播种包衣种子是控制土传和种传病害的重要手段。种衣剂具有保护种子、提高出苗率、防治病虫害、促进作物生长、增强抗逆性等作用[1-4]。为实现我国农业部提出的 “两减一增”（减化肥、减农药、增效益）的绿色防控目标，生物农药的研发成为重点，其中以生物种衣剂和生物复合种衣剂为代表的新型种衣剂，能减少农药用量，降低病原菌和害虫产生抗药性的风险，发展前景广阔。

甲基营养型芽孢杆菌LH-L3（Bacillus methylotrophicusCGMCC,No.12565，简称“LH-L3”）是本实验室从健康棉株叶片上分离获得的内生细菌，平板对峙试验结果表明其对多种病原菌有抑制作用，经温室试验证明其对棉花黄萎病有很好的防病作用，且具有促生长效果[5]。为了充分利用该菌株的优良特性，并应用于作物生产，本文对LH-L3菌株与化学农药复配作为种衣剂的可行性进行了研究。

在我们那儿，很多人家都是通过苦力烧制泥砖挣钱满足一家大小生活所需。暑假里，总是做父母的制作砖坯，做孩子的负责送到晒场上码放整齐。搬运砖坯到晒场晾晒就是我在整个暑假里每天要干的活。晒砖比制砖的速度显然要快上许多。闲下来的时候，我就在码放晾晒的砖坯空隙中找蟋蟀，玩弄一小会儿，又全部放掉。天气实在太闷热，父亲就会大声吆喝“哦嗬嗬，呜嗬嗬”，他称之为“嗬风”，叫了几声后，树叶稍微动几下，似乎真有几丝风吹来。

1 材料与方法

1.1 供试材料

原药包括9种杀菌剂：98%（质量分数，下同）咯菌腈 （湖北巨胜科技有限公司生产）；95%福美双 （河北冠龙农化有限公司生产）；98%氟啶胺和98%异菌脲 （江西施普润农化有限公司生产）；96%嘧菌酯、95%苯醚甲环唑和95.4%噻呋酰胺（浙江威尔达化工有限公司生产）；97%烯酰吗啉和98%甲基硫菌灵（河北益海安格诺公司生产），1种杀虫剂：94.06%克百威（湖南国发精细化工科技有限公司生产）。目前我国禁止克百威在蔬菜、果树、茶树、中草药材上使用，并禁止用于防治卫生害虫。

助剂：农乳602（上海倍科化工有限公司生产）；萘磺酸钠甲醛缩合物（广州市创琞化工科技有限公司生产）；黄原胶（河北金丰新材料科技有限公司生产）；糊化淀粉、苯甲酸钠和甘油（山东浩中化工科技有限公司生产）；聚乙烯醇1750（常州市海拓实验仪器有限公司生产）；玫瑰精（河南澳欣化工产品有限公司生产）。

将LH-L3活化后，挑取单菌落接种到LB（Luria-Bertani）培养液，在 37 ℃、转速 180 r·min－1的摇床上培养4 d后，取菌液10 mL于80℃水浴加热15 min，稀释涂板法检测芽孢生成量后，在常温下离心除去部分培养液，制成芽孢含量109 cfu·mL－1的菌剂。

染液碱性强弱也是影响活性染料反应性的重要因素。碱剂强，染液pH值高，活性染料反应速率提高，可促进染料与棉纤维发生共价键的结合[3]。但当pH值大于11后，水解反应的比例增大，染料固色率下降。因此对反应性高的染料，碱性可以弱些；对反应性低的染料，碱性应强些。本实验通过用不同碱剂，研究pH值对于永光活性湖兰G染料染色的影响。染色工艺见表3、实验结果见表4。

1.2 抑制棉花黄萎病杀菌剂的筛选

在会议桌前，在聆听和询问之间，总会有几次恍惚的刹那，在那个时候好像那海浪的声音、海水的颜色、海风的触摸仍然环绕着我，仍然温柔地跟随着我，使我情不自禁地微笑了起来。

