在我国,养兔和兔肉加工有着悠久的历史。但据统计,在兔肉消费中,经家常烹调熟制后消费的占80%,经企业加工成定型包装食品的却不足20%,发酵兔肉制品更局限于自然发酵的风兔等少数品种。[1]

并非所有微生物都适合用于肉品发酵。有些微生物在肉品环境中缺乏竞争性,有些会产生有毒有害物质从而影响肉品的安全性,有些会影响肉类制品的感官品质。能否筛选出性能优良的发酵菌剂,对缩短发酵时间、提高产品的新鲜度与质量的稳定性、延长货架期,及确保食品质量安全意义重大。[2,3]

本文从风兔肉等传统发酵肉制品中,按照一定的标准分离筛选适宜发酵的乳酸菌、葡萄球菌和微球菌,并对其生长条件和发酵特性进行研究,旨在寻找优良的混合发酵剂,用于发酵兔肉酱的开发。

1　材料与方法

1.1　材料

兔肉香肠、咸兔腿、风兔:实验室自制(均采用传统自然发酵工艺生产)；指示菌:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌株(实验室自行保存);乳酸纸层析展开剂(正丁醇∶甲酸∶水=80∶15∶5)、呋喃唑酮、奈氏试剂、吲哚试剂及其他常规化学试剂,均为A.R.级;微量生化反应管:杭州天和微生物试剂有限公司。

培养基:MRS液体及固体培养基、LB培养基、MSA液体及固体培养基、兔肉浸液培养基、胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)、PY培养基、产黏液培养基、蛋白酶检测培养基、脂肪酶检测培养基等,参照文献配制。[4-7]

1.2　主要仪器与设备

如表9所示，在0.01的显著性水平下，股票价格波动是投资者情绪波动的格兰杰原因，而投资者情绪波动不是股票价格波动的格兰杰原因，说明股票价格的变动能够导致投资者情绪的变动。根据主流经济学理论，影响企业股价形成和波动大致分为三个方面:其一为企业发展状况及前景，其二为外部宏观环境与冲击，其三为市场情绪与心理。说明企业发展状况与外部宏观环境对股价的影响可能更大，这与我国目前股票市场的“政策市”、“消息市”等现状是吻合的。

1.3　方法

1.3.1　微生物菌株的分离纯化

以无菌手续称取被分离的自然发酵样品25g,分别以MRS、MSA的液体培养基对样品中菌群进行活化富集培养、平板划线、分离纯菌,作革兰氏染色与镜检、H2O2酶活性测定。

对葡萄球菌及微球菌菌株,进行呋喃唑酮试验、溶葡萄球菌素试验和溶血性试验。对乳酸菌进行凝乳试验、产乳酸试验。[8-11]

1.3.2　菌株的筛选

初筛标准:非产H2S、非产生物胺(无氨基酸脱羧能力)、非产气、非产黏液、非产氨。参照文献中方法进行。[12,13]

步进指令是可编程控制器编程指令中，属于功能指令的一部分，在欧姆龙 PLC中，有 STEP（08）和 SNXT（09）组成，分别是步梯形区域定义和步梯形区域的步进，使用中必须成对出现。

葡萄球菌、微球菌的复筛:将相关菌株依次作耐酸性试验、硝酸盐还原能力、检测、蛋白酶活性测定、脂肪酶活性测定、产色素试验、产香性测定与风味评价。[14-17]风味评价方法见表1。

 

表1　风味评价方法

  

肉香味感官评分发酵香味感官评分不良气味感官评分无0无0极显著0极轻微1极轻微1显著1轻微2轻微2明确2明确3明确3轻微3显著4显著4极轻微4极显著5极显著5无5

1.3.3　菌株的共培养

1.3.4　菌株的初步鉴定

将活化后的乳酸菌和葡萄球菌及微球菌两两组合,接种至兔肉浸液培养基中混合培养,接种菌量均为107CFU/mL。每隔12h测定乳酸菌和葡萄球菌/微球菌的菌落数及pH值。[18]

