0 引言

红酵母是海洋微生物的优势种群,广泛存在于世界各个海域、南北极及深海等领域[1-3]。海洋是一个高压(深海)、低营养、低光照,以及温度和盐度变化巨大的独特环境,从而使其中的酵母细胞内代谢和产物有异于陆地环境生存的酵母。海洋红酵母细胞含有丰富的蛋白质、类胡萝卜素、多糖、虾青素、不饱和脂肪酸、必需氨基酸、消化酶类、维生素等活性代谢产物,具有较高的营养价值和活性作用,不仅用以生产类胡萝卜素、单细胞蛋白和生物柴油,还可用于微生态制剂,净化水质,在医药、食品、化工、农业和环保等领域有着广泛的应用[4-5]。

海洋红酵母大小约为 4—6 μm,营养物质丰富,适口性好,不易沉淀,有较好的耐盐性,同时还具有培养周期短、适应能力强、成本低等优点,非常适宜作为海产动物幼体的开口饵料和幼体时期的补充性饵料,能显著提高水产动物幼苗存活率,提高饲料利用率,增强动物体免疫力,净化水体,是生态养殖的优良添加剂[6-7]。海洋红酵母作为养殖微生态制剂在水产养殖业中已经有广泛的应用,并推广到了广西、海南、江苏、浙江、山东等十几个省市[8]。

与一般海洋环境相比,南极具有低温、高盐、低光照、寡营养、强辐射等极端环境特点,孕育了包括酵母在内的丰富的低温微生物资源,能够产生独特的代谢物质[9]。因此,本研究以极地红酵母Rhodotorula mucilaginosa AN5为实验对象,研究其发酵培养的最佳生长条件,初步探讨作为养殖微生态制剂在水产养殖业中应用的可能性。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

海洋极地酵母Rhodotorula mucilaginosa AN5是从第22次南极科学考察采集的海冰样品中分离所得。

1.2 酵母培养基及培养

YPD培养基: 葡萄糖2.0 g,蛋白胨2.0 g,酵母粉1.0 g,pH=6.0,海水100 mL,0.1 MPa下灭菌30 min。将活化4 d的酵母接种于液体YPD培养基中,120 r·min–1,20℃摇床培养。

一、试验目的：对应用不同菌种进行内置式秸秆生物反应堆技术后的温度、产量进行对比试验，找出最适合当地推广的菌种。

有研究显示，55%～75% 的脑卒中偏瘫患者遗留上肢功能障碍[1]。脑卒中后常见的上肢功能障碍包括瘫痪、丧失随意运动、异常肌张力和/或躯体感觉的改变[2]。进入慢性期后超过60%的患者仍然持续存在上肢功能障碍，尤其是手功能障碍[3]。大约50%的脑卒中后手功能障碍的患者在日常生活活动(Activities of Daily Living，ADL)中仅能部分独立[4]，给患者、家庭及社会带来沉重负担。上肢功能的改变影响患者参与日常生活活动、工作及娱乐休闲活动的能力[5]。恢复上肢的使用功能是脑卒中康复的主要目标。探索利于脑卒中后偏瘫上肢功能恢复的治疗策略十分重要。

1.3 酵母密度测定

采用显微计数法[10]。

1.4 海参的养殖

实验用海参为仿刺参幼苗,购自山东威海,长约0.5—0.8 cm。将幼参随机分到6个玻璃缸中人工养殖(3个为对照组,3个为实验组),每天定时投喂等量人工配合饲料,实验组每天另投喂0.3 g红酵母,每2天换水1/2,2个月后,收集海参,吸干表面水分,−20℃保存。

2.3 基因重排 动物体存在多种免疫球蛋白，而基因重排是产生免疫球蛋白多样化的主要机制。基因重排机制首先在鸡中被发现，鸡免疫球蛋白重链和轻链的可变区(V区)基因上游存在大量的假基因，这些假基因插入并置换重排V区的同源序列，从而使免疫球蛋白呈现多样化[14]。类似的功能基因和假基因间的基因重排导致的抗体多样性例子在其他脊椎动物中都能发现。

1.5 成分测定方法

水分含量测定采用国标GB5009.3—2010直接干燥法[11]; 蛋白质含量测定根据国标 GB5009.5—2010凯氏定氮法[12]; 粗脂肪含量测定采用索氏抽提法[13]; 多糖含量测定采用亚甲基蓝比色法[14]。