药剂筛选：大丽轮枝菌在马铃薯蔗糖琼脂（Potato-saccharose-agar，PSA） 培养基上生长缓慢，且其侵染是依靠萌发的孢子，而不是菌丝；因此，本试验采用计数孢子萌发菌落数计算菌落抑制率的方法评价化学农药的效果，这样既省时，又准确。统一设置1个浓度，将溶解的药剂加入100 mL PSA培养基，使培养基中药剂质量浓度达到1 mg·L－1（对于多数药效极佳的农药来说，这是1个较高的质量浓度，可用于评价杀菌效果），补足溶剂并保持各处理溶剂体积一致，以不含药剂但含相同体积溶剂的处理为溶剂对照，PSA为空白对照。将稀释100倍的菌液涂布于平板，每处理重复5次，25℃黑暗条件下培养7 d后，观察菌落生长情况。以PSA平板的菌落大小为参照，记录含药培养基上菌落的大小和数量，计算菌落抑制率（R，%）。 R（%）=（NPSA－NM）×100/NPSA.式中，NPSA为不含药PSA培养基菌落数量，NM为含药PSA培养基菌落数量。依据R值确定抑菌效果最佳的药剂，为下一步种衣剂中杀菌剂的选用提供依据。

学生小组继续讨论，发现命题(1)(2)，(3)(4)，(5)(6)，(7)(8)之间关系都是条件相同，结论互为否定.二者必有一个正确一个错误，因此只需研究一个，学生还认为研究肯定性命题较为习惯，于是学生抽取了以下四个命题：(1)(3)(5)(7).

1.3 LH-L3菌剂的制备

棉种（冀棉11）及棉花黄萎病菌（大丽轮枝菌Vd084，强致病力）由中国农业科学院棉花研究所李志芳博士惠赠，LH-L3及其绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）基因序列标记菌株 LH-L3-P43GFPmut3a（简称“LH-L3-GFP”）均为本实验室保存。

1.4 种衣剂的配制

根据1.2中筛选出的杀菌剂，参照本实验室董丽萍[6]研制的悬浮剂助剂配方配制种衣剂。在文献[6]助剂配方的基础上，添加杀虫剂克百威10%（质量分数，下同），芽孢含量 109cfu·mL－1的LH-L3（或是 LH-L3-GFP）菌剂 1%，即为 1号配方；在配方1基础上，分别添加杀菌剂咯菌腈2.5%、福美双10%，即为2、3号配方；在配方1基础上，添加咯菌腈2.5%和福美双10%，即为4号配方（咯·福·克生物复合种衣剂，Biological complex seed-coating agent，简称为 BCSA）。上述 4 种配方均用无菌水补足体积。

按配方称取各原料，先将增稠剂和成膜剂放入容器中，加无菌水[6]，将该容器置于沸水中水浴加热搅动成糊状，冷却至48～52℃，再加入除菌剂以外的其余原料混合搅匀得混合原料，且留一部分无菌水用于冲洗容器，然后将混合原料倒入砂磨机中，用留下的无菌水冲洗容器壁上的原料并倒入砂磨机中，研磨至95%以上混合原料的粒度为5 μm，且混合原料的黏度大于600 mPa·s，即制成化学药剂种衣剂[6]。再按上述配方的剂量加入芽孢含量109cfu·mL－1的LH-L3菌剂，充分混合均匀即得到各配方的种衣剂。

1.5 各配方种衣剂对带菌种子的杀菌效果

试验于2016年5月17日至6月3日在云南农业大学温室进行，试验期间温室窗户一直开启。用BSCA按药种质量比1∶50对棉种包衣，以裸种作空白对照，按上述方法进行播种，每处理重复5盆。试验盆置于温室窗户口，待种子出苗后每天观察叶片上是否出现虫害，并调查虫害发生情况，记录每株幼苗上害虫数量和每片叶上虫孔数量。计算被害率和防治效果（E）[13]。公式：E（%）=（NCK－NT）/NCK×100.式中，NCK 为对照每叶虫孔数，NT为处理每叶虫孔数。

