棉花叶斑病在世界各大植棉区普遍发生，也是我国棉花上的1种常见病害，其中链格孢菌（Alternariaspp.）是引起叶斑病的1类重要病原。但各地报道引起叶斑病的链格孢菌种类存在较大差异。Sciumbato等[1]1972年报道印度棉花轮纹斑病是由Alternaria macrospora引起的。在美国密苏里州（Missouri）、路易斯安那州（Louisiana）以及以色列，该病也是由A.macrospora造成的；原苏联棉区发生的叶斑病主要由大孢链格孢（A.macrospora）和棉链格孢菌（A.gossypina）引起[2]；Palmateer等2000年和2001年调查美国亚拉巴马州（Alabama）陆地棉叶斑病，最常见的病原为A.alternata[3]。我国棉花轮纹斑病病原以大孢链格孢（A.macrocpora）、细极链格孢（A.tenuissima）和棉链格孢（A.gossypina）等为常见种，最常见的为大孢链格孢（A.macrospora）[4-5]。张文蔚等从北京、天津、新疆、山东、河北、河南、江苏等地采集17份叶斑病样品鉴定，16份为A.alternata，只有1份从天津棉田采集的为A.macrospora[6]。陈凯等鉴定河南省洛阳市、三门峡市、周口市和河南省农业科学院棉田（郑州市）发生的棉花叶斑病由A.tenuissima引起[7]。

新疆是我国最大的棉区，属典型的大陆性气候，春季常有明显的倒春寒，秋季降温快，是我国棉花叶斑病的常发区[8]，但对其病原尚未进行较为系统的调查和鉴定，为此开展了本研究。

1 材料与方法

1.1 病害调查、病样采集及症状描述

2016年在棉花苗期和中后期，棉花叶斑病分别在石河子和阿克苏植棉区大发生。为此于2016年和2017年，以北疆石河子和南疆阿克苏（主要种植陆地棉，也种植长绒棉）为主，分别对北疆石河子、昌吉、博乐、阿勒泰和南疆阿克苏、喀什、和田等7个地区30个地点的棉花叶斑病发生情况进行了调查，并采集典型症状的病样206份，供分离鉴定。同时对田间症状和接种后的症状进行现场观察和描述。

1.2 病原分离、纯化及代表性菌株的选择

采用常规组织分离法，即将所采病样经流水冲洗后，从病健交界处剪取4～5 mm2的组织块，用0.1%（质量分数）升汞消毒5～10 s，无菌水漂洗3次后，用无菌吸水纸吸干表面水分，置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基 （Potato dextrose agar medium，PDA）上，25℃恒温培养 2 d后，挑取菌落边缘菌丝进行纯化；并根据病样采集时间、地点、分离菌株的数量及菌落的培养特征，按南疆、北疆分苗期（5―6月份采样）和生长中后期（主要在8―9月份，个别在7月上旬采样），各选取10个代表性菌株（共40个代表性菌株），4℃保存在PDA上，供鉴定用。

1.3 病原致病性测定

采用离体叶片接种法。采集植株相同部位的健康叶片，清洗干净，用75%（体积分数）酒精轻轻擦拭叶片表面，消除杂菌，4℃处理24 h后供接种用。接种前用少量无菌水洗下在PDA上培养7 d的分生孢子，用血球计数板按常规方法配制每毫升1×107个分生孢子的悬浮液，采用喷雾法进行接种，重复3次，以无菌水为对照。接种结束后，将其置于12 cm×12 cm、垫有湿润无菌滤纸的发芽盒中，放入白天18℃、夜间12℃的智能光照培养箱中，定期观察并记录发病情况。发病后，观察其症状并进行分离和镜检，明确与原接种菌的异同。

1.4 病原鉴定

1.4.1 形态学鉴定。用刀片直接刮取病斑处的分生孢子，观察其形态、颜色并记录分生孢子的纵横膈膜数，测量50个分生孢子的大小。挑取纯化后的供试菌株在PDA上培养5 d，观察并描述菌落形态和颜色。采用常规玻片培养法，25℃下培养5 d，观察、记录其分生孢子的着生状态并拍照，作为病原鉴定的主要形态学依据，参照《中国真菌志》（第十六卷）链格孢属[9]对病原进行鉴定。