1.6 数据分析

以优化的碳氮源为培养基,装液量为 50 mL/250 mL,设置摇床的转速分别为80、100、120、140、160 和 180 r·min–1,4 d 后对菌液密度进行测定(图8)。由图8可以看出,随着摇床转速的增加,酵母发酵密度呈上升趋势,由 80 r·min–1时的0.93×107 cells·mL–1 到 140 r·min–1 时的1.59×107 cells·mL–1,增加了 71%。此后,随转速的升高,菌体密度几乎无变化,故本实验的最佳摇瓶转速为140 r·min–1。摇瓶培养的转速和装液量对菌体发酵密度的影响因素基本一致,影响培养基中氧气的含量,转速越高,培养基中氧气的含量增加,利于酵母菌的生长繁殖,但当氧气含量达到一定限度后,酵母菌的密度就不再增加。

2 结果与分析

2.1 培养条件对酵母发酵生长的影响

2.1.1 碳源对酵母生长的影响

以上述优化的碳氮源为培养基,调节初始pH值,使其 pH值分别为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,培养 4 d后测定菌体的密度(图5)。当pH=3.0时,发酵液中酵母细胞密度最大,为1.19×107 cells·mL–1; 当pH=2.0 时,菌体密度迅速下降,达到最低密度值 0.32×107 cells·mL–1; 当pH>3时,随 pH的增大,细胞密度变小,但下降缓慢,pH=8.0 时密度仍为 0.54×107 cells·mL–1。由此可知,海洋酵母细胞培养的最适初始 pH=3.0,显著低于常温酵母最适pH为4.0—5.0的报道[5,16]。

  

图1 不同碳源对南极红酵母AN5发酵的影响Fig.1.Effect of different carbon sources on Antarctic yeast AN5 growth

  

图2 糖蜜浓度对南极酵母AN5发酵的影响Fig.2.Effect of different molasses concentration on Antarctic yeast AN5 growth

2.1.2 氮源对酵母发酵的影响

以上述优化的 2%的糖蜜为碳源,分别以液体玉米浆、固体玉米浆、糖蜜、玉米面、酵母粉、黄豆饼粉、蛋白胨、大豆蛋白胨、硫酸铵、硝酸钾为氮源,发酵培养 4 d后,测定酵母细胞密度(图3)。在10种氮源物质中,对AN5生长量的作用大小为酵母粉>大豆蛋白胨>蛋白胨>玉米面>固体玉米浆>硝酸钾>液体玉米浆>糖蜜>黄豆饼粉>硫酸铵。在8种有机氮源中,以酵母粉作为氮源进行发酵培养时,酵母细胞密度达最大值1.3×107 cells·mL–1,因此选取酵母粉作为发酵培养的最佳氮源,与杨莺莺等[16]的研究结果一致。两种无机氮源中,硝态氮的作用效果远高于铵态氮,杨莺莺等[16]对酵母RH1的发酵研究表明,硫酸铵和氯化铵作氮源时生长缓慢,与本研究结果一致。筛选出最佳氮源后,分别以0.25%、0.50%、0.75%和1.0%酵母粉浓度培养酵母(图4)。有图可知,以浓度为 0.5%的酵母粉进行发酵培养时,发酵液中酵母细胞密度可以达到2.03×107 cells·mL–1,随酵母粉浓度增加酵母细胞密度基本不变。考虑到发酵的密度和成本,选择0.5%酵母粉为酵母培养的最佳氮源。

“二战”以后，作为战败国的日本，国内经济处于崩溃边缘。1950年，日本还只能生产廉价而简单的商品。朝鲜战争爆发后，日本迎来了发展本国经济的重要机遇，但是，这个阶段的日本的各行各业基本都是以仿制和山寨为主，经过近20年的野蛮生长后，日本开始着手将传统手工业者的匠人精神传承于规模化制造，日本政府也在全社会持续倡导匠人精神，极大地提升了日本制造的品质。

  

图3 不同氮源对南极酵母AN5发酵的影响Fig.3.Effect of different nitrogen sources on Antarctic yeast AN5 growth

  

图4 酵母粉浓度对南极酵母AN5发酵的影响Fig.4.Effect of different yeast powder concentration on Antarctic yeast AN5 growth

2.1.3 初始pH对酵母生长的影响

分别以2%的玉米淀粉、蔗糖、糖蜜、玉米面、豆面、小米面代替YPD培养基中的葡萄糖,其他成分和培养条件不变,4 d后显微计数法测定菌体密度(图1)。6种碳源物质中,以糖蜜为碳源进行发酵培养时,酵母细胞密度达到最大值 1.19×107 cells·mL–1,其次为小米面 0.91×107 cells·mL–1,玉米淀粉、玉米面、豆面和蔗糖都约为 0.65×107 cells·mL–1,显著小于前2种。糖蜜含有海洋红酵母生长所必需的营养成分、维生素及微量元素等,发酵时明显优于其他碳源[15]。同时糖蜜是大宗廉价原料,价格便宜,综合考虑发酵菌量与生产成本,糖蜜为酵母菌培养的最佳碳源。分别以1.0%、2.0%、3.0%和4.0%浓度的糖蜜培养红酵母,酵母细胞密度见图2。结果发现2%的糖蜜发酵液中酵母细胞密度最大,为1.46×107 cells·mL–1,明显高于其他浓度,由此确定2%糖蜜为酵母培养的最佳碳源。

