以矿物油作基础油的传统润滑油产品在自然环境中可生物降解能力差，滞留时间长，对环境造成一定影响。因此，人们在研究可生物降解且生态毒性小的绿色润滑油取代传统的矿物基润滑油的同时，也正在积极探索利用生物技术加快环境中矿物基润滑油的生物降解性[1-2]。

收银的徐姐突然扬声叫：“Olivia，客人找你，手脚快点！”徐姐四十岁上下，掌握着酒吧的财务大权，是老板的心腹，平时很少说话，由着年轻的侍者们闹腾，可她一旦说话就代表着老板。徐姐看似责怪颜晓晨动作慢，耽误了招呼客人，实际却做了裁判，表明规矩就是规矩，任何人不能破坏，Yoyo强笑着说了句“Olivia马上就来”，匆匆离开了。

润滑剂的生物降解是指润滑剂在微生物作用下被氧化、分解的生化反应过程，不同类型的润滑剂有着不同的生物降解过程。近年来，国内外学者在利用微生物降解矿物油中特定的单一成分的研究中发现，许多微生物能以烃为唯一碳源进行生物修复，这些微生物多属于细菌、酵母和丝状真菌等，分别归属于70多个属200余种，其中细菌约占40个属。但应用驯化、选育获得的高效润滑剂降解菌强化到矿物基润滑油污染的土壤中进行生物修复仍处在实验室研究阶段。目前的研究主要集中在新菌种的开发；生物催化剂制备、性能的改善；代谢途径、机理研究；传质过程的研究等方面[3-5]。

笔者以天津大港油田被原油污染的土壤为出发菌源，采用人工增加环境压力的方法，驯化、筛选、选育能有效降解矿物基润滑油的菌株，期望为生物降解矿物基润滑油提供可使用的菌种及可借鉴的实验数据。

1　材料、试剂、培养基及仪器

1.1　材料、试剂及培养基

润滑油降解菌菌源来源于天津大港油田被原油污染的土壤；对照润滑油为燕山石化公司产品；废弃润滑油为车辆行驶1万公里后的废弃车用机油；石油醚为北京化学试剂厂产品；培养基为无机盐培养基、普通培养基、富集培养基等[6]；无机盐培养基为KH2PO4 0.5 g、K2HPO40.5 g、MgCl2 0.2 g、CaCl2 0.1 g、NaCl 0.2 g、Mn(NO3)2痕量、FeCl2痕量、NH4NO3 1.0 g、去离子水1 000 mL；普通培养基为蛋白胨10 g、葡萄糖10 g、酵母粉5 g、牛肉膏5 g、NaCl 5 g、去离子水1 000 mL；富集培养基为牛肉浸膏10 g、大豆蛋白胨20 g、NaCl 8 g、去离子水1 000 mL。培养基灭菌采用湿热灭菌技术(0.15 MPa，121 ℃，20 min的蒸汽灭菌)。

内部控制环境是企业内部控制要素中的基础环节，是保证内部控制顺利实施的基本前提。企业要想营造完善的内部控制环境必须从内部控制制度框架的构建着手，以此为基础，充分发挥内部控制环境的作用。例如：企业应将内部控制的理念灌输到每一名员工的心中，将内部控制融入到企业的所有日常经营管理环节中，从而为内部控制的顺利实施营造良好的环境，为内部控制的顺利实施提供制度保障。再例如：作为企业的高层管理者必须结合自身的实际情况，高度关注并重新认识内部控制制度的重要性，并在企业内部成立合规的监察部门，实现对企业各个业务处理流程的动态化合规监察。另外，企业还必须站在全局发展的角度对内部控制的实施做一个整体规划。

1.2　仪器

Airstream S-Series Ⅱ级生物安全柜，Esco Micro Pte Ltd公司生产；不锈钢手提式灭菌器，上海申安医疗机械厂生产；SH-3600A电热恒温培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司生产；SJC-Ⅱ型紫外线杀菌灯车，北京海淀空后高温复合材料厂生产；SPH-2102C双层恒温培养振荡器，上海世平公司生产；LGR16-W型高速冷冻离心机，北京京立离心机厂生产；UV-2800紫外分光光度计，上海洪富仪器仪表有限公司生产；奥林巴斯CX23三目显微镜，带成像系统。

