伴随世界性的城市工业化和现代化,全球慢性患病率正呈快速上升趋势,慢性病患者数量日益增多,对全球范围人群的健康产生巨大影响。单以慢性病中最常见的糖尿病为例,根据2015年国际糖尿病联盟(IDF)年鉴报告(参考文献:2015 IDF DIABETES ATLAS),全球糖尿病人群已高达4.15亿,预计到2040年,全球糖尿病人群将达到6.42亿[1]。糖尿病的主要危害是长期高血糖引起的慢性并发症,包括动脉粥样硬化性心血管病变、糖尿病肾病、足病、眼病等,导致糖尿病患者致死致残[2]。糖尿病人群患有超重或肥胖、高血压、血脂异常、高尿酸血症等心血管危险因素的显著比例高于普通人群。实际上糖尿病患者发生心血管病变有多重危险因素,依次为低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)升高、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低、糖化血红蛋白(HbA1c)升高、高血压和吸烟等。研究结果显示[3]:不患有血脂异常及高血压的单纯糖尿病患者之比例不足三分之一,三分之二以上的糖尿病患者都至少患有高血压及血脂异常中的一种。如可联合血糖、血脂、尿酸、血酮等快速检测指标,对于患者早期发现代谢异常、及时干预并监测代谢指标非常重要。而多种指标快速联合检测的技术为临床实验室进入基层社区医院、甚至实现家庭化的现场和床旁检验创造了条件,同时为通过互联网进行大数据医疗诊断提供了技术手段,使得包括检查检验在内的医疗资源高度融合与信息共享,也为慢病实现三级诊疗、促进不同级别和类别医疗机构间的有序转诊打下基础。

图1 毛细作用驱动的微流控通道技术原理

便携型体外诊断产品的发展经历了第1代定性检测(试条试纸)[4-5];第2代半定量(色板卡比色或半定量仪器阅读)[6-7];第3代全定量系统(较少的手工操作)[8];第4代产品往自动化、智能化、网络化、多参数、高精度、快速、微量样本等方向发展。第一、二代的便携型体外诊断产品常用于非专业的家庭、个人健康保健,而第3代、第4代产品,将用于医院门急诊、社区医疗的定量检测。早期的便携型体外诊断产品发展始于20世纪中期,主要是以干化学试纸检测血糖及尿糖。此后免疫层析和斑点金免疫渗滤等免疫测定技术推动了感染性疾病、心脏标志物等便携型体外诊断产品技术发展。基于微流控技术的生物传感器的出现对便携型体外诊断产品是一个重大转折,后续体外诊断产品小型化、多参数、高精度发展将进入快车道,可解决人们对质量问题的困忧,且可实现测试耗用样本微量化以及多参数同步检测等临床需求。

由于生物反应的特点,多种因素会影响产品的精度,包括生物敏感试剂的选择,电极敏感材料的选择、原物料性能的波动、生产过程的控制、生产环境的变化、样本内外源物质的干扰、操作影响因素等,例如:血样的红细胞压积(Hematocrit)影响着血液的粘度和流量及其运输氧气的能力、血样的扩散速度、物质在细胞间的扩散速度等等,以及一些内外源物质的干扰,显著影响测试结果的准确度[9];另外,不同的电极材料和不同的生物敏感试剂的匹配度直接影响产品的灵敏度、线性、稳定性,这也是直接制约开发多参数POCT的技术障碍之一[10];还有,原物料的选择和控制、生产工艺的搭建和控制,是保证生产质量稳定、产品精度良好的关键。因此,当前国产体外诊断即时检测产品测试精度偏低、测试项目单一、性能不稳定是制约国内体外诊断即时检测产业发展的关键因素。本论文基于毛细驱动的微流控和微纳传感技术,结合电分析化学、光化学、生物传感器技术,开发了一种高精度、多参数的POCT集成系统,从而能够用于慢性病生化指标的多参数联合检测。