对筛选菌株进行糖类发酵试验,采用生化反应管检验,通过观察菌株对各种糖的利用情况确定其属种。将待鉴定菌株接种于微量生物反应管后30℃培养24h,观察发酵产酸变化。

由图2可以看出,乳酸菌和葡萄球菌共培养时,不同组合存在不同的相关性。4组的pH值变化趋势一致,24h内下降迅速,24h以后下降趋势趋于平缓。4组乳酸菌数均随培养时间的推移逐渐增加,24时几乎都达到最大。而葡萄球菌数的变化趋势却明显不同,表现为12h之后各组之间出现的差别。L6+C5组和L21+C8组在24h内菌数呈增加趋势,之后急剧下降;L6+C8组葡萄球菌数始终都偏低,说明生长被严重抑制,48h后快速降低;L21+C5组葡萄球菌的生长状况良好,菌数能达到较高水平,表明未明显受到乳酸菌的抑制,两者没有拮抗作用,可以混合培养,用于发酵肉品。

[7] Coppola R, Lorizzo M, Saotta R. Characterization of Micrococci and Staphylococci isolated from Soppresate Molisana, a southern Italy fermented sausage[J]. Food Microbiology, 1997(14):47-53.

菌株36h生长曲线的测定:按3%的接种量将初始菌液接种至装有相应液体培养基的试管中,分别标明菌号和培养时间(设置时间梯度为2h)。接种后置37℃培养,按时取出,用755s紫外可见分光光度计在可见光600nm波段处测定其吸光度,以未接种的培养基作为对照。菌液的浓度与OD值成正比,用光密度可间接推知菌液的浓度,以培养时间为横坐标,测得的OD值为纵坐标,即可绘制菌株的生长曲线。[19]

菌株在不同温度下的生长:按3%的接种量将初始菌液接种至相应液体培养基,分别置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃条件下培养适宜时间,用755s紫外可见分光光度计在可见光600nm波段处测定其吸光度,以空白培养基作为对照。

菌株在不同NaCl浓度下的生长状况:按3%的接种量将初始菌液接种至相应液体培养基,培养基中分别添加 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的NaCl,最佳温度下培养适宜时间,用755s紫外可见分光光度计在可见光600nm波段处测定其吸光度,以空白培养基作为对照。

菌株在不同pH条件下的生长状况:按3%的接种量将初始菌液接种至相应液体培养基中,培养基的初始pH梯度设置为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,最佳温度下培养适宜时间,用755s紫外可见分光光度计在可见光600nm波段处测定其吸光度,以空白培养基作为对照。

1.3.6　数据处理

每个试验重复三次,取平均值。用SPSS 17.0和Excel 2007对试验数据进行处理和分析。

颅内静脉窦血栓属于多种因素共同作用引发的罕见颅内静脉系统血管病，病死率可达15%[5-7]。颅内静脉窦血栓早期发病隐匿，少部分患者表现为偏瘫等局灶性体征，临床识别难度较高[8-10]。因此，寻找一种早期有效诊断颅内静脉窦血栓的手段至关重要。

2　结果与分析

2.1　菌株的分离与初步鉴定

从传统自然发酵制品中分离得到52株革兰氏阳性、H2O2酶阴性菌,均产乳酸,初步判定为乳酸菌的菌株;得到29株革兰氏阳性、H2O2酶阳性球菌,初步判定为葡萄球菌及微球菌的菌株,进一步经呋喃唑酮敏感性和溶葡萄球菌素敏感性试验,结果12株为葡萄球菌、17株为微球菌,其中10株葡萄球菌为安全菌株。

2.2　菌株的初筛

经初筛结果,符合发酵剂要求的菌株见表2、表3。

由表2、表3可见,共8株乳酸菌、4株葡萄球菌和5株微球菌符合筛选标准,可作为发酵剂的备选菌株,进行后续筛选。

 

表2　符合发酵剂要求的初筛菌株数

  

筛选指标菌株数乳酸菌葡萄球菌微球菌非产生物胺29811葡萄糖非产气2068非产氨1456非产H2S1155非产粘液845

 

表3　初筛菌株

  

类　别菌株编号乳酸菌L3、L6、L13、L21、L36、L42、L49、L51葡萄球菌C5、C8、C23、C37微球菌C1、C6、C17、C19、C29

2.3　菌株的复筛

2.3.1　乳酸菌的复筛

（三）建设监管平台。潜江市农场管理局与湖北荆谷信息技术有限公司接洽，目前已就资产监管平台软件开发和系统搭建进行实质性操作程序。

乳酸菌产酸特性试验结果如图1所示。

  