1.4.2 分子生物学鉴定。用灭菌刀片刮取在PDA上25℃培养7 d的各供试菌株的菌丝体。用BioFlux试剂盒提取供试菌株的基因组DNA。参照Kusaba等[10]和王洪凯等[11]报道，用真菌内转录间隔区（Internal transcribed spacer，ITS）通用引物[ITS1 （5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），由上海生物工程股份有限公司合成]进行聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR），反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性50 s，56℃退火40 s，72℃延伸1 min，共35个循环；最后72℃延伸10 min，反应体系为 25 μL；参照王泰云等[12]、杨超等[13]的报道，用组蛋白3基因扩增引物[H3-1a（5'-ACTAAGCAGACCGCCCGCAGG-3'）和H3-1b（5'-GCGGGCGAGCTGGATGTCCTT-3'），由上海生物工程股份有限公司合成]进行PCR，反应程序：96℃预变性 2 min；96℃变性 15 s，55℃退火30 s，75℃延伸 35 s，共 30个循环；最后 72℃延伸 2 min，反应体系为 25 μL。

2016年和2017年在南北疆植棉区调查发现，该病在新疆整个生长期虽然都可发生，但主要在棉花苗期和生长后期发生较重。不同时期、不同年份和不同地区间发病情况有较大差异。如2016年春季，北疆棉区由于持续低温多雨，棉花苗期叶斑病大发生，发病率高达100%，明显抑制幼苗生长和发育；8月下旬南疆阿克苏地区遭遇冰雹，之后叶斑病大发生，不少棉田棉花一片枯焦，严重影响产量。2017年由于苗期和生长后期气候比较正常，该病发生相对较轻。

通过构建系统进化树发现，分析rDNA-ITS区序列，可以将大孢子种A.macrospora与小孢子种中的A.alternata和A.tenuissima区分，但无法将小孢子种A.alternata和A.tenuissima区分（图 3）。

2 结果与分析

2.1 棉花叶斑病发病情况的调查和症状描述

2对引物的PCR扩增产物，分别用1%（质量分数）的琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像仪上观察并拍照。在ZF-90型多功能暗箱式紫外透射仪下切取目的片段，使用全式金凝胶回收试剂盒（Easy Pure Quick Gel Extraction Kit）回收目的片段。纯化后与pMD19-T载体连接，转入大肠杆菌DH5α。PCR检测筛选阳性克隆，送到上海生物工程有限公司测序。

收集安徽医科大学第一附属医院胃肠外科2012年1月—2015年2月收治的胃癌患者83例。患者年龄为（61.8±11.4）岁，男性54例，女性29例；按照美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第7版进行分期[7]：Ⅰ期11例，Ⅱ期24例，Ⅲ期42例，Ⅳ期6例。早期胃癌为肿瘤浸润深度局限于黏膜和黏膜下层，无论有无淋巴结转移；进展期胃癌指侵袭深度超过黏膜下层。

2.4.2 分子生物学鉴定。采用真菌通用引物ITS1/ITS4对病原基因组DNA进行扩增，11号和37～40号菌株扩增出582 bp的片段，剩余其他35个菌株扩增出 569 bp的片段 （图 2），经BLAST比对，11号和37～40号菌株序列与Gen-Bank中A.macrospora（登录号AY154689.1和DQ156342.1）同源性达99%。而其他菌株与A.al-ternata （登 录 号 KT384278.1、KY814634.1、KY788019.1和MG195995.1）的同源性达100%，与 A.tenuissima（登录号 KF280456.1、KY788031.1、KT384277.1和MG250391.1）的同源性也达100%，无法确定其归属。因此，结合病原形态学特征，确认11号和37～40号菌株为A.macrospora。