1 原理和方法

1.1 毛细作用驱动的微流控通道技术原理和结构设计

微流控(Microfluidics)指的是使用微管道(尺寸为数十到数百微米)处理或操纵微小流体(体积为纳升到皮升)的系统所涉及的科学和技术,是一门涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程的新兴交叉学科。因为具有微型化、集成化等特征,微流控装置通常被称为微流控芯片,也被称为芯片实验室(Lab on a Chip)和微全分析系统(Micro-Total Analytical System)。为了进一步提高测量精密度和一致性,我们采取电化学原理的生物传感器设计基于毛细作用驱动的微流控通道加工技术,通过对亲水材料电极的选择、通道的精密微加工、以及运用微流控模型理论推算的孔道设计,保证产品进样、生产加工和测试的稳定性,保证产品的准确可靠。其毛细作用驱动的微流控通道技术原理如图1所示。

工程量清单计价是指投标人完成由招标人提供的工程量清单所需的全部费用。这种方法能够使得基础电力工程更加的合理科学，提升其自身的发展空间。而且工程量清单计价能够使建筑单位进行自主报价，更有利于电力单位在招标过程中进行规范化的管理。而且它能够使得招标工作更加透明化，维持电力基础工程的正常进行，最大限度避免违法乱纪行为的发生。电力单位也可以根据建筑单位提供的工程量清单计价进行合适的造价规划，真正的实行自主控制。工程量清单报价增加了报价的可靠性，有利于工程款的拨付和工程造价的最终确定。

B,A称为框架μ的框架上下界。如若只有右侧不等式成立,则称μ为Bessel测度。若A=B, 则μ称为Rd上的紧测度框架; 若A=B=1,则μ称为Rd上的Parseval测度框架。

图2 集成有试样预处理装置和探测单元的测试芯片结构示意图

测试时,样本自试样引入微通道引入测试芯片后,首先通过上游红细胞压积探测单元,把试样的Hct数据传递到仪器中,然后流经试样预处理单元,消除干扰物质的干扰后继续流入下游试样反应区,经过一系列酶促反应及电极反应后转化为电信号,该信号被检测电极检测,仪器对得到的多个信号进行一系列的计算校正后最终得出准确的测试值,整个过程仅需2 min～3 min,达到快速检测的目的。

1.2 生物敏感试剂反应原理和多聚物3D骨架酶固定化和分子交互结晶成型技术

本论文采用电化学检测方法对疾病指标进行检测。各指标的检测反应原理如图3所示。

由于沼气产生过程复杂及影响因素较多，精确计算出沼气的产生速率和产量比较困难。目前预测沼气产气量的主要方法包括：经验估算法、Scholl Canyon模型、Monad模型以及由美国环保总署提出的垃圾沼气排放模型等［1-2］。根据已完成的可行性研究报告，已填埋的垃圾量、垃圾主要组成、填埋工艺等情况基本符合Scholl Canyon模型的要求，同时根据CJJ 133—2009生活垃圾填埋场填埋气体收集处理及利用工程技术规范［3］，可以按此模型预测沼气的产量，模型算法如下。

“手炉你们一定不陌生。在近几年热播的清宫剧里，娘娘们一到冬天都喜欢抱着一个精致玲珑的小物什，那就是手炉。”彤彤解释道，手炉就像当今冬天热销的暖手宝，又称“袖炉”“捧炉”，由炉身、炉底、炉盖、提梁组成。炉身中放入火炭或有余热的灶灰，再用盖子或罩子捂紧。手炉多用铜制，形状也多种多样，如圆形、方形、南瓜形。手炉既可以揣在手上，也可以塞进宽袖大袍，用起来十分便捷。

图3 各种试剂反应原理

图4 多聚物3D骨架结构

图5 结晶形态

2.3 多参数体外快速诊断系统POCT设计

下位机软件程序集成在单片机 MSP430 Flash存储器中,主要完成的功能为:接收上位机发送的命令与参数指令,完成相应的操作,并将数据发送给上位机。其算法实现流程图如图7所示。

因为溶出电流微弱(通常在nA～μA级别),在进行检测电路总体设计时,需要保证高增益、低噪声和低失真特性;此外,由电极/溶液构成的电化学体系等效电路相对比较复杂,在保证检测电路具有高增益、低失真的同时,还应保证足够的相位裕度,避免电路不稳定甚至自激现象的发生。图6是硬件系统的整体结构图。如图,硬件系统主要分为电化学检测电路、电源模块和无线模块三部分。