2.1.4 温度对酵母生长的影响

以上述优化的碳氮源为培养基,分别在10℃、15℃、20℃、25℃和30℃下培养酵母菌,4 d后酵母细胞密度见图6。由图可知,当温度从10℃升高到20℃时,菌体密度达到最大值 0.96×107 cells·mL–1。其后随温度的继续升高,酵母密度显著下降。因此,AN5菌株生长的最适温度为20℃,发酵时应控制在这一温度。酵母菌的最适生长温度因种属或菌株的来源不同而有所差别,杨莺莺等[16]和童应凯等[17]发现海洋红酵母Rhodotorula sp.的最佳培养温度为28℃,郭馨泽等[18]实验证明海洋红酵母003菌株的最佳生长温度为22℃。实验中所用酵母为海洋极地酵母,属适冷酵母种类,在低温环境下仍能保持活力,一般低于常温酵母的最适生长温度25—28℃[5]。

  

图5 初始pH对南极酵母AN5生长的影响Fig.5.Effect of different initial pH on Antarctic yeast AN5 growth

  

图6 温度对南极酵母AN5生长的影响Fig.6.Effect of different temperature on Antarctic yeast AN5 growth

2.1.5 装液量对酵母生长的影响

经上述条件优化,得到了极地红酵母AN5的最佳发酵条件,此时酵母密度达到 5.81×107 cells·mL–1,与周鲜娇等[19]的研究结果类似,但低于其他常温红酵母[16,18]。

  

图7 装液量对南极酵母AN5发酵的影响Fig.7.Effect of different liquid volume on Antarctic yeast AN5 growth

2.1.6 转速对酵母生长的影响

试验数据为 3次生物学重复平均所得,以平均值±标准误差表示,用软件 SPSS 15.0中的one- way ANOVA进行方差分析和差异显著性比较,P<0.05为差异显著,P<0.01为极显著差异。

11月23日,北京市人大常委会以专题询问的形式,让北京市政府及有关部门负责人与人大代表面对面,第一时间回应公众关切,并同步网络直播。

  

图8 转速对南极酵母AN5发酵的影响Fig.8.Effect of different rotation rate on Antarctic yeast AN5 growth

在250 mL的三角瓶中加入培养基和酵母种子液,使其终体积分别为30、50、70、90、110、130、150 mL,4 d后对菌液密度进行测定(图7)。当装液量为 50 mL时,酵母细胞密度达最大值0.99×107 cells·mL–1; 装液量为 30 mL和70 mL时,细胞密度显著降低; 当装液量大于70 mL时,菌体密度无显著变化,维持在 0.58×107 cells·mL–1。装液量的不同对酵母菌生长的影响体现在两个方面:(1)装液量越大,营养物质含量越多,为酵母菌的生长提供物质保证;(2)装液量越大意味着剩余空间越小,三角瓶内空气越少,随着时间增加,瓶内氧气消耗,废气增多,对酵母菌的生长起到抑制作用。本实验中,50 mL/250 mL的装液量为酵母生长的最佳体积,与郭馨泽等[18]的研究结果一致。

2.2 极地红酵母主要成分含量的测定

以优化后的培养条件大量发酵红酵母 AN5,所得菌体进行水分和主要营养成分的测定。经测定,极地红酵母AN5的平均含水量为69.15%。主要营养成分测定结果见表1,从表中可以看出,干酵母中粗蛋白含量约为42.00%,与常温红酵母中蛋白质含量相似,符合水产养殖中养殖动物对生物饵料的蛋白需求[20]。粗脂肪含量仅为0.39%,显著低于蔡诗庆等[21]测定的4.67%—6.35%。总糖是生物体能量的主要来源,酵母菌AN5的总糖含量为 32.08%,高于常温酵母[14,22],充足的糖类可被用以生物体生长能源的消耗,在水产养殖中发挥重要作用[23]。

11月21日，德州市十八届人大常委会第十六次会议举行联组会议，对德州市获得地方立法权后出台的首部实体性法规——《德州市城乡容貌和环境卫生管理条例》实施情况进行专题询问。联组会上，常委会委员和列席会议的省、市人大代表组成“考官团”，直击民生热点，向城管、交警、规划、交通等部门主要负责人提出了一系列群众普遍关注的问题。

 

表1 红酵母Rhodotorula sp.的主要营养成分Table 1.Main nutrient composition in several red yeasts Rhodotorula sp.

