LAMP试剂已经被商业化。Zoheir等［3］使用LAMP方法用于牛胚胎性别鉴定。同时，研究人员也在寻找一些其他能够与LAMP结合使用的技术，使检测技术更加优化。例如，Wang等［4］开发了环介导等温扩增⁃横向流动试纸条技术（loop⁃mediat⁃ed isothermal amplification ⁃lateral flow dipstick，LAMP⁃LFD）用于检测转基因大豆，这种新的方法结合了免疫层析和LAMP技术，成功地把LAMP技术应用于转基因食品的检测。另外，根据实际检测需求，研究人员对此技术进行大量改进，主要集中在提高特异性、加快反应速度、简化样本处理、实现多重扩增以及应用于现场检测平台等方面。本综述回顾了近年对LAMP技术本身简单化、快速化和产物检测特异化等方面的改进所进行的研究，同时总结了近期开发应用的新型LAMP检测技术，为环介导等温扩增技术的发展和实际应用提供依据。

1 环介导等温扩增技术的基本原理及优势

LAMP体系的反应温度之所以在60～65℃范围内，一是因为Bst DNA聚合酶在此温度下才具有活性，二是因为这是双链DNA发生复性和延伸的中间温度，DNA会呈现一种动态平衡的状态，其中任何一条引物与DNA结合并发生扩增时，另一条链会自动脱落形成单链，在酶的作用下不断发生链置换反应，不断自我循环［5］。LAMP反应被人为地划分成2个扩增阶段：第一阶段为起始阶段，主要为了形成第二阶段循环的起始复合物—“颈环结构”；第二阶段是扩增循环阶段，以“颈环结构”作为第二阶段扩增反应的模板，启动新一轮链置换反应，最终获得含有不同数量的颈环结构、不同长度的DNA混合物，且产物是对靶序列的交替反应扩增的重复序列［6］。

LAMP是一种新的检测技术，具有明显的优势。第一，与传统的检测方法相比，LAMP检测的特异性高。4条引物分别用来扩增6个不同靶区域，一旦任何一个引物不能准确匹配，将会导致反应不能发生，也就是说理论上将显著降低非特异扩增的发生［7］。第二，LAMP的灵敏度比传统PCR扩增检测高10～100倍，其检测限达到10个拷贝或者更低。换言之，LAMP技术可以在很早期阶段，或者在临床症状不明阶段，检测到疾病的发生［8］。第三，检测时间比传统PCR扩增检测缩短很多。LAMP具有高度的扩增有效性，其主要归因于无需复杂的变温条件和不同的反应程序。LAMP技术能够在 15～60 min 内，使 DNA 扩增 109～1010倍，故与传统PCR扩增相比检测时间能够缩短1 h左右［9］。最后，LAMP技术最大的优势是操作简单和可视化检测［10］。例如，当运用LAMP技术检测病原微生物时，可以直接通过动物疾病组织的核酸进行扩增检测，而不需要进行单独的细菌培养和复杂的核酸提取步骤。同时，LAMP反应仅需一台恒温设备如水浴锅或恒温箱就能满足对实验的基本需求，其反应设备简单。另外，LAMP反应合成大量核酸分子的过程中，会产生大量的焦磷酸离子，与反应液中Mg2+结合生成不溶于水的焦磷酸镁，经过离心后可以通过肉眼观察是否有白色沉淀生成从而鉴定是否发生核酸扩增，也可以在体系中加入适量颜色指示剂如钙黄绿素、羟基萘酚蓝、SYBR Green I等，通过相应的颜色变化直接呈现出扩增的结果。

2 环介导等温扩增技术改进

2.1 操作简单化与快速化

LAMP技术相较于基础PCR检测技术最具特色的优点是简单、快速。目前，LAMP技术的改进主要集中在进一步增强和发挥这2方面的优势。

目前LAMP技术主要的缺点是结果评估的间接性，其扩增产物通过电泳、SYBR Green I染色、沉淀、羟基萘酚蓝染色、浊度法、钙黄绿素/Mn2+染色以及探针法等方法进行确认。这些都不能很好区分阳性产物和非特异性扩增产物，从而导致假阳性。分子信标（molecular beacons）具有只与目的DNA片段结合后才产生荧光信号的特点，因此作为一种直接的扩增产物指示剂，能够避免假阳性的问题。Liu等［40］研究了一种新型的分子信标指示的环介导等温扩增方法（molecular beacon loop⁃mediated isothermal amplification method，MB⁃LAMP），明确了LAMP技术中分子信标作为评估工具的最优条件：长度为25～45 bp，浓度为0.6～1 pmol/μL，反应温度为 60～65℃，并且 MB⁃LAMP 检测灵敏度能够达到1×10⁃6ng/μL。使用分子信标指示的LAMP技术有效降低了检测结果假阳性率。