图6 仪器的硬件系统整体结构图

在三电极检测过程中,参比电极与工作电极信号微弱,需要避免引入外部噪声。传统电路中多采用无源屏蔽方法,即引入同轴电缆或其他类似结构,以中心导线作为参比电极、工作电极信号走线,屏蔽层接地避免外部干扰。但是,因为信号线与屏蔽线之间不可避免存在较大的分布电容,电容充放电的过程会影响信号波形,增大检测误差。因此,为避免无源屏蔽引发的问题,设计中对参比电极和工作电极引入了有源屏蔽。有源屏蔽电路包含两个环节,即对参比电极的有源屏蔽,及对工作电极的有源屏蔽。为保证低噪声特性,屏蔽不仅包括由电路SMA同轴接口引出的电极连线,还包括 PCB 内部的关键走线,且PCB内部走线以短路环的形式提供保护。

在电化学和光化学技术基础上,融合微流控技术,采用复杂的算法校正,如空白值校正和相同测试环境下的标准曲线校正,可以有效降低内外源物质,血液中红细胞,温湿度等系列干扰,从而使产品测试精度获得极大的提升。以血糖检测为例,血样的红细胞压积(Hct)影响着血液的粘度和流量及其运输氧气的能力、血样的扩散速度、物质在细胞间的扩散速度等等,以及一些干扰物质的干扰,显著影响测试结果。本文利用微流控技术,在芯片上集成了微通道,试样预处理、反应及检测等装置,同时结合多电极技术,成功消除了一些常见干扰物的干扰和红细胞压积的影响,解决POCT产品在临床应用中的问题,最少仅需0.5 μL样本量即可完成测试。

抗坏血酸在人体中广泛存在,达到一定浓度会对血糖测试产生极大的干扰,本文采用了在测试芯片上集成了试样预处理装置,干扰从40%降低到了5%的可接受范围,如图8(a)所示。

通常血糖检测范围为0.6 mmol/L～33.3 mmol/L,总胆固醇的检测范围2.6 mmol/L～11.7 mmol/L,尿酸的检测范围为181 μmol/L～1181 μmol/L,血酮(β-羟丁酸)的检测范围为0～8.0 mmol/L,4个指标的检测浓度范围差别非常大,反应的灵敏度要求差异大,对检测仪器不同量程的检测精度要求高;另一方面,如总胆固醇,需要多酶级联反应,反应弱而且慢,灵敏度低,如血酮,其酶促反应和电化学反应很难匹配,反应信号差,灵敏度低,而尿酸,因其浓度低,对灵敏度要求高。

图7 多参数体外快速诊断系统的电化学算法实现流程图

DPSV 算法主要涉及以下参数:富集电压与富集时间、静息电压与静息时间、扫描初始电压、扫描终止电压、扫描步进电压、采样周期、采样宽度、脉冲周期与脉冲幅度等。DPSV 算法中,在一个脉冲周期内,检测系统进行两次电流采样,即分别在前采样点采集得到电流数据I1,在后采样点得到电流数据I2,并求得两者电流之差;通过上述过程,能有效地消除充放电电流对于检测的影响。DPSV算法以10 ms为单位时间,并将程序的一次执行过程嵌入10 ms延时时序,能够有效减少程序的运行时间,并保证算法生成波形的周期误差控制在±0.2%以内,满足检测需要。

本文利用利用分子平衡抑制作用、高分子多聚物网架与酶的固定化技术、分子组合结晶成型的技术,开发传感器生物敏感试剂,成功解决了试剂的热稳定性、反应适配性、试剂溶液均一性、试剂固定生产一致性和可控性、干燥后固定试剂均一性等问题,保证传感器的一致性,同时使反应灵敏度和重复精度大幅提高,如图9所示。图9(a)中曲线表示改进前FAD型葡萄糖脱氢酶试剂的线性测试反应曲线图:反应信号很弱,不同浓度样本的反应曲线梯度不能很好的分开。图9(b)中曲线表示改进后FAD型葡萄糖脱氢酶试剂的线性测试反应曲线图:反应信号强,不同浓度样本的反应曲线梯度很好的分开,同一浓度反应曲线的一致性好。