将上述配方的4种种衣剂对带大丽轮枝菌的棉花种子按药种质量比1∶50进行包衣，分别于处理24 h、48 h后用无菌水振荡洗下表面孢子，采用稀释涂板法检测大丽轮枝菌的存活情况，同时设不包衣的带菌种子为空白对照（CK），所用平板为加1%（质量分数）硫酸链霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基 （Potato dextrose agar medium，PDA），杀菌效果最佳的种衣剂用于后续试验。

首先使用水利普查基层登记台账管理系统菜单中的“对象清查清查浏览”功能，点击业务分类的每一项，通过“导出EXCEL”功能，分别形成与Q201～Q803内容对应的24张浏览表，如表Q201（水库工程）导出名为“VIEW_Q201_0.XLS”。为了避免数据的无序性和方便后面的操作，应在软件中先按水利普查自动生成的编码排序后再导出数据。

1.6 对种衣剂理化性质的测定

参照GB/T 32775―2016《农药分散性测定方法》[7]、GB/T 14825―2006 《农药悬浮率测定方法》[8]、GB/T 19136―2003 《农药热贮稳定性测定方法》[9]、GB/T 19137―2003 《农药低温稳定性测定方法》[10]、GB/T 17768―1999 《悬浮种衣剂产品标准编写规范》[11]，进行测定。

其实，“勇敢做自己”是困难的，对青少年学生而言更是如此。这和人类的从众心理有关，不能苛求青少年学生。不仅如此，在当下的社会，过于固定而单一的成功成才标准也在不知不觉中对青少年学生施加影响。比如，最近有媒体报道，一到暑假，青少年学生就成为整容的主力军。学生们之所以容易受社会上对“高颜值”的盲目追捧影响，一方面固然是出于爱美之心，但缺乏主见、追逐流俗的心态也毋庸讳言。但这样的行为是否就是“洪水猛兽”？恐怕也不必过于担忧。其实，这在当下许多国家都是常见现象，而且青少年学生大多处在叛逆期，只要不伤害他人，征得家人的理解和支持，对自己的外貌做一些技术处理，也不必大惊小怪。

1.7 菌体存活情况测定

检测标记菌株LH-L3-GFP在种衣剂BCSA中是否与野生型菌株具有相同的耐受性。方法：按照野生型菌剂制备方法，将标记菌株于氯霉素质量浓度为10 mg·L－1的LB培养液中摇瓶培养4 d后，常温离心除去部分培养液，制成芽孢含量达到109cfu·mL－1的菌剂，然后按配方比例加入化学种衣剂中，于相应浓度的氯霉素平板中涂板检测种衣剂中有效活菌数初始量。每月检测1次含标记菌株、野生型菌株2种种衣剂的有效活菌数量（简称“菌量”），检测持续5个月。因标记菌株具有氯霉素抗性，若标记菌株与野生型菌株具有相同的耐受性，则用含标记菌株的种衣剂进行下一步试验。

存储期菌量的测定：分装3份含标记菌株LH-L3-GFP的种衣剂，每份100 mL，用于检测种衣剂BCSA中菌量变化情况；同时将棉种表面消毒晾干后，按药种质量比1∶50包衣，用于检测包衣棉种的菌量变化情况。2次试验的样品同时置于4℃（冷贮）、37℃（热贮）、室温3个温度条件下， 分别于 7 d、30 d、60 d、90 d、120 d、150 d、185 d检测菌量。

