犬源大肠杆菌可以引起犬急性肠道炎,这是一种以发生败血症、腹泻为临床特征的急性传染病[1]。随着抗菌药物在犬上的广泛应用,以及抗菌药物的不合理使用、细菌耐药性的水平转移和垂直传播,犬大肠杆菌的多重耐药和交叉耐药现象也越来越普遍,造成了抗菌药物效果的不理想。喹诺酮类药物属于化学合成广谱抗菌药物,其作用机制主要是通过抑制细菌DNA的复制来杀灭细菌[2]。从第1种喹诺酮类药物——萘啶酸(nalidixic acid)[3]被发现至今,已经有4代喹诺酮类药物在临床上得到了应用。近年来,喹诺酮类药物在兽医临床上的使用非常普遍,细菌对喹诺酮类药物的耐药率也越来越高。1998年, qnr基因在肺炎克雷伯菌的质粒上被首次发现,这是第一个被发现由质粒介导的喹诺酮耐药基因(Plasmid-Mediated Quinolone Resistance Genes, PMQR),它可以降低受体菌对氟喹诺酮类药物的敏感性。由于新的变体被发现, qnr被重新命名为qnrA[4]。随后qnrB、qnrS、qnrC和qnrD一系列由质粒介导的喹诺酮耐药性基因被相继发现。qnr系列基因发挥耐药作用的机制是：通过表达Qnr蛋白,这些蛋白与药物的靶点结合,从而防止喹诺酮药物破坏细菌的DNA解旋酶。而oqxA和oqxB基因是通过介导细菌的外排作用而发挥耐药性[5]。

目前,国内外关于食品动物源大肠杆菌对喹诺酮类药物耐药性的研究较多[6-7],但犬源大肠杆菌对质粒介导的喹诺酮耐药基因oqxA、oqxB、qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS的研究却很少有报道,因此本试验对犬源大肠杆菌进行了PMQR基因检测及药物敏感性分析,旨在为临床治疗犬大肠杆菌感染提供重要依据和参考,也为深入研究喹诺酮耐药基因的传播提供基础资料。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　菌株　102株犬源大肠杆菌于2012～2014年分离自河南宠物交易市场和河南农业大学动物医院。采用直肠拭子的方法采集样品,然后无菌接种于LB肉汤,在麦康凯培养基上纯化培养,培养之后进行革兰氏染色和镜检。疑似株经VITEK-32全自动细菌鉴定系统鉴定，确认为大肠杆菌。大肠埃希菌ATCC25922和PCR阳性对照菌株皆由河南农业大学吴华博士提供。

DAS汽封与布莱登汽封同属硬齿汽封，仅就汽封齿形式而言，这两种汽封与传统梳齿汽封结构完全相同。这两种汽封都是通过结构改进，保护汽封齿运行中不被磨损。为达到同一个目地，采用不同的途径。使用情况显示DAS汽封经运行，保护齿将会在较短时间内磨至与其他梳齿一样高，保护齿作用将受影响。

1.1.2　试验药品　所用6种抗菌药物均为国产原料药,其中：喹乙醇(OLA),含量≥96%;痢菌净(MEQ),含量≥96%；氟苯尼考(FFC),含量≥98%;盐酸环丙沙星(CIP),含量≥96%;氧氟沙星(OFL),含量≥95%;恩诺沙星(ENR),含量≥98%。用电子天平精密称取各适量药物,其中OLA用无菌去离子水配制成终浓度为2560 μg/mL的原液,MEQ、FFC、CIP、OFL、ENR用无菌去离子水配制成终浓度为5120 μg/mL的母液；将配制好的原液或母液用水系针式过滤器过滤除菌,置于4 ℃冰箱中保存备用,各贮存原液或母液在7 d内用完。氟苯尼考用40%二甲基甲酰胺和60%乙醇助溶。

