杨伟华等[1]援引环保部和国土资源部2014年发布的全国土壤污染状况调查显示，全国土壤总的点位超标率达16.1%，其中耕地土壤点位超标率高达19.4%，主要无机污染物包括镉、铅、铜、汞和砷等重金属元素。棉花在我国农业生产中扮演重要角色。之前的研究结果表明，棉花对多种非生物胁迫表现一定的耐性，对重金属胁迫具有较强的耐性[2-7]。李玲等[8]以3个陆地棉品系为研究对象，调查了镉胁迫条件下，重金属镉在陆地棉不同组织部位中的分布。结果表明，其主产品纤维和副产品种子中重金属含量均较低。由此可见，棉花中重金属不易进入食物链，是潜在的、优良的、可用于耕地重金属修复的工程农作物。

通过植物络合素类物质络合金属离子后经转运蛋白转运到细胞中诸如液泡等特定部位，维持胞内自由金属离子的平衡是植物主动防御重金属毒害的重要机制之一。植物络合素酶Phytochelatin synthase,PCS）控制络合小分子合成，是直接决定植物对金属胁迫抗性的关键酶[9]。Grill等[10]发现 200 μmol·L－1 CdSO4胁迫下蛇木根细胞悬浮液中90%以上的重金属被植物络合素吸收，说明植物络合素在植物主动防御重金属胁迫中的核心作用。自Grill等[10]于1989年首次从膀胱麦瓶草中发现植物络合素合酶以来，PCS基因几乎在所有植物中均被发现，甚至酵母、藻青菌和线虫中也发现PCS的存在。目前研究认为，PCS蛋白N端结构域phytochelatin（Pfam ID：05023，InterproID：IPR007719）是催化中心，而 C端结构域 phytochelatin_C（Pfam ID：09328，InterproID：IPR015407）控制催化效率，N端序列保守性远远高于C端。几乎所有的植物均同时含有2个保守结构域，即 phytochelatin和 phytochelatin_C。拟南芥中PCS基因家族包含2个旁系同源基因 （AtPCS1和AtPCS2），其中 At-PCS1作为主效基因，在重金属解毒过程中比AtPCS2具有更强的效果[11-13]，二者均含有PCS基因家族的特征结构域。棉花和拟南芥同属双子叶植物，亲缘关系较近。得益于近年来棉属几个重要种全基因组测序的完成，运用比较基因组学方法鉴定棉花中的目标基因更加高效快捷。陆地棉(Gossypium hirsutum,(AD)1)是全球最大的棉花栽培种，为异源四倍体，由同源二倍体雷蒙德氏棉基因组D5和亚洲棉基因组A2自然加倍而来。本研究基于陆地棉及其2个供体种全基因组的信息[14-16]，从全基因组范围鉴定陆地棉的植物络合素合酶基因及其特征，为进一步的功能验证提供参考。

1 材料和方法

1.1 研究对象和数据获取

陆地棉[14]和亚洲棉[16]全基因组信息基于中国农业科学院棉花研究所-华大基因（Cotton Genome Project-Beijing Genome Institute,CGP-BGI）版本和美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information,NCBI），登记组装号分别为GCF_000327365.1、GCF_000612285.1和GCF_000987745.1。雷蒙德氏棉[15]全基因组信息基于联合基因组研究所（Joint Genome Institute,JGI）版本。 以已经完成功能验证的拟南芥中的AtPCS1（Gene ID:834430）和 AtPCS2（Gene ID:839354）为主要参照，同时参考其他物种中PCS基因相关信息（见图2），在NCBI数据库中以默认值获得3个棉种PCS基因及其蛋白序列，并将所得蛋白序列提交Pfam数据库进行进一步验证[17-18]。蛋白分子量和等电点等相关特征信息通过软件SnapGene Viewer 4.0进行分析和预测。

