放疗是胸部恶性肿瘤的主要治疗方式之一，近年来，虽然放疗设备不断更新，放射技术不断完善，但放疗过程中导致的放射性肺损伤，特别是放射性肺纤维化的发生率仍然较高，且缺乏有效治疗措施，这限制了胸部肿瘤放疗剂量的提升，导致肿瘤控制率降低，甚至已经成为了一个重要的非肿瘤致死因素[1-2]。因此，寻找一种有效的防治放射性肺纤维化方法，成为临床中急需解决的问题。CpG-ODN是一种人工模拟细菌 DNA合成的含有非甲基化的寡聚核苷酸序列，作为一种免疫佐剂，能调节哺乳动物产生免疫反应，在恶性肿瘤、变应性疾病、感染性疾病的预治方面发挥一定的作用[3]。原第二军医大学放射医学教研室从2011年开始从事CpG-ODN对电离辐射损伤防治效应的研究工作[4-5]。近期发现，CpG-ODN在减轻放射性肺纤维化过程中具有重要的作用，本研究建立了一个完整的放射性肺纤维化动物模型平台，以评估CpG-ODN在放射性肺纤维化防治中的作用，并探讨可能的机理，为临床研究提供实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

CpG-ODN由上海生物工程技术有限公司合成，具体序列为：5’-TCGTCG TTT TCGGCGCGC CG-3’（加黑和下划线的碱基为硫代修饰，其他的碱基为磷酸化修饰），将合成的CpG-ODN粉末用去离子水配置成浓度为100 μmol/L的储备液，使用时再用PBS溶液稀释到浓度为250 μg/mL的工作液。

1.2 动物

C57BL/6雌性小鼠，体重 19～21 g，年龄 6～7周，由原解放军第二军医大学动物中心统一购自上海思莱克实验动物有限公司。小鼠购回后在本实验室动物房饲养，根据相关实验标准保持通风，自然采光，温度控制在23 °C左右。小鼠饲料由上海仕林生物科技有限公司提供，小鼠垫料由上海福禾实验用品供应站提供。

1.3 肺部照射

小鼠被 4%水合氯醛溶液麻醉后仰卧固定在长宽高分别为8.0 cm × 3.5 cm× 3.5 cm的特制透明塑料盒中，充分暴露其胸部，覆以23 mm蜡块以调整剂量分布，限定双侧锁骨下到剑突下为照射区，使用铅模保护头部与腹部，单次肺部照射至吸收剂量15 Gy，剂量率1.0 Gy/min。照射前射野片验证全肺受照。

行！老机八，你得活着，你娘还等你尽孝呢。陈大勇收了两块“国父”（孙中山头像的银元）。头也不回地往北窜。

1.3.1 对照组 采取硝苯地平(四川德峰药业有限公司，国药准字：H21023054)治疗：予以硝苯地平10 mg/次，3次/d，口服。

1.4 分组

小鼠全肺照射后连续 20周观察肺组织的病理学变化。如图2(a)所示，正常小鼠肺组织结构清晰，肺泡壁薄而光滑，肺泡完整，未见明显的纤维化改变。照射对照组小鼠在第2周可见部分肺泡缩小，肺泡间隔增宽，肺泡腔内有少量渗出，大气管周围出现纤维化；第10周肺泡间隔出现破坏，纤维化面积增大呈条索状分布；第16周肺间隔弥漫性破坏，肺泡腔塌陷，甚至部分实变，肺泡腔内和气管周围出现大片状纤维化，而照射给药组小鼠肺组织病理改变及纤维化程度与照射对照组比较明显减轻。根据Ashcroft分级标准进行评分，照射给药组小鼠肺组织纤维化评分在各时间点与照射对照组比较均有不同程度降低，第 20周 Ashcroft评级分数降低 2分（图2(b)）。纤维化面积定量结果显示，从照射后第2周开始肺纤维化面积随时间而不断增加，特别在第10～16 周纤维化快速形成，而照射给药组肺纤维化面积在各时间点均小于照射对照组，形成纤维化速度相对缓慢，第 20周纤维化面积减少约 11%（图2(c)）。这表明CpG-ODN能减轻受照小鼠肺组织纤维化的形成。

小鼠全肺照射后连续观察20周，照射对照组小鼠在照射后约第2周开始出现精神萎靡，进食和进水量减少，活动不佳，第3周全身毛发光泽变暗，第4周开始胸部照射区域黑色皮毛变白，第8周全部变白。照射给药组小鼠第2周出现精神萎靡等表现，第4周后精神状态逐渐改善，进食和进水量增加，照射区域皮毛未见明显变白。解剖后肉眼观察肺组织，正常小鼠肺表面均光滑，呈粉红色，弹性好。照射对照组小鼠肺组织在第1周稍有肿胀，表面见少量散在出血点，第3～8周肺的颜色由鲜红色逐渐变为暗红色，颜色逐渐加深，肺组织进行性肿胀，第10周肺体积开始明显缩小，表面成灰白色，可见凹凸不平结节，质地硬，弹性明显降低。照射给药组小鼠照射后第 4～20周肺组织未见明显损伤变化。肺指数结果与大体肺组织病理变化基本一致（见图1）。

