植物细胞色素P450(简称P450，Cyt P450)是一类含有血红素和疏基的氧化酶系，该酶系能与植物细胞内的质体、内质网和高尔基体等细胞器膜结合且具有复杂的生物学功能，因而近年来成为学术界的研究热点[1]。植物P450基因的命名一般以氨基酸序列的相似性作为依据，把同源性大于40%划归为同一家族成员，把同源性大于55%的视为同一家族的另一亚家族成员。随着转录组测序的发展，越来越多的植物P450被鉴定出来，目前已在拟南芥、玉米、大豆、水稻、番茄和蓖麻等模式农作物中发现了大量P450基因[2]。

P450在植物体中担当着重要的生物学功能，按照前人的研究结果，这些功能大致可分为2类，第一类是具有代谢解毒功能，它可催化一些外来物质的降解，使植物对一些除草剂、杀虫剂和环境毒物等产生抗性。例如水稻能通过P450的脱甲基(demethylation)作用降解苄嘧磺隆(bensulfuron-methyl，BSM)[3]。小麦能通过P450的环甲基羟基化作用(cyclomethylhydroxylation)降解绿麦隆(chlortoluron)[4]；第二类是能催化植物体的一些内源性物质转化为次生代谢产物，使植物抵抗一些外源性物质如昆虫、细菌的侵扰，增强植物的逆境生存能力。如植物P450在生物碱(alkaloid)、萜类(terpene)、植物激素类(phytohormone)、木质素(lignin)和黄酮类(flavonoid)等的生物合成中起到重要的催化作用，这些物质在植物抗虫、抗病过程中起到重要的作用[5]。

茶树是我国重要的经济作物，而选育具有抗虫、抗病性强的茶树新品种是育种工作者的重要目标之一，因此深入挖掘并研究茶树P450的功能对今后茶树的育种工作具有重要的指导意义。基于此，本研究从NCBI中下载获得了茶树全转录组数据库(Taxonomy ID：4442)，从该数据库中选取了茶树CYP710A1的基因片段，采用RT-PCR技术对该基因片段进行了碱基校正，并通过RACE技术获得了基因全长。通过相关分子生物学分析软件，分析了该基因的氨基酸结构、蛋白质理化性质、系统进化树及蛋白功能域。最后，通过qRT-PCR技术检测了该基因在茶树不同叶片中的表达特征。

1 材料与方法

1.1 试验材料及主要试剂

本研究以常规品种铁观音为试验材料，采样部位为单芽、一叶、二叶、三叶、四叶、五叶。样品采摘于福安市社口镇福建省农业科学院茶叶研究所2号山品种园(东经119°32′11″～119°38′之间，北纬27°8′～27°13′40″)。构建cDNA模板所用的植物总RNA提取试剂盒RNAprep pure plant kit (dp441)及反转录试剂盒FastKing RT Kit(With gDNase)购于Invitrogen公司；cDNA全长克隆所用的SMARTer® RACE 5′/3′Kit试剂盒以及荧光定量所用的FastFire qPCR PreMix(SYBR Green)试剂盒购于TaKaRa公司；普通分子试剂Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNase/RNase Free Water、DL2000 Marker及T4 DNA连接酶等均购于根生化科技(北京)有限公司。

1.2 总RNA提取及cDNA模板的合成

长势良好、叶片生长均匀的铁观音一芽一叶，用液氮冷冻后将其研磨成粉，参照植物总RNA提取试剂盒说明书，提取铁观音的总RNA，使用1.5%的琼脂糖凝胶检测所提取RNA的完整性，再用NanoDrop 2000分光光度计检测其纯度。最后，通过RNA反转录试剂盒，以提取的RNA为模板，将其反转录成克隆所用的cDNA模板。

2.2.4 蛋白功能域及亚细胞定位分析 通过SMART网站，进一步分析了茶树CYP710A1蛋白的功能结构域(functional domain structure)。结果表明，CYP710A1具有一个P450蛋白结构域(Pfam domain)，位于编码序列的第34～475(图5-黑色部分)位点上。另外，蛋白含有一个由“WLTLAPYLFSLVLLLVLLEQIFY”组成的跨膜结构域(transmembrane structure)(图5-蓝色部分)，位于编码序列的第5～27位点上。