第3类包括11和37～40号，共5个菌株，其孢子形态和着生方式和前2类有明显区别。在PDA培养基上培养，菌落初期灰白色，后期中央略微隆起，灰褐色，绒毛状，基质褐色或深橄榄绿色。分生孢子梗单生或簇生，直或弯曲；分生孢子多单生或少数2个串生，具6～10个横膈，1～6个纵膈或斜膈，大小（49.8～110.6）μm×（15.0～40.3）μm；顶端有细长的喙，喙浅褐色至近无色，长度超过孢子的一半，大小（30.5～135.0）μm×（2.0～4.5）μm。 初步鉴定为 A.macrospora （图 1 C1、C2、C3）。

供试菌株接种后的症状和田间症状相同，主要在叶片产生斑点，极少产生典型的轮纹。

2.2 病原分离及代表性菌株的选择

从南疆、北疆所采集的206份典型叶斑病样中，成功分离出180个链格孢属（Alternariaspp.）菌株，分离率达87.4%。选取40个代表性菌株供病原鉴定。其中，1～20号为北疆病样（1～10为苗期，11～20为生长中后期），21～40为南疆病样（21～30为苗期，31～40为生长中后期）。具体情况见表1。

4.4.1 简化审批流程，减轻企业负担。参照《国家农业综合开发资金和项目管理办法》第三十条：省级农发机构根据本地区实际情况可以下放项目评审权限。为此，建议参照经营主体实施的其他农业项目管理模式，由区县农发办初审并公示无异议后报市农发办备案，市农发办按原要求审批实施计划，项目实施完成后由区县农发办组织初验，市农发办组织终验，验收合格后再补助资金或贴息，以减轻企经营主体编制可行性研究报告和规划设计、协调金融机构等项目前期费用，缩短建设周期。

2.3 病原致病性测定

室内接种5 d后，叶片开始出现黑褐色斑点，症状与自然病害症状相似，40个代表性菌株均会引起叶片发病，对照组棉花叶片则未出现症状。从发病组织中再次分离的菌株与原接种菌形态特征一致。根据柯赫氏法则，40个代表性菌株均具有致病性。

2.4 病原鉴定

2.4.1 形态学鉴定。经形态观察，初步可将供试菌株分为3类。第1类包括1～6、19和20号，共8个菌株，在PDA培养基上培养，初期菌落灰白色，后期中央略微隆起，褐色或深褐色，毛毡状，基质浅褐色至褐色。分生孢子梗单生或簇生，直立或弯曲；分生孢子单生或2～11个串生，具3～7个横膈，2～4个纵膈或斜膈，大小（12.5～35.0）μm×（5.0～12.5）μm，黄褐色或褐色，棒形、倒梨形；有喙或无喙，喙锥形或短柱状，（2.0～12.5）μm×（1.5～4.5）μm。 初步鉴定为 A.alternata（图1 A1、A2、A3）。

由此，根据病原菌形态学特征，结合分子生物学鉴定，确认7～10号、12～18号、21～30号和 31～36 号菌株为 A.tenuissima，1～6 号、19 号和20号菌株为A.alternata。

 

表1 菌株样品编号及来源Table 1 Number and source of strain samples

  

