猪瘟是由猪瘟病毒（CFSV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。以出血性高热和免疫抑制为主要特征，发病率和病死率均很高，对养猪业危害巨大。世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类烈性传染病，《中华人民共和国动物防疫法》将其列为一类传染病[1]。猪瘟一旦发生，将给饲养者造成惨重的经济损失。随着人们对猪瘟病毒分子生物学的不断研究，疫苗的广泛应用，猪瘟得到了有效控制，但由于自身免疫系统的影响，使猪瘟病毒能够在猪体中建立持续的感染，使之逃避宿主的免疫清除，从而出现猪瘟免疫效果低下的现象时有发生，成为猪瘟暴发的安全隐患[2]。

免疫系统是一个由固有免疫系统和适应性免疫系统相叠加而形成的复杂系统，免疫细胞弥散分布，它们之间没有固定的网络联系。这样的一个系统之所以能够特异、有效地发挥免疫保护作用，取决于不同免疫细胞之间高度有序的分工合作与紧密协调，而细胞因子就是免疫细胞之间相互交流的 “语言”。细胞因子是指由机体的免疫细胞或非免疫细胞合成和分泌的蛋白质或小分子多肽，能调节细胞生理功能、参与免疫应答和介导炎症反应等多种生物学效应，细胞因子对于细胞间相互作用、细胞的生长和分化有重要的调节作用[3]。根据细胞因子功能的不同，主要分为白细胞介素（Interleukin，IL）、干扰素（Interferon，IFN）、集落刺激因子（Colony stimulating factor，CSF）、 肿 瘤 坏 死 因 子 （Tumor necrosis factor，TNF）等。对上述细胞因子进行研究不但可以帮助人类阐明猪病的发生机理及猪体抵抗感染的免疫机制，并且对猪病的诊断和防治也具有重要的参考作用。通过ELISA试验对某规模化猪场母猪的血清进行猪瘟抗体水平检测，并按被检母猪健康状态和免疫状况进行分类，同时对各自血清中具有免疫调节作用的细胞因子干扰素-r(IFN-r)和白细胞介素-4（IL-4）进行分析比较，进而阐明猪瘟抗体水平低下原因，为机体免疫状况影响猪瘟抗体水平表达提供科学的理论依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

1.1.1　血清样品 随机抽取光泽县某规模化种猪场54头母猪血液。

1.1.2　试剂 猪瘟、蓝耳病、伪狂犬病ELISA抗体检测试剂盒购自北京爱德氏元亨生物科技有限公司；细胞因子IFN-r和IL-4 ELISA检测试剂盒购自美国RD公司 （上述试剂盒均是特异性针对猪而设计的）；氯仿；异丙醇；70%酒精；DEPC 水、Taq DNA聚合酶、M-MLV反转录酶、Trizol RNA提取试剂购于Invitrogen公司，dNTP购于TaKaRa公司。

2.1　主要病毒及猪瘟抗体水平检测 抽检的54头母猪一个月前进行过猪瘟疫苗免疫，通过对引起免疫反应低下的常见因素进行逐个分析排查，采用ELISA、PCR方法对54份血清样品进行伪狂犬病gE、蓝耳病、猪瘟检测，监测出4头猪感染了猪瘟，2头感染蓝耳病、1头感染了伪狂犬病，其中有1头属混合感染。最终确定47份血清样品无其他病毒感染，对47份血清进行猪瘟抗体检测，检测结果见表1。

当前大多小学生的写作能力不高，并且在写作的过程中不明白怎样使用作文素材，甚至不知道怎样去完成一篇高水平的文章。因此，教师和家长在对学生进行教育的过程中应注重阅读对于学生的重要意义，为学生构建高质量的阅读平台，从而支持学生开展课外阅读，激发其阅读兴趣，使学生喜欢阅读，提高学生的阅读能力以及写作能力。

On the Need for Public Participation through the “Strange Buildings” Incidents________________LI Jiaqi et al 82

1.1.4　实验室环境 温度25℃，相对湿度58%。

如果在肥料成本相同的情况下，需要思考不同肥料处理背景下所产生的经济效益不同。结合实验结果分析无肥区、常规施肥区以及5个缓控释施肥区的产值与纯收入对比，5个缓控释施肥区在收入上均比无肥区更高，而常规施肥区则位居第6位。其中纯收入最高的为处理4区，它的收入可达到2.98元/m2，而无肥区收入最低，只有1.05元/m2。