1.5 肺指数计算

将2016年11月—2017年11月期间纳入且诊治的50例胰腺癌患者当做此次分析目标，报道且评估MR检查和多排螺旋CT检查的诊断效果。

小鼠在处死前测量体重，处死后将肺组织完整取出并立即称重，计算肺指数。

肺指数=全肺重量(mg)/小鼠体重(g)

1.6 病理组织学观察

由于CpG-ODN能够抑制促纤维化因子TGF-β1的表达，我们推测其可能也影响下游的TGF-β1/Smad依赖性纤维化通路 [7]。如图4(a)所示，免疫组化法检测肺组织内 TGF-β1/Smad依赖性纤维化通路中的关键蛋白，包括TGF-β1、TβR、磷酸化Smad 2/3和Smad 7，并分别定量分析，具体见图 4(b)、(c)、(d)、(e)。

探究前的知识储备：教师引导学生复习绿色植物在光合作用中的物质变化和能量变化的实质，重点回顾化学能贮存在有机物中的要点，点亮学生思维中关于能量和物质之间的关联，也为后面的探究埋下伏笔。

1.7 免疫组化染色

数据均以±s表示，采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。20周内肺纤维化评级结果使用秩和检验法分析，20 周内肺纤维化面积结果使用方差法分析，其他结果的两组之间比较使用两组独立样本的t检验。*p＜0.05时被认为具有统计学差异。

1.8 细胞因子检测

通过摘眼球法收集小鼠全血，将血液样本放置于含有肝素的EP管中，离心法(3 000 r/min，10 min)分离和收集血浆，使用酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbnent assay, ELISA)试剂盒（联科生物，杭州）检测血浆中TGF-β1的含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.9 统计分析

将已制成的石蜡切片脱蜡，在 pH=6.0的柠檬酸盐缓冲液中修复5 min，3% H2O2封闭10 min，5%山羊血清室温封闭1 h，分别加入所需的单克隆抗体TGF-β1、TβR (TGF-β1 receptor)、phosphor-Smad 2/3（磷酸化Smad 2/3）和Smad 7，4 ℃孵育过夜，次日滴加含有生物素标记的二抗IgG 10 min，DBA染色，以褐色为阳性，苏木精复染，中性树胶封片。显微镜下拍照，Image-Pro Plus图像分析系统进行图像采集。

2 结果

2.1 CpG-ODN对小鼠基本情况及大体肺组织损伤的影响

他没有惊天动地的事迹，但他在为做好本职工作无私地奉献着；他没有掷地有声的豪言壮语，但他为双拥创建的点滴进步引以为豪；他没有惊世骇俗的丰功伟绩，但他在平凡的岗位上做出了骄人的业绩……儿时就有当兵梦，工作后，他从公安干警到区宗教局局长，从区委政法委副书记到区委统战部副部长，30多年来，尽管工作岗位在变化，尽管拥军的时间、任务、地点一次次不同，但他始终以高度的政治责任感，积极出主意，想办法，抓协调，促落实，心系军人、为军人及其家属排忧解难，合力纵推双拥工作，为国防事业添砖加瓦的情怀一直未变。

图1 小鼠全肺照射后20周内肺指数的变化 Fig.1 Lung index change after irradiation within 20 weeks

2.2 CpG-ODN对放射性肺纤维化形成的影响

小鼠被随机分为 3组：正常组(Normal)、照射对照组(IR control)和照射给药组(IR + CpG-ODN)。照射给药组小鼠先给予单次肺部照射至吸收剂量15 Gy后，分别在照后30 min、24 h和48 h连续3次通过腹腔注射给予0.2 mL CpG-ODN（浓度为250 μg/mL）；照射对照组小鼠在照射后给予同等剂量的PBS溶液；正常组小鼠不做任何特殊处理。根据实验计划，小鼠在照射后 20周内的指定时间点被处死，并检测相关实验指标（所有的实验过程均得到了原第二军医大学实验动物伦理委员会的认可）。