1.2 蛋白序列比对和进化树构建

除棉属3个种的PCS外，本研究还包括来自高等植物、酵母、线虫等不同物种的18个PCS蛋白序列，用于保守结构域和蛋白序列的比对，并构建进化树，其中用于鉴定参考的18个PCS的具体信息详见图1。利用ClustalⅩ2.0软件对25个PCS蛋白序列进行多序列联配，参数为默认值[9]。利用MEGA 6.06软件将联配结果通过邻位连接法（Neighbor-Jointing,NJ）构建系统进化树，设置重复值为1 000，提高进化分支树结果可靠性[19]。

1.3 棉花中PCS基因结构分析

提取鉴定的8个棉花PCS基因的General Feature Format 3信息构建整合文件，提交到在线分析系统 Gene Structure Display Server（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）进行基因结构分析[20]。

2 结果和分析

2.1 陆地棉PCS基因的鉴定

为明确陆地棉PCS酶家族参与植物络合素合成的关键位点之间的差异与特点，对拟南芥的AtPCS1和AtPCS2、已完成蛋白空间结构解析的蓝藻菌NsPCS和棉属8个PCS蛋白家族酶催化端关键位点进行比较。结果表明（图3），棉属3个种、拟南芥和蓝藻菌PCS蛋白家族整个酶活性区域保守性都非常高，其中同属高等植物的陆地棉及其供体种和拟南芥特征结构域的保守性比蓝藻菌更高，和物种中的亲缘关系相对应。陆地棉及其供体种PCS蛋白家族中，除去N端非齐头氨 基 酸 ，GrPCS2 与 GhPCS1，GaPCS1 与 Gh-PCS2，GrPCS1、GhPCS4、GaPCS2 与 GhPCS3 分别具有完全保守的氨基酸序列；蓝藻菌中Cys70、His183和Asp201与酶催化“小洞”相关，与之对应位置的所有棉属PCS家族中氨基酸也完全相同；相应的，与γ-EC形成氢键的PCS的肽链折叠后形成的主、支链氨基酸位点在棉属中也完全相同。由此可见，陆地棉与其供体种之间PCS家族关键氨基酸保守位点均严格保守，酶功能基因没有丢失。

 

表1 陆地棉及其供体种的植物络合素合酶及其基因的主要特征Table 1 Distribution of phytochelatin synthase in G.raim ondii,G.arboreu m and G.hirsutum

  

序号Num ber基因ID gene ID所在染色体Chromosome location核苷酸链DNA strand等电点p I可变剪切数Alternative splicing基因gene编码序列长度Coding sequences/bp蛋白长度No.of amino acid特征保守结构域Conserved domains分子质量MW/kDa Phytochelatin Phytochelatin_C 1 GrPCS1 LOC105766126 1 Minus 5 8 265 474 52.06 4.9 1 1 2 GrPCS2 LOC105803222 7 Plus 4 5 822 482 53.51 6.4 1 1 3 GaPCS1 LOC108487459 9 Plus 2 4 666 505 56.31 6.4 1 1 4 GaPCS2 LOC108468678 1 Plus 2 3 297 495 56.67 5.2 1 1 5 GhPCS1 LOC107922779 26 Plus 3 4 859 482 53.54 6.4 1 1 6 GhPCS2 LOC107922692 26 Minus 2 4 961 507 56.43 6.4 1 1 7 GhPCS3 LOC107955409 9 Plus 3 3 681 482 53.23 4.9 1 1 8 GhPCS4 LOC107937656 Unplaced scaffold Minus 2 3 310 495 54.53 5.2 1 1

2.2 陆地棉PCS系统进化分析与保守特征结构域

  

图1 棉花PCS与其它17个物种PCS蛋白的亲缘关系和特征保守结构域分布Fig.1 Phylogeny analysis on PCSs in cotton and other 17 selected organisms,combining conserved domains distributions

 