1.8 种衣剂BCSA促进棉花生长和防治黄萎病的作用

带菌土的制备：采用玉米粒产孢法，将在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化好的大丽轮枝菌菌丝块接种到煮熟并灭菌的玉米粒上，每天摇动1次玉米粒使其分散开，大约7 d后菌丝即可长满整瓶玉米粒。从玉米粒上水洗孢子，并用血球计数板计算悬浮液孢子含量，然后把孢子悬浮液浇在灭菌土上，充分混匀，制得孢子含量约为105 cfu·g－1的带菌土。

式中SOC储为某一深度下的土壤有机碳储量，t/hm2；Ti为第i层的土壤有机碳含量，g/kg；ri为第i层的土壤容重，g/cm3；Hi为第i层的土壤厚度，cm；n为土壤层次。

供试药剂为BCSA和不加生防菌LH-L3的咯·福·克种衣剂（简称为“CSA”），用 2.5%咯菌腈悬浮种衣剂（简称为“FSA”，瑞士先正达公司生产）作对照药剂，参照上述试验以及说明书推荐剂量， 分别按药种质量比 1∶50、1∶50、1∶250对棉种进行包衣处理，种子晾干后播种于14 cm×21 cm（直径×高度）的花盆中，每处理3盆，每盆10粒棉种，以未包衣种子为裸种对照。棉种出苗2 d（出苗率50%以上）、15 d（出苗结束）时调查出苗率，出苗后15 d测量株高、最大叶片宽度，裸种对照发病（播种后 25 d）2 d、5 d、10 d、17 d 时统计发病情况。按5级分级标准计算病情指数和相对防效[12]。

供试9种药剂对大丽轮枝菌均表现出一定的毒力，但毒力差异较大（表1），所用溶剂对菌落生长无影响。培养基中药剂质量浓度为1 mg·L－1时，氟啶胺对大丽轮枝菌的抑制作用最强，其次为福美双、咯菌腈、苯醚甲环唑、嘧菌酯，其他药剂抑制效果不明显。根据市场上已有的棉花种衣剂以及成本，选用福美双、咯菌腈进行下一步种衣剂配制试验。

1.9 种衣剂防治棉花叶部害虫的初步试验

带菌种子的制备：选取饱满的棉种于75%（体积分数）酒精中浸泡5 min进行表面消毒，无菌水冲洗5～6次，取出晾干后放入长满大丽轮枝菌的平板中，用无菌镊子拌匀，使棉种表面充分带菌，然后取出放入无菌血清瓶中，于漩涡振荡器上再次混匀，25℃培养箱中保存备用。

选用前述9种杀菌剂进行室内毒力测定。以丙酮溶解氟啶胺、异菌脲、苯醚甲环唑和嘧菌酯，以N-甲基吡咯烷酮溶解烯酰吗啉、福美双、噻呋酰胺、甲基硫菌灵和咯菌腈。从培养好的玉米粒上洗下大丽轮枝菌孢子，依次稀释10倍涂板，记录每培养基平板菌落数为50～100的稀释倍数，经试验选择稀释100倍的菌液进行后续试验。

1.10 数据分析

6.牛流行热。以3～5岁乳牛、黄牛易感性最大，经呼吸道感染和吸血昆虫的叮咬传播，具有明显的季节性，6～9月炎热雨季多发，呈周期性地方流行性或3～5年大流，死亡率低。

2 结果与分析

2.1 抑制棉花黄萎病菌的杀菌剂筛选

山西体育中心体育馆自竣工以来使用正常，运行良好。施工中新技术、新工艺、新材料、新机具的应用，符合节材、节能、提高质量、增进效益的原则，并能提高建筑施工企业的整体技术素质和施工生产能力，加速科技成果的转化，起到降低施工成本、减少浪费、保证工程质量、加快施工进度的作用。

2.2 各配方种衣剂对带菌种子的杀菌效果

4种配方的种衣剂对带菌种子具有不同杀菌效果（表2）。其中：4号配方杀菌效果最强，于包衣后24 h，其处理的带菌种子上的大丽轮枝菌就已被完全杀死；3号配方杀菌效果次之，在包衣后24 h，其处理的带菌种子上的大丽轮枝菌数量不足空白对照（CK）的0.1%；1号和2号配方杀菌效果相差不大，它们处理的带菌种子上的大丽轮枝菌数量不足CK的1%。因此，选择同时含有生防菌和2种杀菌剂的4号配方种衣剂为后续试验的种衣剂。