以天津大港油田被原油污染的土壤为菌源，对照品润滑油为限制性底物，通过一定的驯化方式，分离筛选出2株具有清除润滑油能力的菌株，分别用RHY-1和RHY-2表示，其清除润滑油能力如表1所示。RHY-1和RHY-2的菌落特征均为乳白色、湿润、圆形凸起、易挑起；革兰氏染色显微镜下观察均为G+，杆状，可以认定获得的润滑油降解菌为细菌。

2　实验方法

2.1　矿物基润滑油降解菌的驯化、分离和筛选

2.1.2　菌种的筛选

菌种生长细胞的制备：无菌操作将保存在斜面培养基上的菌株接种于富集培养基中，置于恒温振荡器内，在120 r/min、25 ℃条件下振荡培养24 h，用离心机在6 000 r/min、15 ℃条件下离心分离收集菌体，以盐培养基为溶剂制备0.5 g/mL菌悬液备用。

2014年，吉林省水利厅将深入贯彻党的十八大、十八届三中全会精神，不断推进防汛抗旱、水利工程、最严格水资源管理制度、民生水利、水利改革等方面工作，创新水利发展，不断开创全省水利改革发展新局面。

2.1.1　菌种的驯化、分离

将被原油污染的土壤5 g充分溶于200 mL生理盐水中，取上清液10 mL接种于80 mL无机盐培养基和10 mL对照润滑油混合液中，将混合液置于恒温振荡器中，在120 r/min、25 ℃条件下，振荡培养48 h(1个周期)；取振荡培养后水相液体10 mL，重新接种于80 mL无机盐培养基和10 mL对照润滑油混合液中，在120 r/min、25 ℃条件下，振荡培养48 h；如此重复10个周期驯化后，在无菌操作琼脂平板上分离后，置于30 ℃恒温培养箱内培养，待长出孤立菌落后接种于斜面培养基上，4 ℃冰箱保存待筛选[6-7]。

分别取对照润滑油3、5 mL和10 mL，与100 mL 0.5 g/mL菌悬液混合(共27样本，平行样本数n=3)，置于恒温振荡器内，在120 r/min、25 ℃条件下，振荡培养72 h，每24 h后用20 mL石油醚于碘量瓶内萃取相应样本内的润滑油，并测定混合液内润滑油量。测得的润滑油量越小，说明微生物降解润滑油效果越好，即为初步获得的润滑油降解菌。该菌种进行革兰氏染色初步鉴定获得的菌种为细菌。润滑油含量的测定采用紫外分光光度法，以石油醚为溶剂，在250 nm处测定润滑油的透过率[8-9]。

2.2　菌种选育

从图3可知沙县竹炭板鸭在PC1上得分较高，白市驿板鸭在PC2上得分较高，南安板鸭在PC1和PC2上的得分均较高，原因可能是特征性风味物质种类多且含量较高。南京板鸭、扬州板鸭与雷官板鸭相隔较近，说明其相关性较大。从图3(b)中可以看出，己醛、壬醛与醛类距离很近，表明他们之间相关性很大，即己醛、壬醛可以反映大部分醛类在香气方面的贡献。脂质氧化产生的壬醛、己醛通常能在干腌肉质品中检测到，并且具有花香，青香和果香，有助于整体香味的形成。图3(b)和图4显示F1（己醛）、F2（壬醛）、F4（(Z)-2-庚烯醛）和F9（1-辛烯-3-醇）相关性很大，说明在板鸭中含量较高。

润滑油降解菌菌种选育采用诱变育种，诱变剂为紫外线，紫外线灯功率为30 W，距离待诱变菌株30 cm，照射时间为3 min。实验在暗室红灯下进行，经紫外线照射后样品均用黑纸包裹避免光修复。

2.2.2　菌种选育方法

一直以来总有一些人对闽商团队协作的事实视而不见，他们说福建人做生意的特点是“生意再小也要自己当老板”，因此“宁为鸡头，不为凤尾”，崇尚单打独斗，散兵游勇，各自为战，缺乏团队协作精神；认为闽人强悍拼搏的同时有一种独立的、不合作的性格，所以虽然闽商遍天下，但闽商多出“独行侠”，看上去闽商似乎是最不像“帮”的商帮；他们还说，因为闽商独立不合作，使得福建虽然抓住改革开放之机而先行一步但在产业升级和社会整体发展战略方面明显弱于广东和江浙；许多很有希望的产业，因为缺乏合作，而无法做大做强，这是福建大企业不多的根本原因，等等。