左边亲缘关系树由Clustal X 2.0和MEGA 6.06软件通过多序列比对联配后邻位连接法构建，其中蓝色数字表示正确预测百分率，黑色数字表示分支长度，红色圆点表示物种为棉花，其它物种为（1）大豆、（2）田菁属、（7）和（9）拟南芥、（8）芥菜、（10）烟草、（11）土豆、（12）莲藕、（13）金鱼藻、（14）和（16）水稻、（17）禾秆蹄盖蕨、（18）裂殖酵母、（19）线虫、（20）小眼虫、（21）藻青菌。右边保守位点借助NCBI下Web CD-Search Tool获得，其中红色条表示命中的N端保守酶功能结构区域phytochelatin，绿色条表示C端保守功能未知结构域phytochelatin_C，颜色由深至浅表示命中结构域可信度依次减弱，背景黑色条表示相关PCS蛋白链。The left part represents polygenetic tree generated by software ClustalⅩ2.0 and MEGA 6.06 via multiple sequence alignment and neighbor-jointing method,where blue number represent possible correct percentage,black numbers represent branch length,numbered taxon names are(1)Glycine max,(2)Sesbania rostrata,(7)&(9)Arabidopsis thaliana,(8)Brassica juncea,(10)Nicotiana tabacum,(11)Solanum tuberosum,(12)Nelumbo nucifera,(13)Ceratophyllum demersum,(14)&(16)Oryza sativa,(17)Athyrium yokoscense,(18)Schizosaccharomyces pombe,(19)Caenorhabditis elegans,(20)Euglena gracilis,(21)Cyanobacterium.The right part represents conserved domains hits of PCS proteins(black bar)including phytochelatin(red bar)and phytochelatin_C (green bar)located on N and C terminal,respectively,where the color from dark to light indicates domain targeted with higher score.

图10展示了当k′(k′

2.3 陆地棉PCS基因结构差异

传统多媒体教室一般适合“讲授法”为主的教学，信息是单向传递，即教师—学生。智慧教室则要打破这种局限，信息是双向甚至多向传递，信息的传递包括人与人、人与设备、设备与设备等方面。多方面的互动适合以讨论为主的教学模式，如探究式教学、协作学习等。

2.4 陆地棉PCS酶关键作用位点分析

  

图2 棉花中PCS家族基因结构分析Fig.2 Structural analysis onPCS gene family in cotton

 

左侧表示棉属中PCS蛋白和进化树，右侧表示相应基因结构，其中红色矩形条表示外显子，黑实线表示内含子，蓝色矩形条表示两端非翻译区。PCS proteins and their phylogenetic relationship are showed in the left,and genes structures are showed in the right where red rectangle,blue rectangle and solid line represents exon,untranslated region(UTR)and intron,respectively.

Vivares等[21]解析藻青菌PCC720 PCS蛋白空间结构发现PCS酶活性中心具有类似于木瓜蛋白酶的空间结构，该酶活性中心为2个“新月型”的单体结构组成二聚体，包含8个α螺旋和6个β折叠条，说明PCS有与木瓜蛋白合酶类似的作用机制。在酰基化 （转肽）过程中，藻青菌NsPCS中参与γ-谷氨酰半胱氨酸 （γ-glutamylcysteine,γ-EC）形成氢键的氨基酸残基有Cys70、Met123、Gly182、Asp225 和 Arg232， 其中作为酶催化位点中的最重要的3个氨基酸残基Cys70、His183和Asp201在空间结构上形成结合底物的“小洞”。这3个氨基酸残基在真核生物和原核生物中均严格保守，在植物络合素形成过程中起关键作用。

将陆地棉及其2个供体种的8个PCS蛋白与其它代表性物种的17个PCS蛋白序列进行系统进化分析（图1）。25个PCS蛋白被分成3个亚类，棉属的8个PCS分别属于2个亚类，同一亚类中棉属PCS亲缘关系比较接近，与其它物种差别明显。第I亚类中，GrPCS2与GhPCS1亲缘关系最近，GaPCS1稍远，GhPCS2更远。第II亚类中，GrPCS1和 GhPCS4，GaPCS2和 GaPCS3两两表现相近的亲缘关系。结果还可以看出，棉属中二倍体A2组（亚洲棉）和D5组（雷蒙德氏棉）分别有1对旁系同源PCS基因。陆地棉（(AD)1）有2对旁系同源PCS基因，并且分别与A、D组中有亲缘关系较近的对应基因，结果支持异源四倍体栽培陆地棉起源于2个二倍体棉种的观点。从图1还可以看出，棉属2个种的PCS蛋白分属于不同亚类，而拟南芥和水稻中各自的2个旁系同源蛋白均属于同一亚类。由此推测，分属于不同亚类的棉花PCS可能在功能上存在较大分化。