序号Number采样地点Origin棉花品种Cotton variety采样时间Collecting time 1 石河子地区121团2016-05 Field of Regiment No.121 in Shihezi新陆早45号Xinluzao No.45 2 石河子总场3连 Third Branch of Shihezi Zongchang创杂100T1 Chuangza 100T1 3 石河子总场9连2016-05 The Ninth Branch of Shihezi Zongchang创杂100T1 Chuangza 100T1 4 石河子地区148团2016-05 Field of Regiment No.148 in Shihezi硕丰9号Shuofeng No.9 5 石河子大学试验站2016-05 The experimental station of Shihezi University新陆早52号Xinluzao No.52 6 昌吉地区105团2016-05 Field of Regiment No.105 in Changji新陆早52号Xinluzao No.52 7 石河子地区123团2016-05 Field of Regiment No.123 in Shihezi新品系641 A new cotton line 641 8 石河子地区143团2016-05 Field of Regiment No.143 in Shihezi 8026 8026 9 石河子大学试验站2016-05 The experimental station of Shihezi University新陆早52号Xinluzao No.52 10新疆农垦科学院生物技术研究所Biotechnology Research Institute,Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences新陆早60号Xinluzao No.60 2016-07 11 博州地区81团Field of Regiment No.81 in Bortala Mongolia Autonomous新陆早45号Xinluzao No.45 2017-09 12 石河子地区147团Field of Regiment No.147 in Shihezi新陆早60号Xinluzao No.60 2017-09 13 石河子地区148团Field of Regiment No.148 in Shihezi硕丰9号Shuofeng No.9 2017-09 14 石河子地区149团Field of Regiment No.149 in Shihezi新陆早64号Xinluzao No.64 2017-09 15 石河子地区150团Field of Regiment No.150 in Shihezi新陆早64号Xinluzao No.64 2017-09 16 石河子地区150团Field of Regiment No.150 in Shihezi新陆早62号Xinluzao No.62 2017-09 17 石河子大学试验站The experimental station of Shihezi University新陆早52号Xinluzao No.52 2016-09 18 石河子大学试验站The experimental station of Shihezi University新陆早52号Xinluzao No.52 2017-09 19 石河子总场6分场The Sixth Branch of Shihezi Zongchang创杂100T1 Chuangza 100T1 2017-09 20 阿勒泰地区184团Field of Regiment No.184 in Aletai新陆早62号Xinluzao No.62 2017-09

 

表1（续）Table 1 (Continued)

  

序号Number采样时间Collecting time 21 新疆塔里木河种业股份有限公司1分场The First Branch of Xinjiang Tarim River Seed Industry Company采样地点Origin棉花品种Cotton variety新陆中37号Xinluzhong No.37 2017-05 22 新疆塔里木河种业股份有限公司试验地The test field of Xinjiang Tarim River Seed Industry Company新陆中37号Xinluzhong No.37 2017-05 23 新疆塔里木河种业股份有限公司2分场The Second Branch of Xinjiang Tarim River Seed Industry Company新海36号Xinhai No.36 2017-05 24 新疆塔里木河种业股份有限公司试验地The test field of Xinjiang Tarim River Seed Industry Company新海36号Xinhai No.36 2017-05 25 新疆塔里木河种业股份有限公司17号地The No.17 ground of Xinjiang Tarim River Seed Industry Company新陆中37号Xinluzhong No.37 2017-05 26 新疆塔里木河种业股份有限公司17号地The No.17 ground of Xinjiang Tarim River Seed Industry Company新陆中37号Xinluzhong No.37 2017-05 27 阿克苏地区12团试验田The experimental plot of field of Regiment No.12 in Akesu瑞杂816 Ruiza 816 2017-05 28 阿克苏地区12团试验田The experimental plot of field of Regiment No.12 in Akesu瑞杂816 Ruiza 816 2017-05 29 阿克苏地区12团Field of Regiment No.12 in Akesu硕杂1号Shuoza No.1 2017-05 30 阿克苏地区12团Field of Regiment No.12 in Akesu硕杂1号Shuoza No.1 2017-05 31 阿克苏地区6团Field of Regiment No.6 in Akesu石惠163 Shihui 163 2016-08 32 和田地区皮山农场12连The Group 12 of Pishan Farm in Hetian陆地棉品种G.hirsutumvariety 2016-08 33 喀什地区41团Field of Regiment No.41 in Kashi鑫科66号Xinke No.66 2016-09 34 喀什地区51团Field of Regiment No.51 in Kashi 419号No.419 2016-09 35 阿克苏地区阿拉尔农场The Ala'er Farm in Akesu荆杂88号Jingza No.88 2017-09 36 阿克苏地区10团试验田The experimental plot of field of Regiment No.10 in Akesu德龙0908 Delong 0908 2017-09 2016-08 37新疆塔里木河种业股份有限公司良繁二场The second Liangfan branch of Xinjiang Tarim River Seed Industry Company新海38号Xinhai No.38 38 阿瓦提县丰收3场Harvest Farm No.3 of Awati county新海37号Xinhai No.37 2016-08 39 阿克苏地区12团21连The Group 21 of Regiment No.12 in Akesu新海46号Xinhai No.46 2016-08 40 新疆塔里木河种业股份有限公司Xinjiang Tarim River Seed Industry Company新陆中37号Xinluzhong No.37 2017-09