利用一些多聚物特有的3D骨架结构(如图4(a)和图4(b)的多聚物纤维结构),把反应酶固定到其骨架结构上,其较大的表面积可以提高酶的反应效率、储存稳定性;3D骨架结构能允许反应分子的自由扩散,但其微孔结构又能有效把红细胞等可能干扰反应的大颗粒排除在外,减少干扰提高检测的准确度。分子交互结晶成型是指两种不同的晶体彼此之间以一定的结晶学取向关系交互连生,或一种晶体嵌生于另一种晶体中的现象。利用分子间的相互作用,图5(b)是利用分子交互结晶成型技术的结晶形态比图5(a)中常规试剂的结晶更加均匀,使产品一致性更好,测试精度更高。

3 实验结果与讨论

在电化学技术基础上,融合微流控技术,采用复杂的算法校正,可以有效降低内外源物质,血液中红细胞,温湿度等系列干扰,从而使产品测试精度获得极大的提升。以血糖检测为例,血样的红细胞压积(Hct)影响着血液的粘度和流量及其运输氧气的能力、血样的扩散速度、物质在细胞间的扩散速度等等,以及一些干扰物质的干扰,显著影响测试结果。本文利用微流控技术,在芯片上集成了微通道,试样预处理、反应及检测等装置,同时结合多电极技术,成功消除了一些常见干扰物的干扰和红细胞压积的影响,使得产品的测试精准度极大地提升。同时由于采用微流控技术,试剂设计精巧,在集成上述诸多功能的基础上,最少仅需0.5 μL样本量即可完成测试。

图8 各因素对血糖测试结果的影响对比

为进一步降低噪声,电化学检测电路使用四层FR4材质基底PCB设计,并以PCB第1层为关键走线布线层,第2层为地层,为微弱信号提供完整的地平面;并以第3层为电源层,第4层为辅助布线层,通过地层与电源层,将微弱信号与可能产生干扰的强信号进行隔离。电池组采用聚合物锂离子电芯组合,聚合物电芯具有内阻小,容量大,循环次数多,寿命长,无记忆效应防爆等优点;电池组带智能控制保护电路,能防止过充,过放,过流,短路。

进一步在测试芯片上集成了红细胞压积探测单元,显著降低了红细胞压积的影响,使得本测试芯片的应用人群范围可以覆盖到贫血及新生儿等特殊人群,其测试结果如图8(b)所示。

在分类算法方面,本文对比了GMM算法,支撑矢量机(SVM)和BP神经网络(ANN)算法。实验仍然采用K-交叉验证法,实验结果如图5所示。由图5可知,3种算法中,GMM算法的效果最佳,最差的神经网络算法。SVM算法本身对于多分类问题的效果不佳,而ANN算法对网络结构的要求较高,因此基于概率的GMM算法的有效性更好。

（4）共识方面：共识机制从单一向混合方式演进。导致区块链性能降低的重要因素之一是共识算法。PoW、PoS、股份授权证明（DPoS）和拜占庭容错等，各据优势，各有最适用的场景。为提升效率，需在安全性、可靠性、开放性等方面进行取舍，根据场景切换共识机制成了新趋势，并且将从单一的共识机制向多类混合的共识机制演进，运行过程中支持共识机制动态切换，或系统根据当前需要自动选择相符的共识机制。

图9 FAD型葡萄糖脱氢酶试剂改进前和改进后的反应曲线对比

血酮体(β-羟丁酸)试剂的开发:采用复合β-羟丁酸脱氢酶及新型电子介体技术,使反应灵敏度和重复精度大幅提高,测试时间大幅缩短,如图10所示。图10(a)中曲线表示改进前β-羟丁酸试剂的线性测试反应曲线图:反应信号较弱,不同浓度样本的反应曲线梯度分开不显著,同一浓度反应曲线的一致性不佳。图10(b)中曲线表示改进后β-羟丁酸试剂的线性测试反应曲线图:反应信号强,不同浓度样本的反应曲线梯度很好的分开,同浓度反应曲线的一致性好。