1.3 茶树CYP710A1基因的中间片段克隆

在NCBI的物种分类学数据库中找到茶树的转录组基因信息(Taxonomy ID：4442)，通过下载获得了已登入的茶树转录组mRNA。分析发现，该转录组共有34万多条不完整mRNA信息，但无完整的基因序列命名。本研究通过建立本地Blast数据库(方法参照华大基因“windows系统下本地Blast的实现”)，在windows系统下重新建立单机版的茶树转录组数据库，通过比对分析获得茶树CYP710A1基因的序列片段。

首先，通过RT-PCR技术克隆获得了1 022 bp(图1-条带2)的CYP710A1中间序列。然后，通过5′ RACE技术克隆得了281 bp(图1-条带1)的CYP710A1头部序列，通过3′ RACE技术克隆得了610 bp(图1-条带3)的尾部序列。最后，拼接得到1 911 bp的CYP710A1基因全长。

1.4 茶树CYP710A1基因的5′及3′ RACE扩增

研究了CYP710A1基因在不同叶片间的表达差异。结果表明，CYP710A1基因在芽头的表达量最低，在一叶、二叶、三叶中的表达量依次升高，而后在四叶、五叶中的表达量依次回落。其中，在三叶中的最高表达量是芽头的38.17倍。

1.5 茶树CYP710A1基因的生物信息学分析

2.2.3 三级结构预测 进一步分析了CYP710A1蛋白的三级结构，结果显示该模型主要由α螺旋和β折叠组成，该模型的GMQE(Global Model Quality Estimation，模型质量估测)值为0.65(值越接近1，表明建模质量越好)，表明模型可信度较高。

1.6 茶树CYP710A1基因的表达检测

2.2.2 系统进化树分析 在NCBI比对了茶树CYP710A1基因的同源性，获得了与该基因同源性较高的博落回Macleaya cordata、莲花Nelumbo nucifera、胡桃 Juglans regia、栓皮栎Quercus suber、葡萄Vitis vinifera、黄花蒿Artemisia annua、莴苣Lactuca sativa、向日葵 Helianthus annuus、风铃椒 Capsicum baccatum和芝麻 Sesamum indicum的CYP710A1基因序列。将以上10个基因序列与茶树CYP710A1基因制成fasta格式文档，导入至MEGA 4.0软件中，利用邻位相连法(neighbor-joining，NJ)的1 000次多重比对方法，构建了茶树CYP710A1基因的系统进化树(图3)。从该进化树可以看出，茶树CYP710A1基因与风铃椒C. baccatum亲缘关系较近，而与博落回M.cordata亲缘关系较远。

表1 设计的引物

Table 1 Primers designed for study

基因名实验用途引物名引物序列(5′-3′)CYP710A1片段克隆710A1-F1ATACTCAAGCACCTTGTTCACTG710A1-R1GATTGACCCAATAACCCTAACAATAAC5′扩增710A1-R2- outerGTAGGATCGTGACCTTCCTTCATC710A1-R3- innerGAACCTCCTGCATCCAGAAATC3′扩增710A1-F2-innerTGGAGGAGAGGCAAGAGGAC710A1-F3-outerCTACGAATCTTCGTTCCAAGGATTC定量PCR710A1-F4AGGATCTCCGACGCCGAAT710A1-R4ACGACAATCTCTGCCAGTGAAGAPDF内参GAPDF-F1TTGGCATCGTTGAGGGTCTGAPDF-R1CAGTGGGAACACGGAAAGC

注：表中的F为基因的正向引物，R为基因的反向引物，inner为基因的内引物，outer为基因的外引物。

1.7 数据统计与分析

qRT-PCR每组样品设3个重复，并采用means±SE取均值的计算方法，对每组数据于Microsoft Office Excel软件中进行作图，差异性显著分析由SPSS 13.0软件中的邓肯氏(Duncan’s multiple range test)单因素方差(one-way ANOVA)方法分析完成(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 茶树CYP710A1基因的全长克隆

根据已有的茶树CYP71A26序列信息，通过Primer 5.0软件设计一对简并引物710A1-F1/R1(表1)，并以已构建的茶树cDNA为模板，通过RT-PCR技术进行扩增。RT-PCR反应程序为：94℃总变性3 min；94℃预变性30 s，59℃退火60 s，72℃延伸1.5 min，共33个循环；最后，72℃延伸15 min后，4℃保存备用。紧接着，将目的条带进行双酶切与载体pMD19-T进行连接，并进行转化、蓝白斑挑选后送往测序公司(上海铂尚生物技术有限公司)委托测序。

