哺乳动物的肌肉组织大约占该动物机体组织的50%，它不但是主要的运动器官，而且是家养动物重要的经济性状[1]。肌球蛋白在肌肉的生长发育、运动收缩过程起重要作用。肌原纤维由粗丝和细丝组成，其中肌纤维粗丝的主要成分为肌球蛋白，在不同物种中肌球蛋白的基本结构是一致的，都是由两条肌球蛋白重链和四条肌球蛋白轻链构成[2-4]。其中肌球蛋白轻链作为结构和调节蛋白在肌纤维发生分化、肌肉运动和代谢等过程中发挥重要生理功能。肌球蛋白重链是骨骼肌收缩蛋白的重要组成成分，其主要功能是参与肌肉收缩功能[5-6]。雷蒙特等揭示了它的三维结构，发现在肌球蛋白的头部含有肌动蛋白和核苷酸的结合位点，具有三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)酶活性，通过ATP水解，将化学能转化为机械能，产生肌肉收缩[2,7]。

肌球蛋白10(Myosin-10)基因也称为MYH10，为肌球蛋白超家族中的一员，是一种在脊椎动物中表达的非传统肌球蛋白，它参与细胞增殖、黏附、迁移及吞噬等运动行为，是通过与微丝、微管相互作用来调控的[8-11]。MYH10存在于肌细胞，具有收缩功能，在非肌细胞中的功能也与肌球蛋白有关[12]。

2017年，根据《中共江苏省委江苏省人民政府关于印发〈江苏省特色田园乡村建设行动计划〉的通知》要求，镇江市先后有两批共5个村入选省特色乡村建设试点，分别丹徒区世业镇世业村还青洲、世业村永茂圩、先锋村一组、句容市天王镇唐陵村东三棚、茅山风景区管委会李塔村陈庄。

语句2～5根据当前的信念状态初始化γ1(s)和ξ1(s)，语句6～11递推计算在t时刻到达状态s最大可能路径的概率以及概率最大路径的前驱，语句12获取最大可能路径的终点，语句13～15回溯获取最大可能执行路径，语句16返回系统最大可能执行路径.从算法2中可以看出语句8执行次数最多，最大执行次数是:T ×|S′|2，因此，算法2的时间复杂度为O (T ×|S′|2).算法2生成的反例长度取决于输入观测序列长度T.

220kV阳平站110kV阳石甲线A相发生单相接地故障，线路保护拒动，随后，220kV阳平站110kV母联、#1主变三侧相继跳闸，110kV石山站#2主变跳闸，事故造成220kV阳平站110kVⅠ母失压，110kV石山站Ⅰ母失压。

新山西黑猪是在原山西黑猪(血源为马身猪、内江猪和巴克夏猪)与杜洛克猪进行杂交选育而成的品种，具有产仔数高、肉品质好、抗逆性强等优点[13]。本研究将山西黑猪和大白猪作为对照的动物模型，选择25日龄、70日龄和150日龄三个不同生长阶段，采用实时定量PCR技术对MYH10基因在两个品种中的时序性表达变化趋势以及表达差异进行分析，为研究猪肌肉发育的分子机理提供理论参考。

1 试验材料与方法

1.1 试验样本采集

本试验以18S rRNA为内参基因，内参基因和目的基因扩增曲线拐点清楚，基线平直，曲线良好。试验样本的扩增溶解曲线见图1。18S和MYH10基因的扩增产物的Tm值都为单峰值，表明扩增过程中没有二聚体生成，扩增效果较好。

1.2 试剂与耗材

参考NCBI数据库中猪MYH10的序列信息，以18S为内参基因，选用Primer Premier 5.0结合Oligo 6.0软件进行引物设计，引物序列信息见表1。引物委托上海生物工程有限公司合成。

1.3 总RNA的提取与cDNA第一条链的合成

总RNA的提取按照Trizol(Invitrogen)试剂手册进行操作，取2 μL提取的RNA于ND1000核酸蛋白测定仪测定纯度及浓度，要求OD260/280值在1.9～2.1之间。反转录按照gDNA Eraser反转录(TaKaRa)说明书进行。

1.4 引物设计与合成

Trizol为美国Invitrogen公司产品；PrimeScriptTMRT Reagent kit with gDNA Eraser、SYBR®PrimeScriptTMRT-PCR Kit 购 买于大连宝生物工程有限公司；乙醇、异丙醇等常规生化试剂均为分析纯。

 

1.5 实时荧光定量PCR反应体系及反应条件优化

根 据 SYBR®PrimeScriptTM RT-PCR Kit 试剂盒说明书建议的反应条件，以反转录合成的第一链cDNA进行常规梯度PCR扩增，分别筛选内标基因和目的基因引物的最佳退火温度、cDNA模板浓度，确定引物退火温度后，进行Realtime PCR检测相应引物扩增熔解曲线、目的基因和内标基因的扩增效率。

1.6 标准曲线的制作

借助MXPro-MX3000P软件(Stratagene公司)分析导出内标基因和目的基因标准曲线方程、扩增效率R2以及直线方程系数，并分析各基因之间的扩增效率。用优化确定的反应体系及反应条件进行目的基因的相对定量分析。

由反转录合成的第一链cDNA为模板，5倍稀释5个浓度梯度，根据筛选优化结果，进行Real-time PCR反应，建立标准曲线。

1.7 数据处理

用核酸蛋白测定仪测定各样本RNA的浓度及纯度，根据所测结果计算反转录时所需的RNA量。经过检测，所有样本RNA的OD260/280值都在1.9～2.1之间，浓度在311 ng/μL～3 183 ng/μL。质量良好，可以进行后续试验。