电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）是一种敏感性检测方式，其在电极表面产生高能状态并且促进电子转移，这种电子转移现象能够通过激发光而作为一种强度信号被检测［37］。［Ru（bpy）3］Cl2是一种常用的ECL发光体。各种ECL生物传感器需要核酸表面固化。最近，有研究报道了一种无需固化的ECL技术，通过设计2个辅助探针进行 micro⁃RNA 检测［38］。Roy 等［39］研究了LAMP联合ECL技术对DNA检测和定量分析，经由LAMP反应扩增的目的DNA，通过静电作用与碳电极表面的［Ru（bpy）3］+2结合，再通过三丙胺（TPrA）触发ECL反应从而发出荧光。他们把这种新技术用于检测不同物种肉中特异序列的DNA水平。例如，从野猪肉中检测到1 pg/μL（3.43×10⁃1copies/μL）的靶 DNA。对枯草杆菌（Bacillus subtilis）DNA 样品的检测限为 10 pg/μL（2.2×103 copies/μL）。因此，这种方法的优势是快速检测、最低限度的仪器使用以及更少的试剂使用。把具有高敏感性和特异性的ECL技术与LAMP快速扩增技术结合起来成为一种有效的定量核酸检测技术，这种技术满足现代核酸检测中快速、敏感性、特异性、易于操作以及设备微型化的要求。

转换后行为认知成本，指的是用户在全新电商平台下，付出成本和学习新课程的成本。当前电商平台在对界面设计、网页浏览操作等环节上存在较大差别，因此用户所感知的服务质量上会出现较为明显的差异，不利于后续工作的开展，甚至对用户忠诚度的维持也将产生负面影响。

超速提取（procedure for the ultra⁃rapid extrac⁃tion，PURE）方法是一种从新鲜唾液中直接提取结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，TB）细胞的技术［16］。该技术通过使用一种吸附粉末来移除样品中的DNA抑制剂，从而保护样品中的DNA。并且，此技术无需复杂的设备如离心机，可以在发展中国家落后的地区使用。Nakauchi等［17］研究了一个方便使用的检测流感病毒的提取试剂，把咽喉或鼻拭子在此试剂中搅拌几次，即可提取流感病毒基因组RNA，同时还能消除RNA抑制剂。与其他实验室所进行的前处理方法相比，这一技术无需加热和离心。目前，这一提取试剂仅限于流感病毒的提取。Aydin⁃Schmidt等［18］开发了高通量DNA提取系统的环介导等温扩增技术（high throughput DNA extraction system for loop mediated isothermal amplification，HTP⁃LAMP），用于检测无症状人群疟原虫，通过商品化的和计算机控制的高通量DNA提取系统能够同时提取96个样品，其提取液可直接用于LAMP检测，并在2 h内获得检测结果。与传统PCR检测结果相比，HTP⁃LAMP检测灵敏度为 40.8%（95%CI：27.0～55.8），特异性为 99.9%（95%CI：99.8～100）［18］。超速提取方法能够大大缩短样品中核酸的提取时间，从而提高LAMP的检测速度，适合在大样本检测中使用。

最近，新英格兰生物实验室开发一个新DNA聚合酶，叫做Bst 2.0或WarmStart Bst 2.0。Tanner等［15］评估了这些新的聚合酶在LAMP检测中的应用，发现Bst 2.0与野生的Bst DNA聚合酶相比，能够催化更快的LAMP反应速度。这些发现表明，开发新的DNA聚合酶是改进LAMP技术快速化的关键因素。

对蛋白生物标志物的高灵敏度和特异性检测，在临床疾病诊断和治疗预后中显得非常重要。粘蛋白1（mucin 1 protein），作为一种肿瘤标志物，存在于许多恶性肿瘤中，如结直肠癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌等［27⁃29］。粘蛋白1在人正常上皮细胞表达非常低，因此对其进行灵敏度和特异性检测在早期肿瘤诊断中就显得非常必要。最近，Joo等［30］报道了不同的免疫环介导等温扩增（immuno⁃LAMP）平台用于检测蛋白质。免疫环介导等温扩增技术包含2个主要步骤，信号扩增和超敏检测。为了提高蛋白检测的特异性和灵敏度，使用亲和配体用于靶蛋白分子的识别［31⁃32］。配体为系列合成的DNA或RNA分子，具有高特异性和高亲和性。Cao等［33］通过高亲和粘蛋白1配体，开发出一种配体介导的免疫环介导等温扩增技术，用于定量检测人血清样品中粘蛋白1。其重要步骤为，生物素标记的粘蛋白1固定在链霉亲和素磁珠上，与粘蛋白1配体孵育；游离的粘蛋白1配体通过磁珠分离，蛋白结合的配体结构通过加热后解离；最后，解离的配体作为F3引物，通过re⁃al⁃time immuno⁃LAMP 技术进行定量。因此，im⁃muno⁃LAMP核酸扩增信号等同于F3引物的量，并且间接反映粘蛋白1的量。此种方法检测限可达120个分子。