2.2 茶树CYP710A1基因的生物信息学分析

2.2.1 蛋白质理化性质分析 通过ProtParam网站对CYP710A1基因全长进行了分析，结果表明CYP710A1含有1 506 bp的编码序列(ORF)，能够编码501个氨基酸(图2)，所编码蛋白的分子式为C1772H2803N481O526S12，分子量大小为57.06 kDa，理论等电点为7.64，总的亲水性平均系数-0.092。

本文仅考虑泊位资源、腹地货源和中转时间等因素对干支航线网络形成的影响，未来研究中可引入运输成本和收益等经济因素以进一步分析，包括对可替代支线航线的分析。

试验茶样取自于长势良好、叶片生长均匀的铁观音茶园，并于新梢的芽头、一芽1～5叶共6个叶外分别取样，置于-80℃冰箱中保存备用。参照步骤1.2，将所取样品反转录成cDNA模板，用于检测茶树CYP710A1基因在不同叶片中的表达含量。根据已获得的茶树CYP710A1基因全长，采用Primer 5.0软件设计一对特异性的荧光定量引物710A1-F4/R4(表1)及一对荧光定量引物GAPDH-F1/R1(表1)，参照荧光定量试剂盒的操作步骤，配制每样20 μL的总反应体系：正反引物各1.0 μL；样品cDNA 1.0 μL；SYBR Green 10.0 μL；最后补ddH2O 7.0 μL。qRT-PCR 反应程序为：95℃总变性30s；95℃预变性5s，60℃退火30s，72℃延伸30 s，共33个循环；最后，采用比较CT的计算方法(2-ΔΔCT)计算茶树CYP710A1基因在不同叶片中的表达含量。

图1 茶树CYP710A1基因的全长克隆 Fig.1 Full length of CYP710A1 gene cloned from C.sinensis 注：M1-M3条带为DNA Marker 2000，1-3条带分别 为CYP710A1基因的中间、头部和尾部序列。

图2 茶树 CYP710A1基因编码的氨基酸序列 Fig.2 Sequence of ORF from CYP710A1 gene of C.sinensis

图3 茶树 CYP710A1基因的系统进化树 Fig.3 Phylogenetic tree of CYP710A1 gene from C.sinensis 注：树中左侧包含的数字代表不同物种间亲缘关系的远近。

茶树CYP710A1基因的氨基酸结构、蛋白质理化性质、三级结构、蛋白功能域及系统进化树的分析方法及分析的网站参见单睿阳等[2]。

由表6可知，11种辣椒原料存在显著性差异，说明利用电子鼻可以有效区分辣椒品种。且所有红熟期辣椒、所有绿熟期辣椒和同一品种红绿果辣椒辣度测定结果均与上述结果吻合：感官评价为不辣的辣椒原料，其W5S、W1W、W2W数值之和在1～10之间；感官评价为微辣的辣椒原料，其W5S、W1W、W2W传感器辣度值之和在10.1～20之间；感官评价为辣的辣椒原料，其W5S、W1W、W2W传感器辣度值之和在20.1～50，其中，魔鬼椒的W5S、W1W、W2W传感器辣度值之和大于50.1，评定为超辣，证明电子鼻测定辣椒辣度的可行性。

2.3 茶树CYP71A26基因在不同叶片间的差异表达分析

获得茶树CYP710A1的中间序列后，在头部5′端设计一对特异性引物710A1-R2-outer与710A1-R3-inner(表1)进行5′ RACE扩增。紧接着，在尾部3′端设计另外一对特异性引物710A1-F2-outer与710A1-F3-inner(表1)进行3′ RACE扩增。5′与3′RACE反应程序参照步骤1.3。最后，使用DNAstar 8.0软件，将三段序列的重复序列去除，并拼接获得茶树CYP710A1的全长序列。

现阶段，随着我国科技水平的不断提升，智能手机已经得到了广泛的普及。学生能够借助手机来进入到淘宝、京东、拼多多等网站进行网购，网购商品繁多、操作简单，这在一定程度上拓展了学生的消费需求。