PMQR基因是质粒介导的耐药基因,可以造成耐药基因在细菌间的水平传播,会加快喹诺酮类药物耐药性在细菌间的传播,造成喹诺酮类药物在临床上抗菌效果的降低。本试验对102株犬源大肠杆菌的PMQR基因进行了检测,结果只有qnrS、oqxA、oqxB这3种基因被检测出。含有qnrS基因的菌株在一定程度上具有对萘啶酸和氟喹诺酮类药物的耐药性[15];含有oqxAB基因的菌株可以通过该基因外排泵的作用增强对氯霉素类抗菌药物、喹诺酮类抗菌药物、消毒剂和甲氧苄啶等的耐药性[13]。本试验qnrS、oqxA、oqxB基因的检出率低于国内报道的食品动物源大肠杆菌的检出率[16-18]，这可能与喹诺酮类药物在食品动物上应用更普遍、更频繁有关。在单一耐氟苯尼考的菌株中也发现了oqxA和oqxB耐药基因,这可能导致犬源大肠杆菌通过oqxA和oqxB基因的外排作用对氯霉素类药物产生耐药性。犬源大肠杆菌耐药基因与耐药表型的符合率要低于食品动物上大肠杆菌耐药基因型与耐药表型的符合率,原因可能是犬源大肠杆菌耐药基因的检出率显著低于食品动物源大肠杆菌,但犬源大肠杆菌对药物的耐药率并没有明显低于食品动物源大肠杆菌的耐药率。

第一次是1951年（另有说法是1953年），在楚雄中学教书的青年教师“黄笛扬、夏扬，利用学校假期，由姚安县学生做向导，深入到姚安县的马游山区，对流传在该山区的彝族民间说唱《梅葛》进行了收集整理，并刻印成油印本”（《中国曲艺志·云南卷》，后文简称《曲艺志》）。这是一次自发的整理，整理者是抗战后期在昆明受过文艺熏陶的诗人。其中负责文字工作的夏扬，受过常任侠收集整理的《蒙古调》影响，在到楚雄之前，在昭通工作期间还曾整理过《苗族古歌》。这次收集整理的梅葛有3000行左右，在1956年寄给了云南省文联主席徐嘉瑞。（《彝族文学史》）

1.2　方法

6种药物对102株犬源大肠杆菌的敏感率、中介率、耐药率见表2。结果(表2)表明：犬源大肠杆菌对3种喹诺酮类药物和氟苯尼考的耐药性都比较严重,尤其是对恩诺沙星的耐药率达到了71.57%,对环丙沙星和氧氟沙星的耐药率也分别达到了64.71%和48.04%,对氟苯尼考的耐药率达到了58.82%;而喹乙醇和痢菌净的抗菌效果比较好,犬源大肠杆菌对这2种药物的耐药率分别只有14.71%和0%。

PCR检测结果表明：在102株犬源大肠杆菌中, qnrS基因检测结果为阳性的有15株,检出阳性率为14.70%; oqxA基因检测结果为阳性的有10株,检出率为9.80%; oqxB基因检测结果为阳性的有12株,检出率为11.76%;其余基因未被检测出。其中含有两种耐药基因的有9株,检出率为8.82%;含有3种耐药基因的有5株,检出率为4.90%(见表3)。PCR检测结果见图1。

夫妻是一辈子的事情，贯穿始终的理财规划，当然也会有长达几十年的那一种，最常见的就是保险。一份保单的缴费期可能长达十余年甚至二十年，而它的保障期限则可能是直至生命终止，这些规划的起始点，基本都落在结婚的头3年之内。俗话说，千里之行，始于足下，这个头，怎能不好好开？

1.2.3　药物MIC值的测定　6种试验药物经微量肉汤法测定,耐药标准参考CLSI标准，采用美国实验室临床和实验室标准协会批准的MIC值测定方法进行测定。使用质控菌株ATCC 25922进行全程质控,并设阴、阳性对照,做两次平行试验。

 

表1　PCR所用引物序列

  

引物引物序列(5'→3')扩增产物大小/bp退火温度/℃参考文献qnrAF:ATTTCTCACGCCAGGATTTGR:GATCGGCAAAGGTTAGGTCA51657[8]qnrBF:GATCGTGAAAGCCAGAAAGGR:ACGATGCCTGGTAGTTGTCC46953[9]qnrCF:GGGTTGTACATTTATTGAATCR:TCCACTTTACGAGGTTCT44750[10]qnrDF:TTACGGGAATAGAGTTAR:AATCAGCCAAAGACCAAT46850[11]qnrSF:ACGACATTCGTCAACTGCAAR:TAAATTGGCACCCTGTAGGC41753[9]oqxAF:GATCAGTCAGTGGGATAGTTTR:TACTCGGCGTTAACTGATTA67051[12]oqxBF:TTCTCCCCCGGCGGGAAGTACR:CTCGGCCATTTTGGCGCGTA51265[13]qepAF:CCAGCTCGGCAACTTGATACR:ATGCTCGCCTTCCAGAAAA57060[14]