2.2 检测特异化

由于食物来源病原体微生物能够引起严重的疾病，并可能导致巨大的经济损失，因此通过分子检测技术检测食物来源病原体来预防严重损失是非常必要的［34⁃35］。Seo 等［36］研究开发了一种高通量、微型离心装置、基于比色法的食品来源病原体的检测方法。开发的离心微型装置包括一个样品容器，一个螺旋形样品注射微通道，24个腔室（每个2.5 μL），交叉毛细管阀门和24个反应室。装载样品后行850 r/min离心，使得样品溶液分布到24个等体积的腔室内。然后，腔室内的样品可以被注射到反应室内，5 000 r/min离心，离心装置放置于66℃温箱中进行靶基因的扩增。对于基因扩增方法，使用LAMP技术对3种食物来源病原体（大肠杆菌O157：H7，鼠伤寒沙门氏菌和副溶血性弧菌）进行检测。通过铬黑T（eriochrome black T，EBT）介导的颜色变化（从紫色到天蓝色）来确定病原体的存在，通过绿/红（G/R）和蓝/红（B/R）比值来区分阳性结果和阴性结果，整个分析过程在1 h内完成。DNA的检测限为500个拷贝，细菌的检测限为100个细菌数。因此，这种设计简单和制造容易的微型装置通过自动控制2次不同转速的离心，在60 min内进行基因等温扩增，并且通过肉眼进行比色法判断结果的方法，为食品工业提供了一种理想的病原体检测方法。

3 新型环介导等温扩增技术

考虑到改进的用户相似度度量公式，以及算法2确定的目标用户L 个最近邻用户，UCCA-CF 算法对项目评分预测公式修改为：

目前，通过简单的目视检测技术来判断LAMP扩增反应结果已经有很大发展［19⁃20］。然而，近年来已经开始关注不同的判断方法［21］。在LAMP反应体系中加入荧光标记探针，反应完成后，再加入低分子量的阳离子多聚物乙烯亚胺（polyethyleni⁃mine，PEI），产生PEI⁃DNA⁃probe复合物沉淀，在紫外灯下通过观察颜色变化即可实现特异性检测［22］。Seetang⁃Nun 等［23］将纳米金颗粒标记的DNA探针与LAMP相结合，建立了通过肉眼观察鉴定白斑综合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）的LAMP方法，此方法灵敏度可达200个拷贝，还可以用紫外可见光光谱进行定量。Na⁃gatani等［24］最早将电化学方法应用于实时监测LAMP反应，他们将丝网印刷碳电极浸入离心管中并用亚甲基蓝作为杂交指示剂，扩增产物与亚甲基蓝结合后向电极表面缓慢弥散，引起峰电流的降低，从而进行半实时定量。Satoh等［25］报告了一个通过电化学活性嵌入剂检测特异DNA序列的方法，这一技术用于临床检测人乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV），命名为“Clinichip HPV”。Siddique等［26］开发了一种基于groEL基因的遗传标记的LAMP检测技术，用于检测受污染海鲜和水体中副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyti⁃cus），其检测限为100 fg/μL，高于PCR检测的100倍。以上这些方法都能显著提高LAMP技术检测的特异性。

LAMP反应简单化目标之一是简化加热方法。因为LAMP技术是一个等温扩增方法，LAMP可以通过一个简单的加热器如加热盒和水浴槽来进行。因此，非电力依赖的加热系统使LAMP能够在任何时间和任何地方进行。LaBarre等［11］最近设计了一个非电力依赖的水浴系统，利用一个变相材料，使用化学产热。Curtis等［12］同样开发了一个相似的化学加热器，并成功用于HIV病毒检测。另外，Hatano等［13］凭借一个可任意使用的口袋取暖器利用LAMP技术成功检测炭疽，并验证他们的系统是一个快速、可靠的检测方法。Nkouawa等［14］使用一个保温的热水瓶进行了LAMP分析，并报道此系统能够成功用于检测人类粪便样品中的链状带绦虫。这些都是简化LAMP技术加热步骤的方法。

前期采用水蒸气蒸馏法并结合溶剂萃取进行银杏外果皮中挥发油的提取,但挥发油收率过低,因而该研究采用溶剂冷浸法。文献报道以二氯甲烷为溶剂,采用同时蒸馏萃取法得到的挥发油GC-MS分析结果显示其主成分为脂肪酸类化合物,己酸含量达到65.88 %[5]。而该研究获得的挥发油GC-MS分析结果显示虽然也含有脂肪酸(丁酸 2.70 %和己酸 1.29 %),但其主成分为酚类衍生物(75.98 %),其中白果酚含量高达53.32 %,这一成分上的差异可能和提取方法的不同相关,也可能和银杏的不同生长环境相关。此外,银杏外果皮的化学成分研究亦显示其含有酚类化合物,如白果酚、银杏酚等[9-10]。