根据蛋白序列和结构域的保守性比对，在陆地棉中鉴定出4个旁系同源基因GhPCS1（LOC107922779）、GhPCS2 （LOC107922692 ）、GhPCS3（ LOC107955409）和 GhPCS4 （LOC-107937656），其中GhPCS1和 GhPCS2分别分布在第26号染色体（D13）的正、反义链（正反链以NCBI数据库为准）上，GhPCS3位于9号染色体，GhPCS4位于未锚定的Scaffold上（表1）。陆地棉供体种雷蒙德氏棉中只鉴定出2个旁系同源基因 GrPCS1 （LOC105766126） 和 GrPCS2（LOC105803222），分别位于第1和第7号染色体上，其中GrPCS1位于DNA反义链上。陆地棉另一供体种亚洲棉中也只鉴定出2个旁系同源基 因 GaPCS1 （LOC108487459） 和 GaPCS2（LOC108468678），分别位于第9条和第1条染色体上。陆地棉及其供体种8个被检测到PCS基因均具有2～5个不等的可变剪切序列，编码序列长度为3～8 kb，其中最短的是GhPCS4，编码长度仅为3 310 bp；最长的GrPCS1编码长度达8 265 bp，较GhPCS4长1倍多。8个PCS基因编码蛋白包含474～507个氨基酸残基，基因之间编码蛋白长度差异不大，说明不同PCS基因的内含子结构差异较大。陆地棉及其供体种被预测到的8个基因中，其蛋白均在55 kDa左右，等电点4.9～6.4，均含有2个保守结构域（phytochelatin和 phytochelatin_C，表1），说明这些蛋白具有相似的功能。

曾经，养殖场周边臭气熏天，粪污随意堆放，污水直排沟渠，污染环境严重，老百姓怨声载道。为了保护环境，我国实行了新环保法，并划定了畜禽养殖禁养区、限养区，制定了清理整治方案，一大批不符合规定的畜禽养殖场（户）被清理关闭。但是，一些地方在推行畜禽养殖禁养、限养过程中，存在盲目禁养、野蛮拆迁、“一刀切”拆迁等问题，不仅让政策偏离初衷，更是断了养殖户的生计，伤了养殖户的心。

这是从《全芳备祖》有关信息勾勒的大致经历，由于材料的稀缺，整个履历是极为模糊的。只能大致感觉到，他应属于当时的江湖游士一族，未见有科举、仕宦的任何信息，布衣终身，一生大部分时间都在江淮、湘赣、浙闽等地尤其是江淮之间漫游、客居。

  

图3 PCS酶家族催化中心功能位点对比Fig.3 Comparison in amino acid of enzyme center of PCS family

 

红色条、蓝色箭头和橘黄色线条分别表示α螺旋、β折叠单元和β转角；红星表示酶催化“小洞”相关氨基酸残基，蓝星和橘黄星分别表示与γ-EC形成氢键的相关氨基酸残基。比对序列上面的灰色条表示比对序列间的保守性程度，其中黑星表示完全保守。AtPCS、GrPCS、GhPCS、GaPCS和NsPCS分别表示来自于拟南芥、雷蒙德氏棉、陆地棉、亚洲棉和藻青菌的植物络合素合酶。Red bars,blue arrows and orange line represent α-helix, β-strand and β-loop.Red stars represent residues in position of catalytic triad.The residues whose main or side chain is related to hydrogen-bonded to γ-EC are shown as blue and orange star,respectively.Grey bar on head of sequence alignment represents amino acid conserving degree,in which black star shows total conserved position.AtPCS,GrPCS,GhPCS,GaPCS and NsPCS represent PCS fromA.thaliana,G.raimondii,G.hirsutum,G.arboreumandCanoy bacteriumPCC720,respectively.