1.2　试验方法

1.2.1　血清分离 使用不含热原和内毒素离心小管（操作避免任何细胞刺激），收集血液后送达实验室，3 000 r/min离心除去红细胞。短时间可存放于4℃冰箱，如需长期存放，应放于-20℃低温冰箱。

1.2.2　ELISA检测方法 对猪瘟抗体、伪狂犬病gE抗体、蓝耳病抗体，以及细胞因子IFN-r、IL-4进行ELISA检测，试剂盒所有组分均恢复到室温18～25℃，试剂轻轻旋转混合均匀。此外，洗涤缓冲液用蒸馏水进行1∶20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。具体检测步骤和要求参见操作说明书进行。

[3]魏彦明,瞿自明,郑继方.家兔脾虚证动物模型免疫功能的变化[J].中国兽医学报,1998,18(1):95-97.

1.3　统计学分析 采用统计学分析软件SPSS15.0对试验数据进行单因素方差分析 （one-way ANOVA），以 p＜0.05 为差异显著。

1.4　结果判定 猪瘟抗体检测：阻断率≤30%，表示抗体阴性；当阻断率≥40%，表示抗体阳性；阻断率在30%～40%，应在数日后再对该动物重新检测。猪群猪瘟抗体阻断率＞40%达到100%，或者＞50%达到85%，离散度＜25%，表示猪群免疫状况很好；离散度在25%～40%表示免疫效果一般。

伪狂犬病gE抗体检测：当S/N值≥0.7，表示gE抗体阴性；0.6≤S/N值＜0.7，表示可疑；S/N值＜0.6表示gE抗体阳性。

这道题跟课本例题一样，都是出租车情境，只是由二段计费拓展到三段计费。学生的错误率就非常高，常见错误如下图：

柳冠中和李乐山是中国工业设计界两名德高望重的前辈，对工业设计的普及和发展做出了巨大的贡献，但长期以来，人们习惯于对两人进行单独的研究，并未对他们的设计思想进行横向比较分析。实际上，柳冠中和李乐山看似独立的设计思想中有许多共性，即“和而不同”。对柳冠中和李乐山设计思想进行比较研究，可以让人们深入全面地了解他们的设计思想以及两人对中国工业设计所做的伟大贡献。

蓝耳病抗体检测：当S/P值＜0.4，表示蓝耳病抗体阴性；S/P值≥0.4表示抗体阳性。

2　结果与分析

1.1.3　器材 美国伯乐公司680酶标仪；德国Eppendorf移液器（50 uL 和 100 uL）；Thermo公司高速冷冻离心机；Thermal公司梯度PCR仪；北京市六一仪器厂电泳仪；BIO-RAD公司紫外线凝胶成像仪；1.5 mL离心管、离心机、一次性胶头等。

根据上述判定标准，47头母猪中猪瘟抗体检测阳性率达到74.47%，平均值为52.63，离散度为39.67%，说明该猪场猪瘟抗体水平较差。之后对阻断率在30%～40%的6头可疑猪只，重新进行猪瘟抗体检测，其中有5头为阴性，1头为阳性。

表1　猪瘟抗体检测结果

项 目 总体 阴性 可疑 阳性检测份数（头）抗体阴性、可疑或阳性率（%）抗体平均值抗体离散度（%）47-52.63 39.67 6 6 12.77 18.80 47.01 12.77 35.92 9.44 35 74.47 61.30 25.69

2.5.9 术后尿失禁 暂时性尿失禁一般无需特殊治疗，患者加强括约肌功能锻炼有助于尿控功能尽早恢复。永久性尿失禁一旦发生，临床治疗比较困难，必要时需要使用人工括约肌植入进行治疗。

表2　抗体水平高低对细胞因子IFN-r、IL-4含量的比较

注：同行数据肩标相同小写字母表示差异不显著（P＞0.05），不同小写字母者表示差异显著（p＜0.05）。

项 目 抗体阴性 抗体阳性检测份数（头）IFN-r浓度（pg/mL）IL-4浓度（pg/mL）11 5.59±0.47a 9.56±1.12a 36 5.24±0.20b 7.31±0.49a