患者出院后第一个月在上海食欲不佳，一个月后回到苏州家中，为增加食欲及营养，6个月中在原来的日常饮食之外，增加了如下食物：（1）每天早晨坚持饮用自制的豆浆 （包括数种不同豆类及谷类，如黄豆、黑豆、赤豆及小米、玉米、黑米等）；（2）每日服用保健品，如新西兰麦卢卡蜂蜜（Mannka honey）搭配黑芝麻、百合、红枣；（3）经常食用自制南瓜饼。随着术后调理及恢复，食欲逐渐好转，体重有了相应增加。

在食品工业中，快速检测食品来源病原体对阻止污染食物中病原体扩散具有重要意义。Liu等［41］开发了一种多重实时环介导等温扩增方法（multiplex real⁃time loop⁃mediated isothermal ampli⁃fication，ml⁃LAMP），在一个反应体系中同时检测沙门氏菌（Salmonella）和副溶血弧菌DNA。在65℃扩增60 min后，通过不同的熔解温度（Tm）来区分扩增产物。使用19种已知的菌株验证多重LAMP技术特异性，发现此方法能够100%地区分不同菌株，其检测限与多重PCR相似。因此，多重LAMP技术在食品工业检测中具有明显的优势，能够同时检测多种病原菌，节约了大量时间和成本。

现场血液样本的采集、运输、保存等常受到一些条件的限制，尤其是当采集样本数较多时，因此亟需探索易于运输、保存、又利于病原体核酸提取的样本采集方法或措施。FTA卡（flinders technol⁃ogy associates，FTA）是由特制的滤纸经强力变性剂、螯合剂浸泡而成，细胞与FTA卡接触后被裂解，其核酸与纤维基质结合，维持样品中核酸的完整性，保护核酸免于降解，从而起到保存作用。Peng等［42］开发了一种联合FTA技术的LAMP检测方法，用于植物来源的北方根节线虫（Meloido⁃gyne hapla）检测，其检测限是普通PCR检测的100倍。Wu等［43］同样运用结合FTA技术的LAMP检测方法检测了田鼠巴贝虫（Babesia microti）感染情况，其检出限为0.687 fg/μL，而传统的PCR最低检测限为0.687 pg/μL，且20份样品的阳性符合率为100%，说明此方法特异性强、灵敏度高、简便、快速，适用于现场检测。近年新型环介导等温扩增技术总结见表1。

表1 近年新型环介导等温扩增技术 Table 1 Summary of new loop⁃mediated isothermal amplification technology in recent years

新型环介导等温扩增技术免疫环介导等温扩增技术微流体环介导等温扩增技术电化学发光环介导等温扩增技术分子信标指示的环介导等温扩增技术多重环介导等温扩增技术结合FTA的环介导等温扩增技术技术优势高灵敏度和特异性蛋白检测高通量、检测装置微型化高灵敏度和特异性扩增产物直接检出多种病原菌同时检测有效解决大样本采集、运输和保存应用临床疾病诊断和治疗预后食物来源病原体微生物检测核酸定量检测降低假阳性率食品工业检测适用于现场检测参考文献Cao，et al［29］Seo，et al［36］Roy，et al［39］Liu，et al［40］Liu，et al［41］Peng，et al［42］Wu，et al［43］

4 展望

LAMP技术是一种创新性基因扩增方法，用来取代热循环中的高端设备，其链置换反应在等温条件即可完成。由于其诸多优势已被广泛用于核酸检测的各个领域，因此LAMP技术逐步发展成为成熟、可靠的分子生物学诊断分析技术。另外，LAMP技术在蛋白生物标志物检测、食物来源病原体微生物检测和转基因产品检测方面的发展，使其作为一个简单、快速的检测方法在许多国家，特别是发展中国家广泛应用。然而，LAMP技术也有一些不容忽视缺点，比如反应过程易受污染、检测特异性不高，容易出现假阳性，因此LAMP技术的优化道路还很漫长。在未来的技术开发中，需要进一步的研究来降低假阳性率，提高检测的准确性和可重复性，使得以LAMP技术为基础的核酸检测具有更广的应用前景。

急性胃穿孔是普外科临床上比较常见的一种急腹症,且该病症发病率呈逐年上升的趋势,该病症具有较高的死亡率,所以临床上也应对其治疗加以关注和重视,急性胃穿孔临床治疗中主要采用胃大部切除术和单纯穿孔缝合术[1]。

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