图4 茶树 CYP710A1蛋白的三级结构 Fig.4 Tertiary structure of CYP710A1 of C.sinensis

图5 茶树 CYP710A1的蛋白功能域 Fig.5 Functional domain of CYP710A1 protein of C.sinensis 注：图下方的数字代表编码的氨基酸顺序。

图6 茶树CYP710A1基因的在不同叶片间的表达量 Fig.6 Expression of CYP710A1 gene in leaves at different positions on a C.sinensis plant

3 讨论与结论

本研究利用NCBI中的茶树转录组数据库，获得了茶树CYP710A1的部分片段。通过RT-PCR及RACE技术克隆了该基因的全长。该基因全长含有1 506 bp的编码序列(ORF)，能够编码502个氨基酸，具有一段较长的P450蛋白结构域(Pfam domain)，从而说明该基因为典型的茶树P450基因。同时，该蛋白具有能与细胞膜结合的小段跨膜结构域(transmembrane structure)，与前人所阐述的P450多数为跨膜蛋白，且多数位于细胞内的如质体、内质网和高尔基体等细胞器膜上相符[2]。

党的十九大深刻指出，进入新时代，人民美好生活需要日益广泛，不仅对物质文化生活提出了更高要求，而且在民主、法治、公平、正义、安全、环境等方面的要求日益增长。

植物在自然生长过程中，不可避免的会受到外界病虫害的侵扰，而P450在抵抗侵染过程中发挥着重要的作用[6]。如Wang等[7]研究表明，当蚜虫Myzus persicae为害烟草叶片后，烟草叶片中的腺毛能激发细胞色素P450(CYP51)的特异表达，从而提高对蚜虫的抵抗能力。以及P450所催化的内源性物质代谢，能将苯丙烷类物质转化成有毒的花椒毒素(xanthotoxin)，提高棉花对棉铃虫Helicoverpa armigera的抵抗能力[8]。郭萧等[9]研究了取食茶树不同成熟度叶片对茶尺蠖Ectropis oblique生长发育的影响。结果表明，嫩叶有利于茶尺蠖的生长，而老叶则不利于茶尺蠖种群的发生。本研究对CYP710A1在不同叶片的表达含量做了相应的检测，结果表明CYP710A1基因在芽头的表达量最低，在一叶、二叶、三叶中的表达量依次升高，而后在四叶、五叶中的表达量依次回落，这是否与不同成熟度的叶片对病虫害具有不同的抵抗能力相关，后续仍需做进一步研究。

肉牛养殖中，胃肠道疾病是十分常见的一类疾病。引起肉牛胃肠道疾病的致病原因多样，包括致病原因和饲养管理。在具体诊治中，应该结合肉牛临床症状，明确致病原因，采取针对性措施进行治疗，避免随意用药，增加药物耐药性，降低治疗效果。

参考文献

[1]曹运鹏,程曦,程俊,等.砀山酥梨细胞色素P450的基因组学分析[J].核农学报,2016,30(2):259-266.

[2]单睿阳,林郑和,陈志辉,等.茶树细胞色素P450基因CYP71A26与CYP71B34的克隆及差异表达特征分析[J].茶叶科学,2018,38(5):450-460.

[3]Zhou N, Tootle T L, Glazebrook J. Arabidopsis PAD3, a gene required for camalex in biosynthesis, encodes a putative cytochrome P450 monooxygenase [J]. The Plant Cell,1999,11(12):2419-2428.

[4]Deng F, Hatzios K K. Characterization of cytochrome P450-mediated bensulfuron-methyl O-demethylation in rice [J]. Pesticide Biochemistry & Physiology, 2002,74(2):102-115.

[5]解敏敏.烟草重要基因篇:8.烟草P450基因[J].中国烟草科学,2015,36(2):118-120.

[6]王丹,陈亮.茶树对茶尺蠖抗性机制研究[J].茶叶科学,2014,34(6):541-547.

[7]Wang E, Wang R, DeParasis J, et al. Suppression of a P450 hydroxylase gene in plant trichome glands enhances natural-product-based aphid resistance [J]. Nature Biotechnology,2001,19(4):371-374.

[8]戴素明,周程爱,谢丙炎,等.细胞色素P450表达在植物防御反应中的作用[J].石河子大学学报,2004,22(7):184-187.

[9]郭萧,王晓庆,彭萍,等.茶树不同成熟度叶片对茶尺蠖发育适合度的影响[J].茶叶科学,2012,32(3):229-235.