  

图1 链格孢（A1、A2、A3）、细极链格孢（B1、B2、B3）和大孢链格孢（C1、C2、C3）菌落、分生孢子及着生方式Fig.1 Colonies,sub spore and the mode of production ofA.alternata(A1,A2,A3),A.tenuissima(B1,B2,B3)and A.macrospora (C1,C2,C3)

无论是陆地棉还是长绒棉，苗期子叶、真叶均可发病，发病初期子叶和真叶上均产生紫红色或褐色、中部稍凹陷的小型斑点，后逐渐扩大成外缘红褐色或褐色、圆形或不规则形、直径2～3 mm的病斑，严重时病斑彼此连接成片，形成大型的褐色枯死斑，导致叶片焦枯、脱落。生长后期发病的症状和苗期基本相同，均主要为害叶片产生叶斑，典型的轮纹很少，只有在条件非常有利发病的情况下才会出现。据在阿克苏地区调查，该病在长绒棉上发生一般重于陆地棉，在长绒棉上不仅感染叶片，还感染苞叶，并在茎秆上产生细长的梭状条斑。

AR是Augmented Reality的简称,即增强现实，是将计算机生成的声音、视频、图像或者GPS数据实时叠加到真实世界环境中的一种技术。这种技术能够达到以假乱真的地步，给人以十分逼真的感觉。用户可以使用便携式移动终端观看到无缝“集成”的虚拟环境与真实环境的合成效果。

阶层论视角的研究强调农村土地流转与阶层分化的关系。有研究认为，在现阶段农业发展条件下土地流转改变了农村的阶层分化状况以及各阶层的利益分配，乡村社会的阶层结构在土地流转的推动下不断进行重组[9]。也有个案研究显示，农民之间自发的土地流转形成了较大比例的中农阶层，农村中间阶层的经济收入主要依靠土地，社会生活主要在村庄内部，土地流转对于农村中农阶层的生产和生活，以及支撑农村社会常规运行来说有着非常重要的意义[10]。还有研究提出，在土地流转中产生的中农阶层，他们作为农业生产活动的有力承担者，既起到向上表达着基层农民诉求的平台作用，同时也起到为村庄连接国家政策与资源的作用[11]。

  

图2 供试病原菌ITS区PCR扩增Fig.2 The results of the PCR of pathogen’s ITS

 

A.1～10为北疆苗期采；B.11～20为北疆中后期期采；C.21～30为南疆苗期采；D.31～40为南疆中后期采；Y为阴性对照，M为分子质量标准物质，2 000 bp。A:1-10,sampled at the seedling stage of Northern Xinjiang;B:11-20,sampled at the adult stage of Northern Xinjiang;C:21-30,sampled at the seedling stage of Southern Xinjiang;D:31-40,sampled at the adult stage of Southern Xinjiang;Y:negative control;lane M:molecular size marker DNA ladder,2 000 bp.