图1　乳酸菌产酸试验结果

乳酸菌发酵产酸的速度决定着发酵成败和发酵制品贮藏稳定性,因此作为乳酸菌筛选的首要标准,但菌株的产酸速度和产酸能力并不一致,有些菌株虽产酸能力强,产酸速度却不一定快。从抑制腐败菌和病原菌生长的角度出发,以产酸速度结合产酸能力作为乳酸菌复筛的衡量标准。本试验将待测乳酸菌接种至兔肉浸液培养基,测定并分析24 h内的 pH值变化,结果表明：L36、L42和L51的pH变化比较平缓,产酸速度慢且产酸能力弱;L3、L6、L13、L21、L49的产酸能力相对较强,培养24h时pH值均降到了5以下;从变化趋势来看,L6、L21、L49的pH值下降速度较快,它们的产酸速度较好,且最终的pH更低,达到4.5以下,产酸能力相对更强;其中L21表现最为良好,最终pH降到4.19。

乳酸菌凝乳试验结果见表4。由表可知,凝乳试验的结果与产酸特性试验的结果基本一致,表现为L6、L21、L49凝乳较快。

 

表4　乳酸菌的凝乳试验结果

  

菌株培养时间(h)0-88-1616-2424-3232-4040-48L3--±±++L6-±±+++L13---±++L21-±++++L36--++++L42----±+L49-±++++L51-----±

注：“-”表示未凝乳;“+”表示凝乳;“±”表示半凝乳

乳酸菌耐盐性试验结果见表5。

 

表5　乳酸菌的耐盐性

  

菌株编号L6L21L49OD值145206480931

一定的盐浓度可抑制杂菌的生长,而盐渍也可促进肉品风味的形成。食盐浓度低,腐败菌的生长繁殖会导致肉制品腐败变质;而食盐浓度过高,在抑制腐败菌的同时也使发酵剂的生长受到抑制,且制品的口感也会难以接受。故用于发酵的菌株应具有一定的耐盐性,一般要求达到6%。由表5可以看出,3株乳酸菌在6%NaCl浓度下均能生长,有一定的食盐耐受性,其中L6长势相对较佳,OD值超过1.2。

乳酸菌抑菌试验结果见表6。

 

表6　乳酸菌抑菌试验结果

  

菌株编号抑菌圈直径(mm)大肠杆菌金黄色葡萄球菌L6146114L21137106L4911043

选择具有抗菌特性的微生物在肉制品中接种后能够抑制杂菌和致病菌的生长。乳酸菌代谢过程中能产生具有抑菌作用的成分,如有机酸、细菌素等。本试验以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌,测量抑菌圈直径以反映抑菌能力的大小。由表6可知,3株初筛乳酸菌对指示菌均有一定的抑制性,对大肠杆菌的抑制作用差异不十分明显,但L49对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较差,总体看来,L6和 L21对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果均较好,故最终选择L6和 L21。

2.3.2　葡萄球菌、微球菌的复筛

葡萄球菌、微球菌的复筛试验结果见表7。作为可用于接种发酵肉制品的葡萄球菌/微球菌,应具有的优良特性包括:硝酸盐还原性、可耐受一定的酸性环境、一定的蛋白酶和脂肪酶活性,不产生色素。从试验结果可知,C5、C8和C23符合上述标准。

 

表7　葡萄球菌、微球菌的复筛试验结果

  

菌株编号硝酸盐还原酶活性耐酸性pH45pH55蛋白酶活性脂肪酶活性色素C1++++-+C5+++++-C6---+--C8+++++-C17-++--+C19+++---C23+++++-C29--+-++C37++++-+

注:“+”表示阳性;“-”表示阴性

葡萄球菌、微球菌产香性试验结果见表8。葡萄球菌、微球菌用于发酵肉品,应对产品风味起到明显的改善作用。由表8看出,C5和C8发酵期间产生的发酵香味较明显,而C23虽然无明显的异味,但从感官评分可知其对风味的作用不如前两者。

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表8　菌株产香性试验测定结果

  