 

表1 9种不同杀菌剂（1 mg·L－1）与溶剂对大丽轮枝菌菌落生长的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of 9 chemical fungicides against colony growth ofV.dahliae

  

注：“/”表示无菌落；“+”表示菌落大小正常；“-”表示菌落小；“--”表示菌落更小。Note:“/”,“+” ,“-” and “--” mean colony size of none,normal,small and very small,respectively.

 

菌落抑制率Inhibitory effect/%氟啶胺Fluazinam / 0.0 100.00异菌脲Iprodione ＋ 69.0 22.47烯酰吗啉Dimethomorph ＋ 86.4 2.92嘧菌酯Azoxystrobin - 33.0 62.92苯醚甲环唑Difenoconazole -- 8.6 90.34福美双Thiram -- 3.4 96.18噻呋酰胺Thifluzamide ＋ 78.0 12.36甲基硫菌灵Thiophanate-Methyl ＋ 80.2 9.89咯菌腈Fludioxonil -- 6.3 92.92丙酮Acetone ＋ 86.6 2.70 N-甲基吡咯烷酮N-Methyl pyrrolidone ＋ 88.0 1.12空白对照CK ＋ 89.0 -药剂Fungicide 菌落大小Colony size每皿菌落数Colony number per plate

 

表2 不同种衣剂对棉种表面大丽轮枝菌的杀菌效果Table 2 The control effect of different seed-coaters onV.dahliaeof cotton seeds

  

控制效果Control effect/%1 3.6×103 99.22 2.5×103 99.48 2 2.2×103 99.52 1.9×103 99.60 3 3.3×102 99.93 1.3×102 99.97 4 0 100.00 0 100.00配方编号Compound number 24 h 48 h菌落含量Colony number/（cfu·g－1）控制效果Control effect/%菌落含量Colony number/（cfu·g－1）CK（未包衣 Uncoated） 4.6×105 4.8×105

2.3 生物复合悬浮种衣剂理化性质的测定

由4号配方生物复合悬浮种衣剂的各项理化指标测定结果（表3）可知，该种衣剂悬浮率较高，成膜时间短，包衣较均匀，不易脱落，各测定项均在国家标准[7-11]范围内；贮藏稳定性较好，热贮、冷贮前后各项指标仅有微小变化，且经过振摇很快恢复原状，包衣均匀度和脱落率不受影响。这说明该生物复合悬浮种衣剂符合国家标准，具有良好的贮藏稳定性。

 

表3 不同温度下4号配方生物复合种衣剂的各项理化指标Table 3 Characterization of the BCSA stored at different temperatures

  

注：“＋＋＋”表示极好。Note:“＋＋＋”means excellent.

 

贮存条件Conditions制剂悬浮率Suspensibility rate of the compound agents/%菌体悬浮率Suspensibility rate of LH-L3/%黏度Viscosity/(mPa·s)分散性Dispersibil ity常温Room temperature倾倒性Pourability粒径≤5 μm颗粒的比例Ratio of particle diameter less than ≤5 μm/%成膜时间Processing time/min包衣均匀度Coating uniformity/%脱落率Expulsion rate/%98.2 99.1 675 ＋＋＋ 优良Good热贮Elevated temperature 100.00 5 95 3.2 98.0 99.1 675 ＋＋＋ 优良Good冷贮Low temperature 99.34 5 95 3.3 98.0 99.0 680 ＋＋＋ 优良Good 99.15 5 95 3.3