以2.1中所述方法经驯化、分离、筛选获得的润滑油降解菌为出发菌株，以无菌操作将其接种于100 mL富集培养基中，置于恒温振荡器内，在120 r/min、30 ℃条件下，振荡培养20 h，用离心机在6 000 r/min、15 ℃条件下离心5 min分离收集菌体，制备对数期润滑油降解菌菌悬液(生理盐水为溶剂)，备用，菌悬液细胞浓度108个/mL。取该菌悬液于培养皿中，置于磁力搅拌器上，边搅拌边照射。照射结束后将诱变液移入无菌试管中冰浴1 h后待用。分别取未照射的菌悬液(作为对照)和照射过的菌悬液进行梯度稀释，每个稀释度涂3个琼脂平板，37 ℃培养后，将琼脂平板上的孤立菌落分别接种到斜面培养基上，置于4 ℃冰箱中保存并按2.1.2所述的润滑油降解菌的筛选方法进行紫外诱变正突变菌种的筛选[10]。

2.3　选育菌种对土壤中废弃润滑油的降解实验

分别取4份未被润滑油污染的土壤5 kg，按0.5 mL/kg和1 mL/kg分别加入对照润滑油和废弃车用润滑油；富集培养4份0.5 g/mL对数生长期正突变的润滑油降解菌100 mL，分别均匀混合在上述的土壤中；将土壤样品置于自然环境下，经常补充水分以保持其持水量与开始时基本相同。分别于3、5、10 d后取5 g土样溶于10 mL石油醚中测定对照润滑油和废弃润滑油的含量，考察紫外诱变润滑油降解菌对土壤中对照润滑油和废弃润滑油的降解能力(n=3)。

3　实验结果与讨论

3.1　矿物基润滑油降解菌筛选结果与讨论

如今的我们，生活在这样一个节奏明快的社会。每天看到的就是川流不息的汽车和人群；听到的都是各种急促的喇叭声、打卡声；感受到的是来自社会各界的矛盾和压力。正是这样的节奏，让我们忽略了一个重要的习惯：读书。人们往往以“没有时间”这个堂而皇之的理由来安慰自己，殊不知，不读书不仅会让自己的生活枯燥无味，工作起来也会事倍功半，从而面临更大的压力。

2.2.1　菌种选育条件

经济全球化的发展，使得网络技术不断发展，传统的企业财务管理制度已无法在适应当前的发展形势，因此新的企业财务管理模式的出现已迫在眉睫。然传统的管理模式在理论、制度等方面出现的问题较多，以致于新型的管理模式还不能将“互联网+”技术与财务管理互相协调。同时，当前的市场波动较大，也对企业的发展造成了一定的阻碍。使得企业在管理层面还出现较大的漏洞，缺乏专业化、科学化的理论知识支撑体系的发展。

表1　RHY-1和RHY-2对润滑油的降解能力(n=3)

Table 1　RHY-1 and RHY-2 for rernoval lubricating oil of strain (n=3)

润滑油RHY-1作用后润滑油量/mLRHY-2作用后润滑油量/mL0h24h48h72h0h24h48h72h对照3.001.680.37-3.001.01--对照5.003.971.03-5.002.210.45-对照10.009.218.88.6.3310.008.898.817.24

由表1可以看出，RHY-1和RHY-2对润滑油均有一定的降解能力。随着降解时间的延长，降解能力逐渐增强，尤其对低含量润滑油降解效果显著，RHY-1对润滑油的降解程度弱于RHY-2。以天津大港油田被原油污染的土壤为出发菌源，采用人工增加环境中较大量润滑油的方法，极大地提高了土壤中微生物的选择压力，在多数微生物细胞被淘汰的同时，幸存的微生物细胞从最初只能耐受润滑油的存在，到最后需要润滑油为主要碳源来维持其生长繁殖，微生物产生了新性状，即获得能代谢润滑油的菌种。说明加入大量润滑油，形成较大的环境压力，筛选新性状菌种的驯化方法简单有效，是获得新性状菌种的较好方法。