图2 CpG-ODN抑制放射性肺纤维化：(a) Masson染色；(b) Ashcroft肺纤维化评分结果；(c)纤维化面积比例 Fig.2 CpG-ODN prevents the development of irradiation-induced pulmonary fibrosis: (a) the area of collagen deposition in irradiated lung within 20 weeks after irradiation, observed by Masson’s trichrome staining at 400×magnification; (b) the degree of pulmonary fibrosis within 20 weeks was graded by criteria for an established scale. p=0.001 6 between IR control group and IR plus CpG-ODN group by Wilcoxon rank-sum (Mann-Whitney) test; (c) the area of collagen synthesis was quantification. All data are expressed as ±s of 3 independent experiments (n=6 mice/group). *p＜0.05 between IR control group and IR plus CpG-ODN group at the same time by Student’s t-test

2.3 CpG-ODN对促纤维化细胞因子 TGF-β1水平的影响

TGF-β1是一种与肺纤维化关系最为密切的细胞因子，为肺纤维化的标志之一[7]。如图3所示，照射对照组小鼠体内TGF-β1的表达水平在第2周开始上升，第8～10周上升速度明显增快，从第13周后维持在高水平，这与肺纤维化的形成过程基本一致。照射给药组TGF-β1的表达从第10周开始才逐渐升高，从第3周开始（第8周除外）各时间点TGF-β1的表达水平均显著低于照射对照组，第20周其表达水平仅为照射对照组的 1/2，这表明CpG-ODN能降低受照小鼠体内促纤维细胞因子TGF-β1 表达。

图3 CpG-ODN降低电离辐射后小鼠体内TGF-β1的水平 Fig.3 CpG-ODN reduces TGF-β1 secretion after irradiation The level of TGF-β1 was measured by ELISA assay within 20 weeks after irradiation. All data are expressed as±s of 3 independent experiments (n=6 mice/group). *p＜0.05 between IR control group and IR plus CpG-ODN group at the same time by Student’s t-test

2.4 CpG-ODN 对 TGF-β1/Smad依赖性纤维化信号通路的影响

脱颈法处死小鼠后，取出肺组织固定于 4%多聚甲醛溶液中过夜，然后脱水、包埋、切片，制作成石蜡切片，行 Masson染色。光镜下观察肺组织切片并采集图像，根据Ashcroft纤维化评分标准对肺纤维化程度进行评分[6]：0分为正常肺组织；1分为肺泡或细支气管出现很小的纤维化；2～3分为肺泡或细支气管出现中等程度的纤维化，但肺泡未损，肺组织结构正常；4～5分为纤维化程度增加，肺组织结构有一定程度的损伤，纤维化成条索状或团块状出现；6～7分为肺组织结构严重破坏，纤维化面积增加，出现‘蜂窝肺’；8分为肺组织完全纤维化。用Photoshop CS6软件对纤维化面积（Masson蓝染）进行测量，计算纤维化所占肺组织的比例。

图4 CpG-ODN抑制TGF-β1/Smad依赖性纤维化信号通路转导：(a)肺组织内TGF-β1、TβR、磷酸化Smad 2/3及Smad 7免疫组化染色；(b) TGF-β1免疫组化染色定量分析；(c) TβR免疫组化染色定量分析；(d)磷酸化Smad 2/3免疫组化染色定量分析；(e) Smad 7免疫组化染色定量分析 Fig.4 CpG-ODN inhibits the TGF-β1-Smad-dependent pathway after irradiation: (a) the expression of TGF-β1, TβR phosphor-Smad 2/3, and Smad 7 in irradiated lung tissue, analyzed by immunohistochemistry staining at 13 weeks after irradiation;(b) TGF-β1 quantification; (c) TβR quantification; (d) phosphor-Smad 2/3 quantification; (e) Smad 7 quantification. All data are expressed as ±s of 3 independent experiments (n=6 mice/group). *p＜0.05 between IR control group and IR plus CpG-ODN group at the same time by Student’s t-test

照射对照组小鼠肺组织内TGF-β1表达升高，TβR表达与TGF-β1的结果相似。Smad家族蛋白位于TGF-β1信号下游，电离辐射后磷酸化Smad 2/3水平上调，抑制蛋白Smad 7表达降低，这提示电离辐射能够激活 TGF-β1/Smad依赖性纤维化信号通路。而照射给药组小鼠肺组织TGF-β1、TβR、磷酸化Smad 2/3表达都降低，同时，肺纤维化区域出现了Smad 7的表达，这表明CpG-ODN能抑制电离辐射诱导的 TGF-β1/Smad依赖性纤维化信号通路活化。