2.5 陆地棉PCS蛋白中半胱氨酸的分布

半胱氨酸（Cysteine，Cys）是唯一含有巯基的氨基酸，在植物对抗重金属胁迫中具有重要作用，其易于与 Cd2＋，Hg2＋，Cu2＋，Ag＋等金属离子形成 R-S-M'，R-S-M''-S-R（M'，M''分别为 1 价、2 价金属）形式的不易溶硫醇盐。作为还原剂，半胱氨酸能与弱氧化性的金属离子如铜离子发生氧化反应，改变重金属离子的毒害效果；基于这些化学反应特性，PCS中的半胱氨酸在重金属识别和受重金属调控酶活性过程中起重要作用。PCS的显著特征就是N、C端富含Cys，且成对出现[9,22]。陆地棉及其供体种8个PCS蛋白所包含的酶作用位点（N端）中Cys分布十分相似，N端均含有1个Cys对。除GaPCS2和GhPCS3外，剩余6个PCS蛋白的N端均含有9个Cys。对酶催化起调控作用的C端Cys分布差别较大，Cys含量为10～14个不等，成对的Cys含量为1～4对不等。在3个棉种PCS家族2个亚组中，包含GrPCS2、GaPCS1、GhPCS1和GhPCS2的亚组I均有4对Cys以及13～14个单独的Cys。亚组II中只有1～3对Cys和10个单独的Cys。由此可推测，亚组I中PCS酶家族的酶活性可能比II更强，这与2.2中的结果相吻合。

通过对陆地棉及其供体种PCS家族基因的开放阅读框（Open reading frame,ORF）和ORF对应基因组区域的序列进行分析，获得PCS家族基因的内含子和外显子结构（图2）。由图2可以看出，3个棉种PCS家族基因基本由8个外显子构成，其中GrPCS2缺少N端2个外显子，GrPCS1中3’端最右的外显子长度明显较短，雷蒙德氏棉PCS基因家族外显子结构完整性低于亚洲棉和陆地棉，可能会导致相对较弱的催化能力。结合图1，同一亚组的PCS基因的内含子结构更为相近，其中雷蒙德氏棉中的2个PCS基因内含子长度较长。

3 讨论

  

图4 棉花PCS蛋白中的Cys分布Fig.4 Distribution of Cys in cotton PCS proteins

 

X轴上部表示N端，下部表示C端，柱中数字表示Cys数，“－”表示方向，柱端数字表示Cys对数。Distribution of Cys within N terminal(blue)and C terminal(red)is denoted at upper and lower of X axis.The number in the center of column represent Cys counts,and the number close to terminal of columns represent counts of Cys pairs.

本研究在四倍体陆地棉中鉴定出4个PCS基因，从其供体种雷蒙德氏棉和亚洲棉中分别鉴定出2个PCS基因，陆地棉的PCS基因数量是2个供体种基因之和。与拟南芥和水稻等物种不同，陆地棉及其供体种PCS基因家族分属于2个不同的亚组，暗示棉属的旁系同源PCS蛋白在功能上可能具有较大的分化。亚组I中的PCS与大部分双子叶植物中PCS更为接近，亚组II中的PCS与裂殖酵母、线虫等更为接近。藻青菌PCC720中的PCS只单独含N端特征结构域，裂殖酵母、线虫和小眼虫只含有N端特征结构域PF05023而不含C端特征结构域phytochelatin_C，因此这些物种中PCS酶活性较低。这可能说明棉花PCS蛋白家族亚组I成员比亚组II成员具有更强的植物络合素合酶活性。近年的研究发现，PCS具有双功能酶特性，除转肽酶活性外，同时还具有肽酶活性，但该功能只在拟南芥中有初步研究。棉属植物PCS蛋白家族亚组的差异是否与该酶存在功能差异相对应还需要进一步研究。