菌株编号培养时间(d)1234C5909296100C886929896C2378798079

2.4　菌株的共培养

对筛选得到的乳酸菌L6、L21和葡萄球菌C5、C8进行两两组合共培养,测定菌数和pH的变化,结果如图2所示。

1.3.5　菌株的发酵性能

  

图2　乳酸菌和葡萄球菌共培养的菌数和pH变化

2.5　菌种的鉴定

对筛选出的具有优良发酵特征且适合共培养的乳酸菌L21和葡萄球菌C5进行系统生化试验,结果见表9。

 

表9　菌种鉴定结果

  

鉴定项目菌　株L21C5鉴定项目菌　株L21C5木　糖--甘露醇++阿拉伯糖+-甘露糖++纤维二糖+-鼠李糖--棉子糖+-乳　糖+-水杨苷+-半乳糖++苦杏仁苷+-果　糖++蔗　糖+-松三糖+-麦芽糖+-蜜二糖+-核　糖++山梨醇+-

参照《乳酸细菌分类鉴定及试验方法》和《常见细菌系统鉴定手册》,由表9结果结合菌体形态特征及筛选过程中的生化反应,可初步确定菌株L21为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),C5为肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)[10,20]。

乳酸菌的复筛:将相关菌株依次作产酸特性试验、凝乳特性试验、耐盐性试验、抑菌试验。

开花前后2天内用浓度 25 mg/kg的2，4-D 丁酯蘸花，处理过的花冠要在果实大后轻轻摘掉，进而保障茄子的健康生长。

2.6　筛选菌株发酵性能的测定

2.6.1　菌株的生长曲线

单菌株36h生长曲线如图3所示。

  

图3　单菌株36h生长曲线

测定菌株的生长曲线有利于掌握其在生长过程中的活力变化规律,以确定菌体的最佳收获时间。由图3可以看出,菌株C5在培养8h以后,OD值开始迅速增大,表明生长进入对数期,26h时菌体密度达到峰值,开始进入稳定期,菌体密度基本保持不变;菌株L21在培养6h后到达对数生长期,24h菌体密度增至最大,OD值达到1.4以上,此后趋于稳定。在对数生长期,L21的生长速率高于C5的生长速率,L21的菌体密度峰值也高于C5的菌体密度峰值。

2.6.2　菌株在不同温度下的生长

体育工程技术的创意能够有效解决有限体育场地资源的合理分配与应用问题，同时，在“互联网+”时代背景下，将体育与科学技术相结合，利用科技智能体系指导与规划全民健身，发挥科技创新与全民健身参与协同发展的正效应。坚持绿色发展，回归自然属性，促使体育工程技术创新服务于全民健身参与的整个过程，并符合绿色、环保、健康、节能理念，专注体育工程技术创新，体现科技价值。

菌株分别置于不同温度下培养24h,测得的OD值如图4所示。

  

图4　筛选菌株在不同温度下的生长情况

由图4可知,不同温度对菌株的影响程度并不一致,菌株在不同温度条件下的生长情况有显著差异。L21在30℃～40℃生长良好,在25℃和40℃生长速度降低,在10℃～20℃及40℃以上生长能力较弱,受到显著影响。C5的生长受温度的影响表现出相似的趋势,在25℃～35℃生长较好,超过或低于此温度范围均不利于其生长。

2.6.3　菌株在不同NaCl浓度下的生长

“你别管我疯没疯。你不觉得我开的条件太诱人了吗？这还用想吗？你如果赢了我，等于白白地得到了这五十万。五十万哪！”

使用基于服务架构的监测预警系统具有较好的灵活性、通用性及可扩展性，同时利用PUSH技术，“主动”将预警信息推送，使防汛工作人员能够随时随地灵活地掌握各类重要的防汛防旱预警信息，极大提高了防汛防旱抢险救灾应急指挥能力。目前，本系统主要对水情、雨情进行实时监测预警，将来旱情预警、工情预警以及防汛启动条件预案可以分别对相应的基础数据与警戒值进行比较，对超出警戒范围的要素进行预警，具有极强的可扩展性。

筛选菌株在不同NaCl浓度下的生长情况如图5所示。

  