测序结果在NCBI上进行Blast比对，应用MEGA 5.0软件中的临近法（Neighbor-Joining，NJ）构建病原系统发育树，分析菌株间的亲缘关系，确定病原分类地位。

采用组蛋白3基因扩增引物H3-1a/H3-1b对病原基因组DNA进行扩增，1～6号和19号菌株扩增出494 bp的片段，20号菌株扩增440 bp的片段，7～10号、11～18号、21～30号和 31～40号菌株扩增出 546 bp的片段 （图 4）。经BLAST比对显示，1～6号和19号与A.alternata（AF404620、KF997067 和 KR866858） 相似性达99%；20 号菌株与 A.alternata（KF280540.1）相似性达 100%；7～10号、12～18号、21～30号和31～36号菌株与 A.tenuissima （KT384348.1）相似 性 达 99%， 与 A.tenuissima（KT384290.1、KT384354.1和KP267539.1）相似性达100%；而11号和37～40号菌株与A.alternata和A.tenuissima相似性都很高，说明组蛋白3基因扩增引物H3-1a/H3-1b，不能准确区分大孢子种和小孢子种。

第2类包括 7～10、12～18、21～30 和31～36号，共27个菌株，其形态和第1类比较相似，在PDA培养基上培养，菌落初期灰白色，后期中央略微隆起，灰白色至深灰绿色或深橄榄绿色，绒毛状，基质浅褐色至褐色。分生孢子梗单生或簇生，直立或曲膝状弯曲；分生孢子倒棍棒形、卵圆形或近椭圆形，淡褐色至暗褐色，单生或7～15个串生，具4～7个横膈，2～7个纵膈或斜膈，大小 （17.5～50.0）μm×（5.0～15.5）μm； 有喙或无喙，喙锥形或短柱状，大小 （2.5～15.0）μm×（2.5～4.5）μm。 初步鉴定为A.tenuissima （图 1 B1、B2、B3）。

因为楚墨不这么看。他与静秋相恋两年，除了吻过她的额头，两个人从没有越雷池一步。他认为静秋对他越来越冷淡全因了康芳。——康芳有一个需要照顾的丈夫，康芳只有一个女儿，自私的她希望女儿和女婿能够守在她的身边。

通过构建系统进化树发现，分析组蛋白3基因序列，很容易将小孢子种A.alternata和A.tenuissima分为2个类群，所有供试菌株与A.macrospora都不聚在一起（图 5）。

由此确认，此次采样的新疆棉花叶斑病的病原种类有3种，即A.alternata、A.tenuissima和A.macrospora，但各地链格孢属病原菌的种类有一定差别（表2），与内地报道的棉花叶斑病的病原种类也不完全相同[4-7]。

3 结论与讨论

经调查，棉花叶斑病在新疆棉花整个生长期都可发生，但主要发生在苗期和生长后期，此时如遇持续低温高湿的环境，则叶斑病发生较重。如2016年北疆春季遇持续低温高湿，苗期叶斑病发病率达100%，严重影响棉苗生长和发育；当年8月下旬后南疆阿克苏地区持续低温高湿，后期叶斑病大发生，不论是长绒棉还是陆地棉，都有不少棉田一片枯焦。正常气候条件下，该病在棉花生长中期很少发生；但若此时遇持续低温高湿的环境，特别是下冰雹之后，也会较重发生。如2016年6月末博州81团下冰雹之后，凡遭冰雹危害的棉花也发生较重的叶斑病。这种情况与新疆气候变化比较剧烈、春季常有明显的倒春寒、秋季降温快等因素有关。

上面说到，校园文化是能够分作狭义上的于广义上的，这个点，我们主要讨论的是广义上的校园文化。首先，我们知道，广义上的校园文化是由精神文化、物质文化、行为文化共同构成的有机整体。首先，精神文化可以说是校园文化的核心，主要是以大学精神的形式表现。而大学精神，则是一个大学在长期的教育实践中积淀的最富有典型意义的精神特质，也可以说是大学的办学理念，例如北京大学的“兼容并包”。

  

图3 供试病原菌与相似种的ITS序列的发育树Fig.3 Dendrogram of ITS sequences of the pathogen and its related species