2.4 标记菌株LH-L3-GFP和野生型菌株LHL3在种衣剂BCSA中的存活情况

由图1可知，2个菌株（标记菌株LH-L3-GFP和野生型菌株LH-L3）对种衣剂BCSA的耐受性均较好，即标记菌株的耐受性没有因为加入GFP标记而降低。贮藏6个月，2个菌株在BCSA中的菌量均保持在105cfu·mL－1左右，表明标记菌株在BCSA中可存活，且耐受性与野生型菌株相当。因此，标记菌株可代替野生型菌株进行种衣剂BCSA货架期的检测。

采用DPS 7.5软件对所测数据统计分析，用平均值和标准误表示测定结果，并做Duncan's多重比较，采用MS Excel 2003制图。

2.5 不同贮藏温度对种衣剂BCSA中菌量的影响

将BCSA置于室温、37℃、4℃贮藏环境中6个月，通过对菌量的检测发现温度对LH-L3-GFP菌株存活有一定影响，但各贮藏温度下BCSA中LH-L3-GFP菌量都随贮藏时间呈现缓慢下降的趋势（图2）。贮藏30 d，冷贮的BCSA中菌量比室温贮藏和热贮的菌量低1个数量级，但贮藏60～90 d，3个温度下BCSA中菌量基本相同，贮藏90 d以后，热贮和冷贮的BCSA中菌量均比室温贮藏低，至185 d时室温贮藏、热贮、冷贮BCSA中菌量分别为 1.1×105cfu·mL－1、4.2×104cfu·mL－1、2.8×104cfu·mL－1。 建议该种衣剂置于室温贮藏，并且每隔半年加入少量生防菌剂，使菌量保持在 107～108cfu·mL－1。

  

图1 常温下2个菌株在生物复合种衣剂BCSA中的存活情况Fig.1 Survival of tow bacterium strains in BCSA at the room temperature

  

图2 不同贮藏温度下LH-L3-GFP在种衣剂BCSA中的存活情况Fig.2 The survival rate of the bacterium LH-L3-GFP in BCSA at different storage temperatures

2.6 不同贮藏温度对包衣棉种表面LH-L3-GFP菌量的影响

结果（图3）显示：在室温和37℃贮藏 1个月，包衣棉种表面LH-L3-GFP菌量均出现上升趋势，且在37℃下菌量增加得多，之后菌量趋于平衡，一直维持在2×104cfu·g－1左右；4℃贮藏的包衣棉种表面菌量一直低于室温和37℃贮藏，但也维持在104cfu·g－1。至贮藏6个月时，室温、37℃和4℃贮藏的包衣棉种表面菌量分别为9.6×103cfu·g－1、7.8×103cfu·g－1、4.5×103cfu·g－1，下降了50%～80%。因此，包衣棉种贮藏于室温最佳，贮藏时间不宜超过半年。

  

图3 不同贮藏温度下LH-L3-GFP在BCSA包衣棉种表面的存活情况Fig.3 The bacterium LH-L3-GFP survival on surface of seeds coated by BCSA at different storage temperatures

2.7 种衣剂对棉花生长和黄萎病的防治效果

2.7.1 种衣剂对棉花生长的影响。棉种包衣处理后，播种于带黄萎病菌的土中，2.5%咯菌腈种衣剂（FSA）处理与裸种对照相比出苗率差别不大，出苗 2 d时，22.5%咯·福·克种衣剂 （CSA）和22.5%BCSA与对照相比出苗率分别提高9.10%、13.64%；至出苗15 d，各处理出苗情况已稳定，咯·福·克种衣剂和BCSA与对照相比出苗率分别提高 7.68%、11.54%，2.5%FSA、22.5%CSA和22.5%BCSA与对照相比，棉苗株高分别增加8.91%、－4.07%、18.74%，最大叶宽分别增加 15.82%、－5.36%、20.91%。 因此，22.5%BCSA对棉种出苗和棉苗生长有明显的促进作用。