图5　筛选菌株在不同NaCl浓度下的生长情况

从图5可以看出,L21可以在1%～7%的NaCl浓度范围内均能生长,但NaCl浓度大于4%时,随着NaCl浓度的升高,生长能力有降低的趋势。C5在1%～7%的NaCl浓度范围内均呈现良好的生长速度,OD值没有显著变化,表明此范围的NaCl浓度对C5基本无影响。

2.6.4　菌株在不同初始pH值下的生长

筛选菌株在不同初始pH值下的生长情况如图6所示。

  

图6　筛选菌株在不同初始pH值下的生长情况

从图6可以看出,L21和C5在不同的初始pH条件下的生长情况具有显著性差异(P<0.05),L21在5.5～8.0初始pH范围内都能生长,但在pH6.0～7.0之间生长情况最佳,pH超过7以后生长能力呈下降趋势。C5在pH7.0～8.0之间生长能力较强,而pH5.5～6.5的OD值明显降低,表明较低的pH条件影响其生长。

3　结论

利用选择性培养基MRS和MSA从传统发酵肉制品中初步分离筛选出发酵菌株,以肉制品发酵剂的标准对其进行初筛和复筛,最终得到发酵性能优良的乳酸菌和葡萄球菌菌株。对所筛选菌株进行共培养试验,挑选出无拮抗作用的菌种组合L21+C5,作为混合发酵剂。并经初步鉴定L21为植物乳杆菌,C5为肉糖葡萄球菌，并通过包括适宜发酵温度与时间、生长特性、耐盐特性、pH环境等验证实验,为优化发酵工艺打下了基础。

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HSX-250型恒温恒湿培养箱:上海福玛实验设备有限公司;QYC-200型全温培养摇床:上海新苗医疗器械制造有限公司;SW-CJ-1F型单人双面净化工作台:苏州净化设备有限公司;DHG-9148A型电热恒温鼓风干燥箱:上海精宏实验设备有限公司;YX280B型手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器:上海三申医疗器械有限公司;S-3C型精度pH计:上海精密科学仪器有限公司; 755s-紫外可见分光光度计:上海棱光技术有限公司;XW-80A微型漩涡混合仪:上海沪西分析仪器有限公司;BL3-120型超声波清洗机:上海比朗仪器有限公司。

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这取决于传播者能否专有体育赛事转播权，实现“赢家通吃”的局面。当法律允许一个传播者专有体育赛事转播权时，传播者将面临“烧钱”竞争，从而极大地推高传播费用，甚至达到最终的“赢家”都成为“输家”的泡沫化程度。㊴ 同注释㉒。相反，当法律禁止传播者专有体育赛事转播权时，传播者之间更有可能通过合作的方式拿下体育赛事转播权，传播成本也会被控制在一定范围内。

菌种活化:将乳酸菌接种至MRS液体培养基,葡萄球菌接种至MSA液体培养基,活化2次后,用分光光度计调整菌液浓度为108CFU/mL,作为初始菌液。

[8] 卢晓莉.鱼鲊制品中乳酸菌的分离、筛选及应用[D].武汉:华中农业大学,2007.

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1906年《治安法官法》最终取消了治安法官的财产资格，仅规定任命的治安法官不得不住在本郡或居住在所担任治安法官的郡七英里内。1949年《治安法官法》扩大到离该郡15英里范围内居住，1979年《治安法官法》再一次规定直到今天仍是有关治安法官资格仅有的法令。现在治安法官的任命往往可虑下列情况：

综上所述，铁路道岔的运行和设备质量关乎着铁路运行的安全性与长效性，在道岔维修工作中应重点对连接零件、尖轨转辙部分、钢轨磨耗和道岔铺设问题进行分析研究，明确道岔设备维修养护工作的原则与重点。在此基础上，通过采用多种工作方式实现维修保养、做好重点项目的维修养护和保证铁路道岔设备的产品和服务质量几点措施，更加高质高效地做好铁路道岔设备维修工作。

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修辞，狭义上指文字修辞；广义上包括文章谋篇布局、遣词造句的全过程，文字修辞也涵括在内。修辞格即狭义的修辞，现可知的修辞格有63大类，78小类。修辞格的使用可增强文字表达效果，对文章的写作大有裨益。

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