PCS基因家族结构分析发现，相较于亚洲棉和陆地棉，雷蒙德氏棉中的2个旁系同源基因Gr-PCS2 N端缺少2个外显子，GrPCS1中3’端最后1个外显子长度明显较短，推测雷蒙德氏棉可能比亚洲棉和陆地棉对重金属的反应更为敏感。

PCS在植物中序列保守性高，但催化活性差异较大。早期的研究普遍认为PCS基因是组成性表达，但催化活性受重金属离子调控，后来研究发现在小麦等的基因表达受重金属离子浓度影响，可见该酶在不同物种中差异较大[23-25]。相较于其它作物，棉花对金属胁迫有较强的抗性[2]，然而，有关棉花PCS基因结构与特征还未见报道。棉属种数量多、种间差异大，且对多种重金属有着较好的耐性，是挖掘优质PCS基因的潜在对象。我们的研究结果也表明棉属3个物种的PCS基因功能分化程度高于其他植物，这对棉属PCS进行深入研究意义重大。

4 结论

本研究在系统的全基因组信息基础上，在陆地棉中鉴定出4个PCS家族基因，是其供体种的2倍，再次佐证了陆地棉由亚洲棉和雷蒙德氏棉进化而来。棉花中PCS家族基因出现较大分化，相较于亚组II，归属亚组I的PCS可能具有较强的酶活性。雷蒙德氏棉对重金属的敏感程度可能要高于陆地棉和亚洲棉。

参考文献:

[1]杨伟华,王延琴,周大云,等.植棉修复重金属污染土壤研究进展[J].湖南农业科学,2014(18):41-44.Yang Weihua,Wang Yanqin,Zhou Dayun,et al.Research progress in remediation of heavy-metal contaminated soils by plantingcotton[J].HunanAgriculturalSciences,2014(18):41-44.

[2]Muhammad D K.陆地棉抗除草剂基因的遗传转化及其抗镉胁迫的遗传效应探讨[D].杭州:浙江大学,2008.Muhammad D K.Research on transformation of herbicide-resistant gene and Cd stress on upland cotton[D].Hanzhou:Zhejiang University,2008.

[3]梅磊,李玲,Daud M K,等.棉花对重金属胁迫的应答反应与抗性机理研究进展[J].棉花学报,2018,30(1):102-110.Mei Lei,Li Ling,Daud M K,et al.Advances on response and resistance to heavy metal stress in cotton[J].Cotton Science,2018,30(1):102-110.

[4]陈浩东,贺云新,郭利双,等.镉胁迫对3个棉花品种生理生化特征及农艺性状的影响[J].棉花学报,2018,30(1):62-76.Chen Haodong,He Yunxin,Guo Lishuang,et al.Effects of cadmium stress on physiological and biochemical characteristics and agronomic traits of three upland cotton cultivars[J].Cotton Science,2018,30(1):62-76.

[5]陈悦,李玲,何秋伶,等.镉胁迫对三个棉花品种（系）产量、纤维品质和生理特性的影响[J].棉花学报,2014,26(6):521-530.Chen Yue,Li Ling,He Qiuling,et al.Effects of cadmium stress on yield,fiber quality,and physiological traits of three upland cotton cultivars(lines)[J].Cotton Science,2014,26(6):521-530.

[6]刘连涛,陈静,孙红春,等.镉胁迫对棉花幼苗生长效应及不同器官镉积累的影响[J].棉花学报,2014,26(5):466-470.Liu Liantao,Chen Jing,Sun Hongchun,et al.Effects of cadmium stress on growth and cadmium accumulation in cotton(Gossypium hirsutumL.)seedlings[J].Cotton Science,2014,26(5):466-470.

[7]李玉军,张志刚,匡政成,等.植棉修复镉污染土壤研究进展[J].中国棉花,2017,44(4):8-10.Li Yujun,Zhang Zhigang,Kuang Zhengcheng,et al.Research progress in remediation of cadmium contaiminated soils by planting cotton[J].China Cotton,2017,44(4):8-10.