2　结果与分析

2.1　药敏试验结果

1.2.1　PCR模板的制备 　挑纯培养菌落,置入5 mL玻璃试管内,95 ℃水浴10 min,离心(17000×g)30 s。上清液即为基因检测的模板液,然后置于冰箱-20 ℃保存备用。

 

表2　6种抗菌药物对102株犬源大肠杆菌的药敏试验结果

  

药物敏感株数敏感率/%中介株数中介率/%耐药株数耐药率/%氧氟沙星(OFL)4443.1498.824948.04恩诺沙星(ENR)1716.671211.767371.57环丙沙星(CIP)2827.4587.846664.71氟苯尼考(FFC)3231.37109.386058.82痢菌净(MEQ)9593.1476.8600喹乙醇(OLA)7775.49109.801514.71

2.2　PMQR基因的检测情况

5月30日，妈妈进入了弥留之际，她始终都很清醒。知道美国专家就在病房外待命，她拉着我的手，贪婪地看着我，似乎要把我刻进脑子里。我强忍泪水，微笑着说：“妈妈，等你醒来，我们都很老了，你得照顾我们啊。”对于自己生病，妈妈一直很内疚，觉得拖累了我们，所以，她听了我的话非常高兴，一再说：“好啊好啊！”我痛哭失声：“我会好好生活的，就当你出了趟远差。”妈妈也泪流满面，她伸出胳膊：“我再抱抱我的兔兔，下一次要很久以后了。”半个小时后，妈妈微笑着闭上了双眼。随后，Alcor的工作人员开始介入，完成灌注手术后，妈妈被运往美国。

[8] Robicsek A, Strahii E J, Sahm D F, et al. qnr prevalence in cehazidime-resistant Enterobacteriaceae isolates from the United States [J]. Antimicrob Agents Chemother, 2006, 50(8): 2872-2874.

3　讨论

喹诺酮类抗生素在人医临床和兽医临床上曾以抗菌活性强、抗菌谱广以及很少产生交叉耐药性和毒副作用小等特点得到广泛应用。然而随着喹诺酮类药物在临床上的普遍使用,由细菌耐药性引起的抗菌药物治疗效果下降的问题也引起了人们的重视,越来越多的专家学者投入到细菌耐药性的研究中。本次药物敏感性试验发现,犬源大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药性已经很高,其中对恩诺沙星的耐药率达到了70%,对氧氟沙星的耐药率也达到了48%；而且犬源大肠杆菌的多重耐药现象也非常严重,在102株犬源大肠杆菌中,有71株对两种或两种以上的药物耐药,占69.6%。日益严重的多重耐药现象对犬细菌病的治疗带来了极大的威胁,需要通过规范、合理使用药物来控制细菌耐药性的上升。

 

表3　PMQR基因在犬源大肠杆菌中的分布

  

PMQR基因菌株数量(阳性率/%)PMQR基因菌株数量(阳性率/%)qnrA0oqxA10(9.80)qnrB0oqxB12(11.76)qnrC0qepA0qnrD02种耐药基因9(8.82)qnrS15(14.70)3种耐药基因5(4.90)

  

P：阳性对照； S：样品； N：阴性对照。图1　　qnrS、oqxA、oqxB基因的检测结果

1.1.3　试剂和仪器设备　LB肉汤、MHB营养肉汤、麦康凯琼脂均购自北京陆桥科技有限公司；2×Taq　Master Mix酶和DM2000 Maker均购自北京康为世纪生物有限公司;琼脂糖购自上海生工生物工程有限公司; VITEK-32型全自动微生物鉴定系统购自梅里埃公司; DYY-8C型电泳仪购自北京市六一仪器厂; PCR仪购自杭州晶格科技有限公司;凝胶成像分析系统购自DINCO公司。