3.2　菌种选育结果与讨论

以RHY-2为出发菌源，经30 W紫外线照射3 min诱变后，筛选获得了正突变菌株YBRHY-2，其降解润滑油能力如表2所示。

表2　诱变后菌种对润滑油的降解能力(n=3)

Table 2　Mutagenic capacity for removal lubricating oil of strains (n=3)

润滑油RHY-1作用后润滑油量/mLRHY-2作用后润滑油量/mL0h24h48h72h0h24h48h72h对照3.001.01--3.00---废弃3.002.101.34-3.001.10--对照5.002.210.45-5.002.23--废弃5.003.522.010.335.002.581.06-对照10.008.898.817.2410.008.348.218.01废弃10.009.238.788.8010.009.018.568.52

由表2可以看出，正突变菌株YBRHY-2对润滑油的降解能力均较诱变前有明显提高，发挥有效降解润滑油时间明显缩短；并对低含量对照品润滑油具有理想的降解效果，对废弃润滑油的降解效果弱于对照润滑油。这主要与废弃润滑油中物质成分较复杂且含量较高时，对微生物有一定的毒性作用及高浓度底物对细胞生长的抑制作用有关。

3.3　选育菌种对土壤中废弃润滑油的降解结果

YBRHY-2对废弃润滑油的降解程度如表3所示。

由表3可以看出，紫外诱变菌株对土壤中少量矿物基润滑油具有理想的生物降解效果，润滑油含量较多时生物降解效果不显著，说明诱变选育获得的菌株适宜于深度脱除环境中残留的矿物基润滑油。

表3　YBRHY-2对废弃润滑油的降解程度(n=3) (mL/kg)

Table 3　YBRHY-2 for removal discarded lhbricating oil of strains (n=3)

时间/d03510对照品润滑油1.000.980.36-对照品润滑油0.500.32--废弃润滑油1.001.010.750.23废弃润滑油0.500.38--

4　结论

以天津大港油田被原油污染的土壤为出发菌源，采用人工形成较大的环境压力的驯化方法，筛选获得了对矿物基润滑油具有较好降解能力的菌株，该驯化形式是获得新性状菌种的较好方法。

采用紫外诱变育种获得了降解矿物基润滑油效果显著，有效降解时间明显缩短的正突变润滑油降解菌；菌株对残留矿物基润滑油具有较理想的降解效果。

参考文献

[1]　杨礼河，朱勇，解世文，等.润滑油生物降解性的评定方法[J].石油学报(石油加工)，2008，24(3):356-359.

[2]　黄伟九.可促进润滑油生物降解的新型润滑添加剂研究[J].润滑与密封，2009，34(11):5-8.

[3]　Judson R S， Martin M T， Reif D M， et al. Analysis of eight oil spill dispersants using rapid， in vitro tests for endocrine and other biological activity[J]. Environmental Sciences, 2010，44(15):5979-5985.

[4]　Roy G， Carlosa G， Mohammmed S， et al. Bordetella petrii is endowed with both the metabolic versatility of environmental bacteria and virulence traits of pathogenic Bordetellae[J]. BMC Genomics， 2008(9):449-454.

[5]　Wang L P， Wang W P， Lai Q L， et al. Gene diversity of CYP153A and AlkB alkane hydroxylases in oil degrading bacteria isolated from the Atlantic Ocean[J]. Environmental Microbiology, 2010，12(5):1230-1242.

[6]　施巧琴，吴松刚.工业微生物育种学[M](第2版).北京:科学出版社，2003:125-171,296-341.

[7]　沈齐英，曾涛.脱硫枯草芽孢杆菌的筛选[J].北京石油化工学院学报，2009，17(2):1-4.

[8]　陈波水，张楠，方建华，等.脂肪酰基氨基酸对矿物润滑油生物降解性的影响研究[J].环境工程学报，2009，3(6):1140-1142.

[9]　吴新世，叶锋，张金涛，等.新型润滑油生物降解性及其分析方法改进探讨[J].微生物学通报，2008，35(6):872-875.

[10]　夏立娅.仪器分析[M].北京:高等教育出版社，2006:251-275.

[11]　沈齐英，赵锁奇，张忠智，等.紫外诱变选育脱硫微生物[J].环境工程学报，2011，5(11):2630-2634.