3　讨 论

为了维持机体的生理平衡，抵抗病原微生物的侵袭，机体的许多细胞特别是免疫细胞合成和分泌多种微量的多肽类因子，即细胞因子。它们在细胞之间传递信息，调节细胞的生理过程。细胞因子都是通过与靶细胞表面的细胞因子受体特异性结合后才能发挥其生物学效应，这些效应包括促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感染和杀肿瘤细胞效应，促进或抑制其他细胞因子的合成，促进炎症过程，影响细胞代谢等。细胞因子的这些作用具有网络性的特点，即不同的细胞因子之间组合，有的起拮抗作用，有的起协同作用，由此构成了复杂的细胞因子免疫调节网络。细胞因子表达水平是反映机体免疫功能的重要指标，细胞因子根据其功能不同可分为Th1、Th2两个亚群，通过表达不同的细胞因子介导各自的免疫功能。Th1主要介导细胞免疫，Th2主要介导体液免疫。干扰素-r（IFN-r）主要由Th1细胞分泌，白细胞介素-4（IL-4）主要由Th2细胞分泌。正常猪体内Th1、Th2细胞及其分泌的细胞因子在体内处于动态平衡状态，其平衡被打破可导致机体免疫功能紊乱、抗体水平低下而引发疾病[4]。IL-4是重要的Th2型细胞因子，是体液免疫的重要调节因子，IL-4在抗原递呈及淋巴细胞激活过程中起重要作用，使抗原递呈能力显著增强；另外作用于静止的B细胞时，能促进B细胞发生增殖，使特异性IgG和IgE分泌增多，调节Th1和Th2细胞平衡。IFN-r是一种具有广泛高效的抗病毒和免疫调节作用的细胞因子，能直接增强NK细胞杀伤病毒的能力，但它的表达和分泌受到机体的严格调控，在病理或免疫状态下，IFN-r的表达会出现异常。

据夏燕华等的研究，CSF抗体水平过高能够抑制IFN启动子的活化，直接影响机体抗病毒的功能，为病毒感染扫除了障碍，是病毒建立持续感染的重要原因[5]。据胡永明等研究，CSF抗体水平高会引起机体IFN-r的产生量降低[6]。据王惟研究，CSF抗体阴性猪外周血中IFN-r的表达量与抗体阳性猪相比无显著差异[7]。有研究表明，在疫苗中加入不同浓度的IFN-r作为复合佐剂免疫小鼠，能够促进抗体分泌量，提高特异性细胞免疫效果[8]。本试验结果表明，CSF抗体阴性猪血清中IFN-r的表达量略高于抗体阳性猪，但无显著差异（P＞0.05），与王惟等的报道相一致。

本试验结果表明，CSF抗体阴性猪中IL-4的表达量显著高于抗体阳性猪（p＜0.05），与一些研究报道不尽一致，他们认为，CSF抗体阴性猪PBL的IL-4表达量显著低于抗体阳性猪，其原因可能是血清样本存在差异，在进行细胞因子IL-4、IFN-r检测前，对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒和蓝耳病病毒等主要病毒进行排除，确认无这些主要病毒感染，且已筛选掉抗体异常高的母猪。同时有研究表明，IL-4对B细胞的作用受IFN-r的影响，当IFN-r与IL-4同时存在时，IL-4促进IgG1、IgG3、IgE产生的作用则被抑制[9]。本试验抗体阴性猪中IL-4与IFN-r的表达量均高于抗体阳性猪，因此猪瘟抗体阴性猪中IL-4促进抗体产生能力较阳性猪更弱，这也许是引起猪瘟抗体水平较低的原因之一。

IL-4、IFN-r都是具有免疫调节作用的细胞因子，因此，对于抗体水平低、免疫功能异常的猪，其血液中的IL-4、IFN-r表达水平值得关注。本试验结果表明，CSF抗体阴性猪中IL-4的表达量显著高于抗体阳性猪（p＜0.05），而 IFN-r无显著差异（P＞0.05）。检测IFN-r、IL-4等细胞因子在外周血中的表达能够为揭示猪瘟抗体水平低下的原因提供参考，并为最终改善猪瘟疫苗免疫效果奠定基础。

2.2　细胞因子检测 对47份抗体阴性和抗体阳性猪血清进行细胞因子IFN-r和IL-4含量检测，利用统计学分析软件SPSS15.0对抗体阴性猪和抗体阳性猪两组数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），结果由表2。CSF抗体阴性猪外周血中IL-4的浓度为（9.56±1.12）pg/mL，高于抗体阳性猪（7.31±0.49）pg/mL，差异显著（p＜0.05）。 而 CSF 抗体阴性猪外周血中 IFN-r浓度为（5.59±0.47）pg/mL，略高于抗体阳性猪的（5.24±0.20）pg/mL，但无明显差异（P＞0.05）。