实验结果表明,我们设计的基于微纳传感结合微流控的高精度、多参数体外快速诊断POCT系统,在检测血糖、血酮、等方面具有良好的一致性和实用性,同时具有良好的抗干扰性能。

图10 血酮体(β-羟丁酸)试剂改进前和改进后的反应曲线对比

4 结论

本文主要介绍了基于微流控及微纳传感技术的高精度、多参数体外快速诊断系统。利用高分子多聚物3D骨架酶固定化技术以及分子交互结晶成型的技术,成功解决了试剂溶液均一性、试剂固定生产一致性和可控性、干燥后固定试剂均一性等问题,保证产品优良的一致性;通过微纳材料技术的应用,成功提高了试剂的灵敏度和检测限。应用基于血液特异的电阻抗谱分析以及基于扩散差异的动态电流技术对血样内源外源干扰物和存储操作环境等因素对测量结果的抗干扰处理。基于毛细作用驱动的微流控通道加工技术,通过对亲水材料电极的选择、通道的精密微加工、以及运用微流控模型理论推算的孔道设计,保证检测的准确可靠。在生物传感芯片上集成了微通道、试样预处理、反应及检测等装置,同时结合多电极参比技术、电阻抗谱分析技术、动态电流检测技术,采用多维度多参数联合的算法校正,成功降低消除了测试样品的内外源物质、红细胞压积、温湿度等系列干扰,有效克服了常规POCT产品在临床应用中的精度和灵敏度不够的问题。最后通过检测实验结果分析,验证了基于微流控及微纳传感技术的高精度、多参数体外快速诊断系统可以可靠和快速地对血酮、血糖等指标进行综合检测的功能。

根据正交试验结果可知,柠檬酸的添加量对饮料的口感影响最大,而果汁添加量和白砂糖的添加量对饮料口感的影响次之,各因素的影响程度依次为C>A>B,根据方差分析结果可知,柠檬酸的添加量对饮料的口感有显著性影响。因此得到黄刺玫果饮料制备工艺的最佳组合为A 2 B1 C2,即料液比1:8,白砂糖8%,柠檬酸0.2%。

参考文献:

[1] IDF I. IDF Diabetes Atlas Seventh Edition[J]. 2015.

[2] 熊真真. 2型糖尿病慢性并发症病人家庭负担及影响因素研究[J]. 成都:四川大学,2007.

[3] Huo X,Gao L,Guo L,et al. Risk of Non-Fatal Cardiovascular Diseases in Early-Onset Versus Late-Onset Type 2 Diabetes in China:A Cross-Sectional Study[J]. The Lancet Diabetes and Endocrinology,2016,4(2):115-124.

[4] 汪曣,白玉洁,张艳超,et al. 基于CCD的胶体金试纸条光电检测仪器设计及实验研究[J]. 传感技术学报,2008,21(8):1370-1373.

[5] 周焕英,高志贤,孙思明,等. 食品安全现场快速检测技术研究进展及应用[J]. 分析测试学报,2008,27(7):788-794.

[6] 谢莉,窦燕峰,郭会灿,等. 食品中过氧化氢残留快速检测试纸的研制[J]. 现代食品科技,2011,27(9):1160-1162.

[7] 夏孟丽,谢乐天,吴鑫宇,等. 基于微纳泡沫金属材料的D-半乳糖传感器研究[J]. 传感技术学报,2016,29(11):1643-1647.

[8] 邸红芹. 呼吸道病原体分子诊断技术研究进展[J]. 河北医科大学学报,2016,37(12):1520-1523.

[9] 王勇,卢福山. 青海马鸡血液指标和生化遗传标记的研究[J]. 青海大学学报(自然科学版),2004,22(6):11-15.

[10] 武宝利,张国梅,高春光,等. 生物传感器的应用研究进展[J]. 中国生物工程杂志,2004,24(7):65-69.