2 结果与分析

2.1 RNA样本浓度与纯度的检测结果

Real-time PCR结果应用MXPro-MX3000P软件(Stratagene公司)导出。采用-△△Ct方法获得目的基因的相对表达量。用SPSS 22.0软件对同一品种不同时间点或不同组织进行单因素方差分析，并用邓肯氏法进行多重比较；用独立样本t检验分析两个品种间同一基因的表达差异。采用GraphPad Prism 5进行图表的绘制与输出。

2.2 实时荧光定量PCR扩增动力学曲线

本试验的试验动物为大白猪和山西黑猪，饲养于山西省乡宁县永新康生态养殖有限公司，同期组建试验猪群，饲养管理条件相同。在两个品种仔猪的25 d、70 d和150 d分别屠宰3头，共18头，屠宰后取背最长肌、腰大肌、股二头肌等组织，用焦碳酸二乙酯水洗去表面血液，立即投入液氮，后在-80 ℃冰箱保存备用。

图2是MYH10基因在大白猪和山西黑猪三个时间点的表达趋势检测结果。以25日龄大白猪腰大肌中MYH10的表达值作为对照。图2-A是背最长肌中的表达检测结果。从结果可知，MYH10基因在两个品种中都具有先降低后升高的表达趋势。MYH10基因在25 d和150 d表达量极显著高于70 d的表达量(P＜0.01)。在三个采样点对两个品种间的表达量进行比较发现，25 d和70 d大白猪的表达量极显著高于山西黑猪(P＜0.01)，而150 d时大白猪和山西黑猪的背最长肌中的表达量无显著差异(P＞0.05)。

 

2.3 不同时期MYH10 mRNA的表达检测结果

“他们会来到这里，在我们的世界工作，不过要进行意识转移。因为人类身体适应不了这个星球，必须转移到特制的身体里。”

采用Excel2010制表；Shannon-Weiner多样性指数计算参考柯春亮的方法[32]。用SPSS 19.0进行统计分析，用平均值和标准误表示测定结果，分别对不同菌株D/d值进行单因素方差分析，并用Duncan法对数据进行多重比较。

MYH10基因在腰大肌中的表达检测结果见图2-B。经分析发现，大白猪和山西黑猪腰大肌中MYH10基因在前期表达较高，随着日龄的不断增加，表达量出现极显著的下降(P＜0.01)。大白猪中，25 d腰大肌MYH10的表达水平极显著高于70 d和150 d，而70 d和150 d的表达量差异不显著(P＞0.05)。在山西黑猪中，25 d和70 d腰大肌中MYH10的表达量不存在差异，但极显著高于150 d的表达量。

2．移植瘤组织凋亡相关分子的mRNA表达：MET组、GEM组以及MET+GEM组Bcl-xl、Survivin mRNA表达较对照组明显下调，而Bax、caspase3 mRNA的表达较对照组明显升高(P<0.05)，MET+GEM组较单药组的这一作用更为显著，差异均有统计学意义(P值均<0.05，表2、图2)。

与背最长肌和腰大肌相比，股二头肌中MYH10的表达并没有发生显著的时序性变化，结果见图2-C。25 d和150 d大白猪和山西黑猪MYH10表达差异显著(P＜0.05)，而70 d的大白猪和山西黑猪表达无显著差异(P＞0.05)。

两个品种不同组织间的表达结果相类似，在发育前期(25 d)MYH10在腰大肌中表达极显著高于背最长肌和股二头肌(P＜0.01)，而在发育后期背最长肌和股二头肌中的表达量逐渐升高，150 d时极显著高于腰大肌中的表达量(图3)。

3 讨论

仔猪出生至断奶一段时间内，运动量比较小，肌肉主要由Ⅰ型肌纤维组成，随后逐渐被Ⅱ型肌纤维取代，其中随着日龄的增加，Ⅰ型肌纤维显著下降，Ⅱb型肌纤维显著升高，Ⅱa和Ⅱx型肌纤维先降低再升高[14-15]。胡帅帅等[16]研究得出在家兔中MYH6基因与肌纤维发育相关。在本次试验中两个品种的背最长肌和腰大肌中MYH10基因在断奶时(25日龄)的表达量高于在其他日龄时的表达量，而后随着生长发育，表达量逐渐降低，在保育期结束时(70日龄)降到最低水平，而后背最长肌表达量逐渐升高，但腰大肌的表达量仍然保持在低水平，可能是由于这三种肌肉的肌纤维类型发育不同造成的，说明MYH10在肌纤维发育与分化过程中具有重要的调节作用。

  

图2 大白猪山西黑猪MYH10基因时序性表达检测结果

 

注：图Ⅰ检测样本为背最长肌，图Ⅱ为腰大肌，图Ⅲ为股二头肌同一组织不同日龄间，AB无相同字母表示差异极显著(P＜0.01)，abc无相同字母表示差异显著(P＜0.05)同一日龄不同品种间，**表示差异极显著(P＜0.01)，*表示差异显著(P＜0.05)

 

4 结论

通过对大白猪和山西黑猪不同日龄不同组织中MYH10基因mRNA发育性表达的检测，MYH10对不同肌肉中肌纤维的类型存在重要的调节作用，本研究结果可为深入研究肌纤维的发育提供理论参考。□□