本试验中虽然PMQR耐药基因的检出率较低,但是犬源大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药率很高，原因可能是PMQR基因本身只能介导低水平的对喹诺酮类药物的耐药性,但是PMQR基因的流行可以促进编码DNA促旋酶的gyrA和gyrB基因的突变和编码拓扑异构酶 IV的parC和parE基因的突变，从而引起高水平的耐药[19-20]。喹乙醇和痢菌净在犬细菌病上较少使用,但本试验发现有一定的检出率,表明oqxAB基因可能在不同来源菌株中水平传播,从而造成oqxAB基因在犬源大肠杆菌中的流行,提示应加强抗菌药物的合理使用和监管,以减少耐药性的传播和扩散。

参考文献:

[1] 王显峰.犬大肠杆菌病的诊治[J].中国畜牧兽医,2010,37(3):220.

为了使本文的结论更稳健，本文采用另外一种衡量企业现金持有水平的方法来进行稳健性检验。以现金及现金等价物之和除以年末资产总额的方法作为企业现金持有水平CASH的替代变量，然后采用模型（1）进行回归，回归结果如表5所示，表5中的回归结果与表4中的结果相一致。

[2 ] Bearden D T, Danziger L H. Mechanism of action of and resistance to quinolones [J]. Pharmacotherapy, 2001, 21(10Pt 21): 224S-232S.

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[4] Martinez L, Pascual A, Jacoby G A. Quinolone resistance from a transferable plasmid [J]. Lancet, 1998, 351(9105): 797-799.

1.2.4 免疫印迹法检测hTERT、p53和p21蛋白的表达 收获转染48 h细胞，比较各组细胞中hTERT、p53和p21蛋白表达。取100 μg蛋白质样品进行12.5%变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，加入hTERT多克隆抗体(1∶200)、兔抗人p53多克隆抗体(1∶200)、鼠抗人p21单克隆抗体(1∶200)，增强化学发光显色系统ECL显色，曝光，洗片。全自动凝胶成像分析系统ChemiImager5500分析各条带光密度值。

[5] Kim H B, Wang M, Park C H, et al. oqxAB encoding a multidrug efflux pump in human clinical isolates of Enterobacteriaceae [J]. Antimicrob Agents Chemother, 2009, 53(8): 3582-3584.

1.2.2　引物的设计和PCR扩增　参照表1中参考文献[8-14]中的引物序列,由上海生工生物工程有限公司合成qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、oqxA、oqxB、qepA基因的通用引物(见表1)。PCR体系为25 μL: Mix酶12.5 μL,上、下游引物各0.5 μL, DNA模板1.0 μL, ddH2O 10.7 μL。反应条件:94 ℃变性50 s,根据不同引物条件选择不同的退火温度,退火45 s,72 ℃延伸60 s,32个循环;72 ℃延伸10 min。对PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳跑胶,然后用琼脂糖凝胶电泳进行成像系统摄像。产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序,进行Blast比对,确定阳性。

心血管疾病作为一种循环系统疾病，具有发病率高、复发率高等特点，对患者生活质量和生命健康有巨大影响和威胁。心血管疾病与人体血压运送器官和组织有关，为提高心血管疾病治疗效果，文章对该类疾病临床治疗进行了研究，研究中发现对心血管疾病患者进行常规治疗的同时配合缬沙坦治疗效果明显，现报道如下。

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目前，跨境电商零售有广义和狭义之分。广义的跨境电商零售指外贸电子商务，即传统外贸企业利用各种电子商务平台开展信息发布、询价、下单、支付等交易活动，将交易活动由传统的线下转移到线上，然后再通过跨境物流把货物送达客户手中。狭义的跨境电商零售则是指跨境电子商务，即利用邮政小包等物流方式把商品送达消费者手中，其中消费者既不是批发商也不是外贸企业，而是终端的个人消费者。但由于在现实经济活动中个人消费者和小型的企业类商家没有明确的界限，因此消费者往往也包含一批小型的中小卖家。

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从图3可以得知，北斗区域系统各卫星时域码元波形表现出不同的特征，所有卫星都出现不同程度的振铃效应，GEO类卫星振荡幅度整体较小，IGSO和MEO类卫星振荡幅度较大，振荡幅度最大的是MEO-4卫星，其过冲幅度达到了20%.