2.7.2 种衣剂对棉花黄萎病的室内防治效果。从发病情况可看出，随发病时间的延长，各处理植株病情呈动态变化，但FSA处理的相对防效始终最差，CSA处理的相对防效呈现下降趋势，BCSA处理的相对防效出现升-降-升的变化趋势。发病2 d时，FSA、CSA和BCSA包衣处理与对照相比发病率分别降低19.80%、44.41%、65.42%，病情指数分别降低8.65%、69.69%、44.86%，此时CSA相对防效高于BCSA处理。发病5 d时，FSA、CSA和BCSA包衣处理与对照相比病情指数分别降低10.84%、51.45%、48.56%，此时CSA相对防效略高于BCSA处理。发病10 d时，CSA和BCSA处理发病情况和相对防效基本一致，但再过7 d，BCSA处理相对防效已明显超过CSA处理。因此，CSA和BCSA包衣处理对初期的黄萎病均有较好的防治效果，并且加有生防菌LH-L3的生物复合种衣剂相比纯化学种衣剂防病效果更佳。FSA的相对防效较低是因为其有效成分要低于CSA和BCSA。

 

表4 棉种的出苗率以及棉苗的株高和最大叶宽Table 4 Seed emergence rate,seedling height and maximum leaf width of cotton

  

注：①出苗后时间；②出苗后15 d时调查。FSA，2.5%咯菌腈种悬浮种衣剂；CSA，22.5%咯·福·克悬浮种衣剂；BCSA，22.5%咯·福·克生物复合悬浮种衣剂。同列小写字母不同者，差异显著（P＜0.05，Duncan's法）。Note:① Time after seed emergence;② Investigation results at 15 d after seed emergence.FSA,2.5%fludioxonil suspension seed coater;CSA：22.5%fludioxonil＋thiram＋carbofuran suspension seed coater;BCSA,Biological complex seed-coating agent,i.e,22.5%fludioxonil＋thiram＋carbofuran LH-L3 complex suspension seed coater.Different lowercase letters following the numerals in the same column show significant difference at the 0.05 probability level by Duncan's multiple range test.

 

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2.8 BCSA防治棉花叶部害虫效果初探

本试验于棉种出苗第2天观察到害虫，经观察鉴定该害虫为棉大卷叶螟（图5-A），但可能受环境及天敌的影响，出苗第6天时空白对照和包衣处理均已观察不到虫体。出苗第6天时，BCSA包衣处理的棉苗虫害明显降低，被害株率为13.64%，比空白对照降低66.92百分点；BCSA包衣处理棉苗每片叶上虫孔仅为5.52个，大幅低于空白对照的每片叶39.65个（图5），防治效果达到92.33%。因此，初步认为该种衣剂对棉大卷叶螟具有较好的防治效果。

  

图4 不同种衣剂包衣棉种幼苗的发病情况Fig.4 The disease incidence of seedling of coated cotton seeds with different agents

 

FSA：2.5%咯菌腈种悬浮种衣剂；CSA：22.5%咯·福·克悬浮种衣剂，BCSA：22.5%咯·福·克生物复合悬浮种衣剂；CK，裸种对照。FSA,2.5%fludioxonil suspension seed coater;CSA,22.5%fludioxonil＋thiram＋carbofuran suspension seed coater;BCSA,Biological complex seed-coating agent,i.e,22.5%fludioxonil＋thiram＋carbofuran LH-L3 complex suspension seed coater;CK,uncoated seed.