[8]李玲.镉胁迫对陆地棉生长发育、产量和品质的影响及其耐镉性的遗传研究[D].杭州:浙江大学,2012.Li Ling.Effect of cadmium stress on growth,yield and quality in upland cotton and its genetic analysis for cadmium tolerance[D].Hanzhou:Zhejiang University,2012.

[9]冯保民,麻密.植物络合素及其合酶在重金属抗性中的功能研究进展[J].应用与环境生物学报,2003,9(6):657-661.Feng Bomin,Ma Mi.Research advance of phytochelatins and phytochelatin synthase on heavy metal tolerance[J].Chinese Journal of Applied and Environmental Biology,2003,9(6):657-661.

[10]Grill E,Loffler S,Winnacker E L,et al.Phytochelatins,the heavy-metal-binding peptides of plants,are synthesized from glutathione by a specific gamma-glutamylcysteine dipeptidyl transpeptidase(phytochelatin synthase)[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1989,86(18):6838-6842.

[11]Cobbett C S.A family of phytochelatin synthase genes from plant,fungal and animal species[J].Trends in Plant Science,1999,4(9):335-337.

[12]Kuhlenz T,Schmidt H,Uraguchi S,et al.Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase 2 is constitutively activein vivoand can rescue the growth defect of the PCS1-deficient cad1-3 mutant on Cd-contaminated soil[J].Journal of Experimental Botany,2014,65(15):4241-4253.

[13]Lee S,Kang B S.Expression ofArabidopsisphytochelatin synthase 2 is too low to complement an AtPCS1-defective cad1-3 mutant[J].Molecules and Cells,2005,19(1):81-87.

[14]Li F,Fan G Y,Lu C,et al.Genome sequence of cultivated upland cotton(Gossypium hirsutumTM-1)provides insights into genome evolution[J].Nature Biotechnology,2015,33(5):524-530.

[15]Paterson A H,Wendel J F,Gundlach H,et al.Repeated polyploidization ofGossypiumgenomes and the evolution of spinnable cotton fibres[J].Nature,2012,492(7429):423-427.

[16]Li F G,Fan G,Wang K B,et al.Genome sequence of the cultivated cottonGossypium arboreum[J].Nature Genetics,2014,46(6):567-572.

[17]Finn R D,Coggill P,Eberhardt R Y,et al.The Pfam protein families database:Towards a more sustainable future[J].Nucleic Acids Research,2016,44(D1):D279-D285.

[18]Marchler-Bauer A,Bo Y,Han L,et al.CDD/SPARCLE:Functional classification of proteins via subfamily domain architectures[J].Nucleic Acids Research,2017,45(D1):D200-D203.

[19]Kumar S,Stecher G,Tamura K.MEGA7:Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J].Molecular Biology and Evolution,2016,33(7):1870-1874.

[20]Hu B,Jin J,Guo A,et al.GSDS 2.0:An upgraded gene feature visualization server[J].Bioinformatics,2015,31(8):1296-1297.

[21]Vivares D,Arnoux P,Pignol D.A papain-like enzyme at work:Native and acyl-enzyme intermediate structures in phytochelatin synthesis[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2005,102(52):18848-18853.

[22]唐杰.基于半胱氨酸与重金属离子相互作用的分析应用研究[D].重庆:西南大学,2011.Tang Jie.The Research on the analysis and application of the interactionbetweencysteineandheavymetalions[D].Chongqing:Southwest University,2011.

[23]Vatamaniuk O K,Mari S,Lu Y P,et al.AtPCS1,a phytochelatin synthase fromArabidopsis:Isolation and in vitro reconstitution[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1999,96(12):7110-7115.

[24]Chen J J,Zhou J M,Goldsbrough P B.Characterization of phytochelatin synthase from tomato[J].Physiologia Plantarum,1997,101(1):165-172.

[25]Lee S,Korban S S.Transcriptional regulation ofArabidopsis thalianaphytochelatin synthase(AtPCS1)by cadmium during early stages of plant development[J].Planta,2002,215(4):689-693.