3 讨论

近期，Xin[8]和 Luckhardt[9]等研究发现，CpGODN能减轻单侧尿路阻塞诱发的肾纤维化和γ疱疹病毒诱发的肺纤维化。而关于CpG-ODN对电离辐射诱发的肺纤维化防治作用的研究却罕有报道。在本实验中，首先，我们成功复制了原第二军医大学放射医学教研室所建立的放射性肺纤维化模型，为应用CpG-ODN进行性干预研究及评价疗效提供了完整的动物模型平台，即采用对纤维化反应较为敏感的C57BL/6雌性小鼠，给予其全肺单次照射至吸收剂量15 Gy，以确保照射区域出现肺纤维化病理改变，同时不会导致小鼠致死性损伤；其次，我们连续20周观察小鼠基本情况和肺组织的变化，对肺组织切片行Masson染色、Ashcroft纤维化评分和纤维化面积定量，以判断CpG-ODN是否具有缓解放射性肺纤维化的作用。试验结果显示照射后2周小鼠出现精神萎靡和进食进水量减少及活动不佳，照射给药组小鼠在4周后精神状态改善，一般状态优于照射对照组。肺组织大体解剖观察发现，照射后肺组织从第10周开始缩小，表面成灰白色，质地较硬，弹性下降，出现肺纤维化的表现，而照射给药组小鼠肺组织未见显著损伤改变，两组的肺指数变化差异明显。Masson染色显示出照射后20周内小鼠放射性肺纤维的病理演变过程，Ashcroft分级标准评分和纤维化面积定量分析表明CpG-ODN可以有效减轻放射性肺纤维化的形成。

目前，关于放射性肺纤维化形成的机理尚不完全明确，但大量基础实验和临床研究表明，细胞因子是放射性肺纤维化形成的关键因素，特别是TGF-β1被公认为是放射性肺纤维化形成和发展过程中最为重要的“开关”性细胞因子，同时也参与放射性肺纤维化形成的全过程。研究发现，小鼠肺组织受到电离辐射损伤前后，根据血浆中 TGF-β1含量的变化可以进行放射性肺纤维化预测，抑制或阻断TGF-β1的信号转导可以明显减轻放射性肺损伤的发生[7,10]，故TGF-β1也是防治放射性肺纤维的关键靶点。实验使用ELISA法检测小鼠全肺照射后20周内TGF-β1的变化水平，结果显示，从照射后第2周，TGF-β1表达水平开始上升，第8～14周，上升速度明显增快，之后维持在高水平。而照射给药组TGF-β1在照射后第10周才开始逐渐升高，大多数的检测时间点上，TGF-β1水平均显著低于照射对照组，这表明CpG-ODN抑制放射性肺纤维化的机制可能与降低受照小鼠体内TGF-β1的水平有关。Smad家族蛋白是TGF-β1的主要且特异的下游信号通路，被称为TGF-β1/Smad依赖性纤维化信号通路[11]。当TβR被TGF-β1激活后，TβR到核内的信号转导由Smad蛋白家族中的胞浆蛋白磷酸化来实现。Smad蛋白既是TGF-β1的胞内激酶底物，也是将TGF-β1信号从胞浆转导到胞核的中介分子，按功能可分为3类：一类是激活TGF-β1信号转导通路的Smad蛋白，包括Smad 2、3、5和8，其中起主要作用的是磷酸化 Smad 2/3；第二类是抑制TGF-β1信号转导的 Smad蛋白，包括 Smad 6和Smad 7，其中Smad 7的抑制作用最强；第三类是通用性Smad（如Smad 4），具有协同激活特异性Smad蛋白的作用。通常认为TGF-β1、TβR、磷酸化Smad 2/3和Smad 7在TGF-β1/Smad依赖性纤维化信号通路中起关键调节作用[12-13]。免疫组化法检测照射后第13周（此时间点纤维化形成最快且体内TGF-β1水平最高）这些分子的表达情况，结果显示，照射后小鼠肺组织内TGF-β1和TβR的表达升高，磷酸化Smad 2/3水平上调，抑制蛋白Smad7表达降低，而照射给药组小鼠肺组织内 TGF-β1、TβR和磷酸化Smad 2/3的表达降低，肺纤维化区域内出现了Smad 7的表达，这表明CpG-ODN能抑制电离辐射诱导的 TGF-β1/Smad依赖性纤维化信号通路活化。

综上所述，我们认为CpG-ODN能有效减轻放射性肺纤维化的形成，其主要原因是通过降低促纤维化细胞因子TGF-β1水平来抑制TGF-β1/Smad依赖性纤维化信号转导通路。

4 结论

本研究成功建立了放射性肺纤维化模型，通过连续20周观察和评估发现，CpG-ODN可以有效减轻放射性肺纤维化的形成，主要原因可能是CpG-ODN通过降低促纤维化细胞因子 TGF-β1水平来抑制 TGF-β1/Smad依赖性纤维化信号转导通路。但抑制放射性肺纤维化形式的机理十分复杂，其最核心的作用目前还不清楚，尚需进一步研究。

An LED light source was used to study settlement of a white ceramic substrate. Specifically, a light with a highly concentrated wavelength and brightness was selected to mitigate the influences that the wavelength and luminance of the chip exercised on the color coordinates of the white LED.

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