  

图5 棉大卷叶螟及其对棉苗的危害Fig.5 Sylepta derogataand its damage to cotton seedlings

3 讨论

传统的种衣剂已被广泛用于作物生产，但近年来人们日益意识到化学药物对环境的危害[14]。目前，内生细菌作为药学和农业上具有广泛应用前景的新资源，受到全世界的关注，尤其在微生物农药领域对其研究更为深入。由本实验室自主研制的含有菌株Y2（专利号：ZL 20031010-4195.6）的2%戊唑醇生物复合种衣剂，对水稻[15]、牧草[16]、玉米[4]等多种单子叶和豆科植物具有较好的促生长效果。但在研究适用作物范围时发现该种衣剂对油菜、棉花等部分双子叶作物存在明显抑制效果。因此，本试验以不能使用戊唑醇生物种衣剂的作物——棉花植株为分离材料，得到对棉花黄萎病有较强抑制效果的内生菌株，并利用该菌株研制出1种新型微生物复合种衣剂。

在研究种衣剂配方前，我们首先进行了抑制棉花黄萎病杀菌剂的筛选试验，在单纯微生物种衣剂效果不佳的情况下添加1种或2种杀菌剂辅助杀菌，在此考虑到成本和市场上已有的棉花种衣剂，选用福美双和咯菌腈进行试验。福美双是1种高效低毒的具有保护作用且抗菌广谱的硫代氨基甲酸酯类杀菌剂，化学名称为二硫化四甲基秋兰姆[17]。咯菌腈（适乐时）是1种新型的非内吸性苯基吡咯类杀菌剂，是假单胞菌属（Pseudomonasspp.）的不同种产生的次生代谢物硝吡咯菌素的类似物[18]，最大的特点是高效、低毒、低残留。目前，这2种杀菌剂均被广泛地应用于防治农业生产中的真菌性病害。市面上以它们为有效成分制成的悬浮种衣剂也很多，其中可用于棉种包衣的种衣剂如：400 g·L－1福美双·萎锈灵悬浮种衣剂对棉花苗期立枯病防治效果在85%左右[19]；20%福美双·甲基立枯磷悬浮种衣剂按质量比1∶40～1∶50包衣棉种，可以有效防治棉花苗期炭疽病和立枯病[20]；2.5%适乐时悬浮种衣剂在棉种播种前800～1 000 mL包衣100 kg种子，可以有效防止棉花苗期病害发生，其保苗率和相对防效均在80%以上[21]。因此，福美双和咯菌腈可以用于棉种包衣。

由于本实验室已有配制2%戊唑醇微生物复合种衣剂的基础，因此悬浮种衣剂中助剂的成分、比例以及制备方法均按照前人结果进行操作即可。在种衣剂有效成分的确定中，采用单一有效成分和分别复配的方法进行，确保种衣剂的杀菌效果，同时避免重复添加造成的浪费，杀菌剂均是按照市场上已有种衣剂的比例进行添加[22-24]。本试验中，只含生防菌或含生防菌与1种杀菌剂的种衣剂对种子表面黄萎病菌的杀菌效果均低于同时含生防菌、福美双和咯菌腈的种衣剂。因此，要达到较好的杀灭黄萎病菌效果必须同时添加这3种有效成分。此外，大部分作物在生长过程中很容易遭受虫害，因此，新研制的微生物复合种衣剂 （BCSA）中还加有10%的克百威。试验表明，该种衣剂对棉大卷叶螟有一定的防治效果，但对其他害虫的防治效果有待田间试验检验。

虽然芽孢杆菌能形成有较强耐受力的芽孢，但由于BCSA中含有福美双和咯菌腈2种杀菌剂，LH-L3菌株对这2种杀菌剂的耐受性尚不清楚，因此其存储期菌量的变化也是研究的重点。在不确定荧光标记菌株和野生型菌株在BCSA中耐受力差异的情况下，采用这2个菌种同时进行试验，结果发现2个菌株耐受性均较好，标记菌株与野生型菌株几乎无差异。室温贮藏6个月该种衣剂中菌量仍保持105cfu·mL－1，降低了2个数量级左右，稳定性较好。但若要保持该种衣剂杀菌效果，建议每隔半年适当加入少量生防菌剂，使其含菌量达到 107～108cfu·mL－1。

4 结论

LH-L3菌株与化学农药复配作为种衣剂完全可行，且本试验研制的生物复合种衣剂对棉花黄萎病和棉大卷叶螟有较好的防治效果。

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