  

酵母菌种 蛋白质含量 脂肪含量总糖含量参考文献R.mucilaginosa AN5 42.00%±2.93% 0.39% 32.08% 本文R. mucilaginosa 49.2% 1.5% 22.3% [22]R.paludigenum 42.01% 3.09% 29.5% [14]

2.3 极地红酵母对幼参水分和主要营养成分的影响

以每天投喂0.3 g鲜酵母喂养海参幼苗,2个月后,测定海参体内的水分和主要营养成分含量(图9)。正常养殖的海参,含水量为92.02%,投喂红酵母的海参,含水量为 91.83%,水分含量没有显著差异; 投喂红酵母后,蛋白质干重由 35.84%增加到 43.19%,含量显著提高; 脂肪含量由7.77%变为7.95%,无明显变化; 但添加红酵母的海参中多糖的含量为 6.75%干重,较对照的5.46%增加了23.63%。

  

图9 南极酵母AN5作为微生态制剂对海参主要成分的影响.*表示对照组和实验组之间差异显著(P<0.05)Fig.9.Effect of Antarctic yeast AN5 as microecologics on main components of juvenile sea cucumber

3 讨论

3.1 酵母菌的发酵生产

酵母菌的大规模发酵生产是红酵母应用的前提和基础。科学家研究发现,不同的培养条件和发酵工艺会影响海洋红酵母的生物量,通过调整培养基中碳源、氮源、无机盐、生长因子等物质的种类和添加量,改变培养过程中的pH值、接种量、装液量、通气量等条件,可显著提高酵母菌的产量[14,18]。本实验所用碳氮源均为工业发酵原料,廉价易得,经过发酵工艺的优化,酵母细胞密度增加了6.21倍,达到了常温酵母发酵的生物量,为酵母细胞的大规模发酵生产奠定了基础。但本实验仅对单一的碳氮源进行了筛选,已有研究表明多种营养物质的组合更有利于酵母的生长[18-19],这是下一步研究的方向。另外,该研究只以生物量为指标进行了发酵优化,发酵条件对主要功能活性因子的影响有待进一步研究,以提高酵母菌的营养价值。值得一提的是,该红酵母的最佳发酵温度为 20℃,最适初始 pH为3.0。低温和低pH值培养可抑制杂菌的生长、减少污染。

3.2 红酵母作为饲料添加剂的应用潜力

红酵母是一种在海洋中广泛存在的单细胞微生物,复杂的生存环境造就了体内独特的代谢产物和活性物质[5],且酵母本身无毒副作用,安全性高[24],在果实保鲜[25-26]、畜禽养殖[27-28]等方面有着广泛的应用。

海洋红酵母及其发酵产物富含蛋白质、糖类、虾青素、维生素、矿物质等,含有较多的必需氨基酸,营养全面,是集营养与保健为一体的养殖微生态制剂,这些特殊营养成分弥补了常规饵料(或添加剂)的营养缺陷,可以提高水产动物抵抗力,减少抗生素的使用,提高水产品质量[29]。海洋红酵母Rhodotorula sp.作为微生物饵料在水产苗种培育领域的应用始于20世纪90年代,科学家们进行了大量的研究。陈昌福等[30]和Yang等[31]研究发现,饵料中添加海洋红酵母能够提高对虾的成活率和生长速率,使血清中抗氧化酶系统活性增强,增加对环境因子的耐受力。孙建男等[5]综述文献指出,海洋红酵母对养殖动物的生长免疫有明显的促进作用,可能是由于酵母生长中产生的消化酶类、维生素、生长因子等,促进了动物的消化吸收,提高了饲料的利用率。但张瑞玲等[32]在白鱼粉为主的大菱鲆饲料中添加海洋红酵母,则不能提高大菱鲆的摄食和生长性能。

本研究中,极地红酵母蛋白质和多糖的含量较高,作为微生态制剂应用于幼参的养殖中,能显著提高海参中蛋白和多糖的含量。海参饲喂酵母后,可在幼参体内存活定殖[33-34],体内超氧化物歧化酶、多酚氧化酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、溶菌酶、淀粉酶、纤维素酶、褐藻酸酶、一氧化氮合酶、胰酶、脂肪酶等酶类活性显著升高[34-39],促进了饵料的消化和吸收,使海参体内的蛋白质和多糖等主要营养成分物质含量增加[35],对生长具有较明显的促进作用[2,40],免疫反应增强,抗病力和存活率提高[33,36-38]。同时,红酵母作为营养型生物饵料直接为稚参提供营养物质,可提高海参幼体变态率和成活率[41]。除此之外,酵母具有较高的硝化能力,可有效去除海参养殖污水中的亚硝酸盐,改良养殖水质[42]。这些研究为酵母在海参养殖中的应用奠定了理论基础。

南极红酵母易于大规模发酵生产,且营养价值丰富,具有作为水产饵料生物的潜力,是较好的饲料原料,可用作鱼粉等蛋白源的替代物,具有良好的市场前景和开发潜力。

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