以形态学鉴定为基础，结合rDNA-ITS和组蛋白3基因序列分析，确定新疆棉花叶斑病的病原有 3种， 即 A.alternata、A.tenuissima和 A.macrospora，没有分离到棉链格孢A.gossypina。其中：北疆苗期（5―6月）棉花叶斑病的主要病原为A.alternata，占供测菌株的60%，次为A.tenuissima，占供测菌株的40%；生长后期（8―9月）棉花叶斑病的主要病原为A.tenuissima，占供测菌株的70%，次为A.alternata和A.macrospora，分别占供测菌株的20%和10%。南疆棉花苗期叶斑病的主要病原为A.tenuissima，占供测菌株的100%。南疆生长后期主要病原为A.tenuissima和A.macrospora，分别占供测菌株的60%和40%；其中，3个长绒棉品种上的病样（37～39号）病原全是A.macrospora，故生长后期长绒棉叶斑病的病原可能以A.macrospora为主，陆地棉以A.tenuissima为主，有待继续研究。

如表2所示，在2003～2009年期间，日本的增加值出口总额呈现出先增后减的态势，即从2003年的4357.38亿美元增加至2007年的6681.12亿美元，增幅达到53.33%；而当2008年席卷全球的国际金融危机爆发之后，日本的增加值出口总额受此影响，又降至2009年的4615.52亿美元，降幅达到30.93%。这反映出日本作为典型的出口导向型经济体，对于外部需求的依赖度较高，同时受到国际市场波动的影响比较大；除此之外，日本作为高技术产业大国，凭借其出口的高技术产品积累了巨额的产品附加值，这可以从日本增加值出口的绝对规模上看出。

近年来研究证明，链格孢属级特征明显，种级特征变异较大，特别是链格孢属中小孢子组的成员，仅根据形态特征进行种的鉴定比较困难；因此，分子生物学方法越来越多地被应用。rDNA ITS区域介于18S rDNA、5.8S rDNA和 28S rDNA之间，进化速度较编码区快，可以为种间或种内的分子系统研究提供足够多的变异[14]。本研究基于rDNA-ITS可有效区分大孢子种A.macrospora与小孢子种A.alternata和A.tenuissima，而对于rDNA-ITS同源性超过98%的小孢子种A.alternata和A.tenuissima，通过分析组蛋白3基因序列可以较好地辨别。这与Wang等[12]、杨超等[13]研究结果一致。另外，新疆地域广阔，本研究采样点南疆以阿克苏为主，北疆以石河子为主，其他植棉区的叶斑病采样相对较少，且长绒棉叶斑病的采样也较少。因此，今后进一步研究时应注意合理确定采样地域及其分布。

  

图4 供试病原菌组蛋白H3基因PCR扩增

 

a.1～10为北疆苗期采；b.11～20为北疆中后期采；c.21～30为南疆苗期采；d.31～40为南疆中后期采；Y为阴性对照，M为分子质量标准物质，2 000 bp。a:1-10,sampled at the seedling stage of Northern Xinjiang;b:11-20,sampled at the adult stage of Northern Xinjiang;c:21-30,sampled at the seedling stage of Southern Xinjiang;d:31-40,sampled at the adult stage of Southern Xinjiang;Y:negative control;lane M:molecular size marker DNA ladder,2 000 bp.

  

图5 供试病原菌与相似种组蛋白3基因序列的发育树Fig.5 Dendrogram of histone 3 gene sequences of the pathogen and its related species

 

表2 3种病原菌在南疆、北疆棉花苗期和成株期所占比例Table 2 Proportion of three pathogenic bacteria at the seedling and adult stage of cotton in Northern and Southern Xinjiang

  

菌种名称Name of bacteria北疆苗期Seedling stage in Northern Xinjiang北疆成株期Adult stage in Northern Xinjiang南疆苗期Seedling stage in Southern Xinjiang南疆成株期Adult stage in Southern Xinjiang各时期合计Sum of each stage比例Proportion/%A.tenuissima 4 40 7 70 10 100 6 60 27 67.5 A.alternata 6 60 2 20 0 0 0 0 8 20.0 A.macrospora 0 0 1 10 0 0 4 40 5 12.5菌株数Bacteria number比例Proportion/%菌株数Bacteria number比例Proportion/%菌株数Bacteria number比例Proportion/%菌株数Bacteria number比例Proportion/%菌株数Bacteria number

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