4　结 论

应用PCR对送检54头母猪血清样品进行蓝耳病病毒、猪瘟病毒检测，同时应用ELISA方法进行猪瘟、蓝耳病、伪狂犬病（IgE）抗体检测，排除主要病毒感染和抗体水平异常高的母猪，最终确定47头无主要病毒感染的猪只，其中11头猪瘟抗体阴性猪和36头抗体阳性猪。应用ELISA方法分析血清中IL-4和IFN-r两种细胞因子的表达水平，结果表明，CSF抗体阴性猪中IL-4的表达量显著高于抗体阳性猪（p＜0.05），IFN-r的表达量与抗体阳性猪相比无显著差异（P＞0.05），为揭示猪瘟抗体水平低下的原因提供参考，并为最终改善猪瘟疫苗免疫效果奠定基础。

参考文献：

[1]王惟,付明山,涂长春,等.猪瘟疫苗免疫反应低下猪CD3+CD4+和CD4+CD25+淋巴细胞亚群分析[J].中国生物制品学杂志,2010,23(4):378-381.

[2]张正兴,范学政,王琴,等.猪细胞因子检测方法进展[J].中国兽药杂志,2012,46(1):57-60.

1.2.3　PCR检测方法 对猪瘟病毒、蓝耳病病毒进行PCR检测。简要步骤如下：制备琼脂糖凝胶，或者聚丙烯酰胺凝胶；取少量（约5 uL）PCR产物（确定加入上样缓冲液）点样到凝胶孔里；接通电源，调好电压（120 V），开始运行；等跑到大概2/3处，在紫外成像仪里查看条带。

其最优分配方法为Adam(s)法，即s的算术平均绝对偏差法，做法是在进行预分配后，将剩余席位优先分给预-后分配率算术平均Ai(s)=(si-+si+)/2与总分配率s的偏差s-Ai(s)最大的部门.且指标s-Ai(s)最大等价于偏差Hi(r)-r最大，而通常使用的Q值方法相当于指标Gi(r)-r最大优先法，其中H(r)与G(r)表示代表率r=s-1的调和平均与几何平均.由于Huntington的Q值法不满足公理Ax.6,所以相比之下,Adam(s)法优于Huntington的Q值法.而在1913年之后，美国国会众议院的席位就大致固定在435席，所以应该采用Rdam(s)法。

[4]高耀东,郭新胜.结肠癌患者血清IFN-r、IL-4检测及临床意义[J].山东医药,2005,45(14):40.

[5]夏燕华,赵天生.猪瘟病毒对IFN-β启动子活化[J].南昌大学学报,2012,36(4):394-397.

[6]胡永明,赵明秋,陈立军,等.猪瘟病毒感染对猪外周血T淋巴细胞亚群及TNF-α和IFN-γ的影响[J].中国预防兽医学报,2011,33(2):126-129.

目前在碳市场上存在着各种买家，包括CERs的最终用户，碳资产、碳基金等金融机构或中介公司等，一定要加强对国际规则和国外公司的了解，如果在对交易对方的资信等情况一无所知的情况下就把数千万或数以亿元计的合同签订下来，就有可能带来不可预估的风险。尤其在现阶段，项目业主一定要慎重选择碳资产买家，不能一味看重CERs价格而忽视其资信和履约能力，应进行重大交易前的尽职调查，尽量选择CERs最终用户或信用等级高的碳基金公司。

[7]王惟,涂长春.猪瘟疫苗免疫反应低下猪的免疫功能分析[D].长春:吉林大学,2009:6.

[8]吴霜,吴继周.慢性乙型肝炎的发病机制与诊疗[D].南宁:广西医科大学,2008.

[9]Swierczynski B,Higgins D P,et al.Assessment of anti-bovine IL-4 and IFN-r antibodies to label IL-4 and IFN-r in lymphocytes of the koala and brushtail possum[J].Vet Immunol Immunopathol,2004,101(3/4):153-160.

几个家伙把陈大勇按在地上，七手八脚捆得和粽子一样，又连拖带推押进一间黑不见光的房间。这时，一盏马灯亮了，陈大勇这才看清屋里有一张方桌，方桌边坐着两个人，一个是刚才压低了嗓子的女汉子，另一个是穿了身灰衣服，戴着玳瑁眼镜的清瘦男人。